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1.
目的 探讨siRNA(小干扰RNA)重组慢病毒介导的基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinase-2,MMP-2)基因沉默对喉鳞癌侵袭生长的抑制作用.方法 采用RNA干扰技术,将MMP-2基因siRNA的重组慢病毒(MMP-2-RNAi-Lentivirus)转染喉鳞癌Hep-2细胞,并运用蛋白印记法检测Hep-2细胞MMP-2基因的蛋白表达;通过博伊登(Boyden)侵袭小室观察MMP-2-RNAi-Lentivirus转染后喉癌细胞侵袭能力的变化.构建喉癌移植瘤裸鼠模型,瘤内注射MMP-2-RNAi-Lentivirns,观察抑瘤效果;透射电镜观察肿瘤形态;运用免疫组化方法检测移植瘤中增殖细胞核抗原的表达,以评估细胞增殖的情况.结果 MMP-2-RNAi-Lentivirus能高效地转染靶细胞,转染效率在90%以上.蛋白印迹法检测显示,转染后的Hep-2细胞中MMP-2蛋白表达阴性.侵袭实验显示,MMP-2-RNAi-Lentivirus转染后的实验组Hep-2细胞中穿过人工基底膜的平均细胞数(x±s,以下同)为(12±4)个,明显少于空载体对照组的(35±6)个(t=14.492,P<0.01).体内实验显示,MMP-2-RNAi-Lentivirus瘤内注射后,裸鼠移植瘤平均重量和平均体积均明显小于对照组,抑瘤率为44.2%.透射电镜观察到MMP-2-RNAi-Lentivims治疗组肿瘤细胞侵袭表型降低,治疗组肿瘤增殖细胞核抗原指数(49.588±6.995)也明显小于对照组(71.434±7.043,t=9.573,P<0.01).结论 siRNA重组慢病毒介导的MMP-2基因沉默能有效地抑制喉癌的侵袭、生长及增殖,为喉癌的基因治疗提供一定的实验依据. 相似文献
2.
目的 研究不同浓度血小板衍生因子-BB(PDGF-BB)对喉癌Hep2细胞增殖侵袭的影响及黏着斑激酶(FAK)、磷酸化黏着斑激酶397(FAKpY397)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)蛋白表达的变化。方法 不同浓度(0ng/mL、1ng/mL、20ng/mL、100ng/mL)PDGF-BB诱导人喉癌Hep2细胞株,western blot方法检测FAK、FAKpY397、MMP2、MMP9表达变化,MTT法检测细胞增殖,侵袭实验检测诱导后细胞侵袭能力的变化。结果 MTT示诱导后Hep2细胞增殖,在20ng/mL浓度时达到最高,为(0.488±0.133),与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。侵袭细胞数在各组均有增加,在20ng/mL组达高峰为(22.75±1.42),较对照组差异有统计学意义(P<0.05),FAK、FAKpY397、MMP9、MMP2在20ng/mL浓度时表达上调。结论 PDGF-BB上调Hep2细胞中FAK、FAKpY397、MMP9及MMP2表达,促进Hep2细胞增殖侵袭能力增强。 相似文献
3.
于锋黄鑫林颖周枫艾毛毛 《中国耳鼻咽喉头颈外科》2015,(7):329-333
目的应用siRNA干扰β-catenin基因在喉癌Hep-2细胞中的表达,探讨下调β-catenin基因后对喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。方法 RNA干扰技术干扰喉癌Hep-2细胞β-catenin基因的表达,实时荧光定量PCR和Western-blot方法进行干扰效果鉴定;采用MTT法检测细胞增殖能力、流式细胞仪AnnexinPI法检测细胞凋亡率、transwell法观察细胞的迁移侵袭能力。结果实时荧光定量PCR检测表明β-catenin-siRNA干扰组mRNA相对表达量较空白对照组下降达70%,Western blot结果显示干扰组β-catenin蛋白相对表达量为(0.545±0.111),较空白对照组(1.507±0.139)和阴性对照组(1.429±0.089)明显下降(F=21.859,P<0.05)。细胞增殖实验证实靶向干扰β-catenin表达导致喉癌细胞增殖明显受抑制。流式细胞仪AnnexinPI法检测说明,β-catenin-siRNA干扰组凋亡率(18.80±0.81)%与空白对照组(8.6±0.68)%和阴性对照组(9.03±0.26)%相比明显增加(F=253.93,P<0.01)。Transwell侵袭实验表明β-catenin-siRNA干扰组穿过Matrigel到达下室的平均细胞数较空白对照组和阴性对照组均明显减少(F=136.20,P<0.01)。结论干扰β-catenin基因在喉癌Hep-2中的表达可抑制喉癌Hep-2细胞的增殖和侵袭能力,促进喉癌Hep-2细胞的凋亡。 相似文献
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目的 探讨Jab1重组质粒对人喉鳞状细胞癌(简称鳞癌)Hep-2细胞裸鼠移植瘤生长的影响.方法 利用喉鳞癌Hep-2细胞裸鼠皮下移植瘤模型,通过向瘤体内注射pJab1、阴性对照质粒和生理盐水,观察瘤体增长情况,通过免疫组化方法、反转录聚合酶链反应( RT-PCR)观察瘤体内Jab1、p27的mRNA及蛋白表达水平的变化.结果 pJab1质粒组的肿瘤体积为(267.60±88.19)mm3((x)±s,以下同),与阴性对照组的(832.20±140.39) mm3及生理盐水组的( 895.40±145.93) mm3相比,差异有统计学意义(F=36.73,P<0.001);免疫组化结果显示pJab1质粒组瘤内的Jab1蛋白的表达率降低为32.40%±5.59%,p27蛋白的表达率增高到76.80%±6.30%(P<0.001),与阴性对照组及生理盐水组比较,差异有统计学意义;RT-PCR结果显示实验组瘤内Jab1的mRNA相对表达水平降低至0.65±0.03(F=558.00,P<0.001),p27的mRNA无明显变化,为0.80±0.02(F=1.52,P>0.05).结论 pJab1干扰质粒可明显降低裸鼠肿瘤组织内Jab1基因的表达并抑制瘤体的生长;pJab1质粒能有效抑制Jab1基因的表达,有望成为临床治疗喉癌的新途径. 相似文献
5.
目的 前期研究显示T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam1)与喉癌临床预后密切相关。为了进一步明确Tiam1对喉癌生物学行为的影响,通过上调Tiam1在喉癌细胞中的表达,观察Tiam1上调后对喉癌细胞体内外增殖和侵袭转移能力的影响。方法 通过质粒转染构建Tiam1稳定过表达的喉癌Hep-2细胞(Hep-2/Tiam1);本实验以pcDNA3(Mock)质粒作为转染对照。实验共分3组:空白对照组(Hep-2),转染pcDNA3(Mock)的Hep-2细胞株(Hep-2/Mock)和稳定转染Tiam1基因的Hep-2细胞株(Hep-2/Tiam1)。通过MTT、划痕实验及Transwell侵袭实验观察Tiam1过表达后对Hep-2细胞体外增殖、迁移及侵袭能力的影响。通过构建喉癌裸鼠移植瘤动物模型,进一步在体内水平观察Tiam1对喉癌的增殖及侵袭转移能力的影响。结果 MTT实验显示Hep-2/Tiam1与对照组Hep-2及转染空载体的Hep-2比较,各组之间细胞的增殖能力无明显差异(P>0.05)。划痕实验显示Hep-2/Tiam1细胞的迁移距离明显多于另两组(P<0.05)。Tr... 相似文献
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目的 采用RNA干扰(RNAi)技术抑制人喉癌Hep-2细胞c-Met基因表达,观察对其体外生物学活性和体内生长的影响.方法 构建能够表达针对c-Met的小干扰RNA的RNAi质粒和表达不针对任何已知mRNA的siRNA的阴性对照RNAi质粒,采用阳离子脂质体Lipofectamine2000作为转染试剂将其转染人喉癌细胞株Hep-2,通过RT-PCR及Western Blot方法检测转染效率,筛选出抑制效果最好的c-Met-siRNA序列;通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、运动实验及侵袭实验比较转染前后细胞的生长、运动及侵袭能力.在裸鼠喉癌皮下荷瘤模型模拟c-Met-siRNA基因治疗实验中,采用Western Blot法检测重组质粒对c-Met基因及MMP-9、VEGF基因表达的影响.结果 pSilencer2.0/c-Met-shRNA转染人喉癌细胞株Hep-2后,c-Met的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P值分别为0.003和0.02),细胞的生长、运动及侵袭均受到明显抑制(P值分别为0.001,0.004和0.004).肿瘤接种到裸鼠后第35天,重组质粒组肿瘤体积为(138±27)mm~3,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);重组质粒组瘤体内c-Met、MMP-9、VEGF基因表达率比对照组明显降低(P<0.05).结论 c-Met-siRNA能成功下调靶基因的表达,并能显著抑制喉癌Hep-2细胞的生长、运动、侵袭及移植裸鼠成瘤后的生长,siRNA表达质粒介导的基因治疗有希望成为喉癌靶向性c-Met治疗的新策略. 相似文献
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目的 通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默喉癌He p - 2 细胞上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)的表达,探讨E-cadherin对Hep-2细胞增殖能力的影响。方法 设计、合成特异性小干扰RNA(siRNA)和无基因沉默功能的阴性siRNA转染Hep-2细胞,获得下调E-cadherin基因表达的体外培养的Hep-2细胞;荧光定量PCR检测E-cadherin基因的沉默效果;体外细胞增殖实验(MTT)检测Hep-2细胞体外增殖能力的变化。结果 ①重组质粒和脂质体质量体积按1:1转染时,转染效率最高组siRNA-3达65%。②荧光定量PCR:重组质粒pRNAT-U6.1/Neo-siRNA1、pRNAT-U6.1/Neo-siRNA2、pRNAT-U6.1/Neo-siRNA3使E-cadherin mRNA的表达下调。以空白对照组为基准(设为1),E-cadherin相对于β-actin的改变倍数siRNA-1组=0.00092,siRNA-2组=0.00143,siRNA-3组=0.00045,阴性对照组=3.44898,差异有统计学意义。③MTT:经特异性siRNA处理的Hep-2细胞生长速度较对照组增快,差异有统计学意义。结论 有效抑制Hep-2细胞E-cadherin mRNA的表达使Hep-2细胞的增殖能力增强。 相似文献
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目的探讨编码位于常染色体上的碱性螺旋-环-螺旋转录因子(Twist),在Hep-2细胞中的高表达对上皮细胞标记物——上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、间充质细胞标记物——神经钙黏蛋白(N-cadherin)及Hep-2细胞的侵袭能力的影响。方法以人喉癌细胞系Hep-2为实验材料,将构建好的pcDNA3.1-Twist质粒利用脂质体2000转染于Hep-2细胞,利用Western-blotting方法检测转染pcDNA3.1-Twist的细胞中Twist、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达情况;采用倒置相差显微镜观察转染pcDNA3.1-Twist后细胞的形态学变化;利用细胞侵袭实验,检测Twist的高表达对Hep-2细胞侵袭能力的影响。结果Western-blotting检测发现转染pcDNA3.1-Twist的实验组细胞中Twist和N-cadherin的表达均上升,E-cadherin的表达下降,与对照组比较差异具有统计学意义(P〈0.05);倒置相差显微镜发现细胞形态由转染前的多角型、椭圆型变为运动能力更强的细长、梭型;检测高表达TWIST的Hep-2细胞的侵袭能力,发现转染TWIST实验组的穿过膜的细胞数为85.33±6.66,明显高于pcDNA3.1组及对照组穿过膜的细胞数为29.33±10.70和32.00±3.61,差异具有统计学意义(F=52.32,P〈0.05)。结论Twist能诱导Hep-2细胞上皮间充质转化现象的产生,提高Hep-2细胞的侵袭能力,可能通过调控E-cadherin和N-cadherin发挥作用。 相似文献
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目的 探讨沉默survivin对喉癌细胞Hep-2生长的影响.方法 将重组质粒(psi-survivin)和阴性对照质粒(psi-scramble)用脂质体包裹转染人喉癌细胞株Hep-2,分别用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)从mRNA和蛋白水平检测survivin的表达.四甲基偶氮唑蓝(MTT)观察喉癌细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡.建立裸鼠喉癌移植瘤模型,将psi-survivin和psi-scramble注射于肿瘤周围,观察其抗肿瘤的效果.免疫组化法和Western blot法检测重组质粒对肿瘤Survivin蛋白表达的影响.末端脱氧核苷酸转移酶介导的d-UTP缺口末端标记技术(Tunel)观察肿瘤细胞的凋亡.结果 psi-survivin不仅在mRNA水平(抑制率为54.4%),而且蛋白水平也抑制Survivin表达,抑制率为37.0%.MTT证实psi-survivin明显抑制喉癌细胞的增殖,抑制率达71.7%.流式细胞仪结果显示psi-survivin组细胞凋亡明显增加,凋亡率达(13.05±0.56)%((-x)±s,下同).体内实验表明,质粒注射后第32天,盐水组瘤体积为(1443.9±230.5)mm3,psi-scramble组为(1348.5±198.4)Rim3,而psi-survivin组为(624.6±188.4)mm3,与对照组相比,差异有统计学意义(t=-5.917,P<0.01).psi-survivin能明显抑制肿瘤survivin的表达,抑制率为41.8%,与对照组相比,差异有统计学意义(t=-80.343,P<0.01).Tunel染色结果显示psi-survivin组肿瘤组织中出现较多凋亡细胞,而对照组未见凋亡细胞.结论 沉默survivin能明显抑制喉癌细胞Hep-2的生长. 相似文献
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目的 探讨RNA干扰(RNAi)对喉癌细胞基质金属蛋白酶-9基因(MMP-9)表达活性的抑制作用及其与瘤细胞增殖和侵袭潜能的相关性.方法 于MMP-9基因编码区选择1对目标序列(A组)及1对非特异性序列(B组)构建小分子干扰RNA(siRNA)表达元件,转染Hep-2喉癌细胞,以未转染的母代细胞作为对照组(C组),RT-PCR法检测MMP-9 mRNA转录活性,蛋白印迹法检测MMP-9蛋白表达活性,细胞侵袭重建基底膜实验检测细胞体外侵袭潜能.结果 A、B、C组细胞MMP-9mRNA相对表达水平分别为0.51±0.05、0.87±0.09、0.89±0.07,MMP-9蛋白相对表达水平分别为0.29±0.07、0.595±0.11、0.61±0.10,A组的相对表达水平均明显下降(P<0.05);A、B组细胞侵袭抑制率分别为48.0%和11.5%,组间差异有统计学意义(P<0.05),但细胞增值活性却无明显变化(P>0.05).结论 Hep-2喉癌细胞中存在RNAi现象,MMP-9 siRNA特异性抑制MMP-9基因表达,伴随以细胞侵袭潜能明显减弱. 相似文献
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目的 观察c-myc小干扰RNA(siRNA)联合氟尿嘧啶(5-Fu)抑制喉癌Hep-2细胞生长的体内外作用,探讨在喉癌治疗中将c-myc作为基因治疗靶点的价值.方法 利用RNA干扰技术将c-myc siRNA转染到喉癌Hep-2细胞中,Western blot法检测c-myc蛋白的表达,流式细胞仪检测c-myc siRNA与5-Fu单独或联合应用,对喉癌细胞周期的影响.构建裸鼠移植瘤模型,观察c-myc siRNA及联合5-Fu对肿瘤生长的影响.免疫组织化学法检测c-myc在肿瘤组织中的表达;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)检测肿瘤组织细胞的凋亡情况.结果 在转染c-myc siRNA后的喉痛Hep-2细胞中,c-myc 蛋白的表达水平逐渐下调;G0-G1期的细胞开始增加,同时S期的细胞逐渐减少;当转染c-myc siRNA 细胞联合使用5-Fu时,G0-G1期的细胞明显增加,为(79.3.±2.1)%,同时S期的细胞减少为(17.5±1.7)%.c-myc siRNA联合5-Fu组移植瘤生长最慢,与c-myc siRNA组和5-Fu组相比差异有统计学意义(t值分别为44.170和78.988,P<0.05);c-myc siRNA+5-Fu组治疗的移植瘤重量明显小于对照组,也小于c-myc siRNA组和5-Fu组(P值均<0.05).免疫组织化学结果显示,c-myc siRNA及其联合5-Fu组肿瘤组织中c-myc蛋白的表达下调,肿瘤细胞的凋亡数明显增加高于单用5-Fu组(t=-17.871,P<0.05).结论 c-myc siRNA可特异性地下调Hep-2细胞和裸鼠组织中c-myc的表达,联合5-Fu时,可显著抑制喉癌移植瘤的生长,促进肿瘤细胞的凋亡,表明c-myc可能是喉癌基因治疗中一个重要的分子靶点.Abstract: Objective To observe the effects of small interfere RNA (siRNA) targeting the c-myc in combination with 5-fluorouracil (5-Fu) on the growth of Hep-2 cells in vitro and in vivo.Methods Hep-2 cells transfected with or without c-myc siRNA were treated with 5-Fu for 48 h.C-myc protein levels in Hep-2 cells were detected using the Western blot.The cell cycle was analyzed by flow cytometry.Hep-2 cells were subcutaneously inoculated into the back of BALB/c nude mice to establish the implanted laryngeal squamous carcinoma model.PBS,c-myc siRNA,and 5-Fu,alone or in combinations were administered i.p.The mice were sacrificed after the treatments and the tumor masses were removed to determine the tumor volume and weight.The inhibitory rate was calculated.Expression of c-myc in tumor tissue was detected by immunocytochemistry and cell apoptosis was analyzed by terminal transferase dUTP nick end labeling (TUNEL).Results The protein levels of c-myc decreased after transfected with c-myc siRNA.C-myc siRNA-transfected cells showed an increase in the percentage of cells in the G0-G1 phase and a decrease in the percentage of cells in the S phase.When combined with 5-Fu,the results were improved.The tumor growth was faster in the control group and was significantly slower in the c-myc siRNA plus 5-Fu group than that in the c-myc siRNA group or 5-Fu group ( P <0.05 ) .The tumor weight in the c-myc siRNA plus 5-Fu group was significantly smaller than that in the c-myc siRNA or 5-Fu group ( P < 0.05 ).Immunohistochemistry showed that c-myc siRNA inhibited the expression of c-myc in tumor tissues in the c-myc siRNA group and c-myc siRNA plus 5-Fu group (P <0.05).The number of apoptotic cells in the c-myc siRNA plus 5-Fu group was higher than those in the c-myc siRNA groups (P <0.05).Conclusions C-myc siRNA inhibits the expression of c-myc in Hep-2 cells and in the tumor tissues of nude mice.C-myc siRNA combined with 5-Fu inhibits the growth of implanted laryngeal squamous carcinoma and promotes cell apoptosis.C-myc could become a novel target for the treatment of laryngeal squamous carcinoma. 相似文献
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目的 探讨RNA干扰(RNAi)抑制喉癌Hep-2细胞DJ-1基因的表达及观察其细胞效应.方法 设计合成3对特异性针对人DJ-1基因的小干扰RNA(siRNA),脂质体法转染Hep-2细胞,实验分为4组:瞬时转染非特异性siRNA对照组及转染特异性siRNA 3组(siRNA1、siRNA2、siRNA3).采用RT-PCR检测DJ-1 mRNA,蛋白免疫印迹法检测DJ-1蛋白,流式细胞仪检测细胞凋亡及四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测特异性siRNA1组对Hep-2细胞效应.结果 本实验设计合成的3对特异性siRNA均不同程度地抑制DJ-1基因表达,其中特异性siRNA1组抑制效果最佳.M1Tr比色法结果显示特异性siRNAl组(终浓度50 nmo~L、100 nmolZL)对Hep-2细胞增殖具有抑制作用.流式细胞仪检测结果最示特异性siRNA1组能诱导Hep-2细胞凋亡,转染特异性siRNA1组凋亡率为(15.7±4.8)%,非特异性siRNA对照组凋亡率为(4.5±0.4)%,非特异性siRNA对照组与特异性siRNA1组凋亡率比较差异有统计学意义(t=4.736,P<0.01).结论 转染特异性siRNA组能有效抑制Hep-2细胞增殖,诱导Hep-2细胞凋亡. 相似文献
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目的建立稳定表达siRNA-STAT3基因的Hep-2细胞系,为进一步探讨STAT3在喉癌中的作用机制提供基础。方法产生针对STAT3的小发卡状RNA寡核苷酸,连接到PGPU6/GFP/Neo载体,双酶切和质粒测序鉴定真核表达质粒PGPU6/GFP/Neo-siRNA-STAT3,G418筛选稳定转染细胞系,蛋白印迹法测定p-STAT3的表达。分别用MTT法绘制生长曲线和平板克隆形成实验测定单细胞增殖能力。结果构建了重组干扰质粒并筛选出了阳性克隆,蛋白印迹法鉴定STAT3被抑制后p-STAT3表达也明显下降。生长曲线显示siRNA-STAT3组3天后抑制效应才较为明显(P=0.001),5d后抑制效应更加突出(P=0.000),其抑制效应呈时间-效应关系。另外,siRNA-STAT3组单克隆形成率也明显低于对照组(P=0.000)。结论本研究筛选了可稳定、较高水平表达siRNA-STAT3的Hep-2细胞系。干扰STAT3表达对细胞增殖抑制的作用较为明显。 相似文献
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目的探讨p27基因对喉癌Hep-2细胞系生长的抑制作用,为喉癌发生机制的研究和基因治疗提供理论依据。方法采用基因转染技术,将p27cDNA转染到喉癌Hep-2细胞系中,了解其对细胞增殖能力及细胞周期的影响。结果转染p27基因的喉癌细胞生长受到抑制,其在软琼脂上克隆形成能力降低了大约4倍。对细胞周期分析表明,处在G0~G1期的细胞由32.2%增加到66.9%,经Dotblot、Western blot杂交和免疫组化证实,p27mRNA表达有明显差异(P〈0.01),p27的蛋白表达量有明显差异(P〈0.01),说明p27蛋白具有生长抑制功能,其作用点为G1~S期。结论提高喉癌细胞中p27的表达,能抑制肿瘤细胞的生长,导入p27基因是一种治疗喉癌的新途径。 相似文献
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