腺病毒表达载体对骨髓间充质干细胞分化能力的影响

目的 研究腺病毒感染骨髓间充质干细胞(MSC)对MSC分化潜能的影响.方法 利用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒感染传至3代的人MSC,分别在感染后第2、4、8和16天收集细胞,提取总RNA,利用RT-PCR检测感染前后MSC中内胚层标志基因CYP51、中胚层标志基因SM22α、外胚层标志基因槽蛋白(nestin)、多分化潜能标志基因OCT4和可变剪切因子基因nPTB的表达.在腺病毒感染MSC 7 d后,利用成脂肪诱导剂继续诱导培养14 d,用油红O染色观察MSC向脂肪细胞分化情况.结果 RT-PCR检测显示,MSC中CYP51、SM22α、nestin、OCT4和nPTB在腺病毒感染后2、4、8和16 d时仍有表达.腺病毒感染7 d后的MSC仍可向脂肪细胞分化,且分化效率同正常MSC一致.结论 腺病毒载体感染MSC后,不会影响MSC的分化能力,可以作为MSC诱导分化机制研究的基因表达载体.     

大鼠EPO真核表达载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的 构建表达大鼠促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)的真核表达质粒pEGFP-NI/EPO,并检测其在体外的表达.方法 从大鼠肾脏获得EPO基因片段并用RT-PCR方法 扩增,将其连接于真核表达质粒pEGFP-NI,测序鉴定后,用脂质体包裹转染大鼠骨髓问充质干细胞(mesenchymal stem cels,MSCs),采用免疫组化和RT-PCR检测EPO的表达.结果 经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染大鼠MSCs细胞后可表达EPO蛋白.结论 成功构建的pEGFP-NI/EPO重组质粒能在体外表达EPO蛋白.     

c-met慢病毒载体的构建及稳定转染骨髓间充质干细胞

构建肝细胞生长因子受体(c-met)慢病毒载体,并稳定转染骨髓间充质干细胞(BMSCs).将c-met连接到慢病毒载体GV358上,重组获得慢病毒载体GV358-c-met.再将该重组体与病毒辅助质粒共转染293T细胞,包装生产慢病毒并测定其滴度为2×108 TU/ml.将此慢病毒转染BMSCs,经嘌呤霉素筛药后,荧光显微镜下检测荧光阳性率达100%,且Western blot证实该细胞株表达c-met蛋白.成功构建了c-met慢病毒载体,并建立了稳定表达c-met的BMSCs.     

人羊膜间充质干细胞与骨髓间充质干细胞对外周血淋巴细胞的免疫调节作用比较

目的 比较人羊膜间充质干细胞(hAMSC)与骨髓间充质干细胞(hBMSC)对异体外周血淋巴细胞的免疫调节功能,为临床应用hAMSC治疗移植物抗宿主病提供实验依据.方法 通过酶消化法和Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分别分离出人羊膜间充质干细胞和骨髓间充质干细胞,体外扩增培养间充质干细胞(MSC),获取第4代细胞,建立MSC与经植物血凝素(PHA)刺激的异体人外周血单个核细胞(PBMC)共培养体系,采用流式细胞术分析比较两种不同共培养体系中T淋巴细胞亚群的变化情况,采用ELISA法比较两种MSC共培养体系中细胞因子白介素2(IL-2)及白介素10(IL-10)的分泌水平.结果 (1)hAMSC+PBMC+PHA、hBMSC+PBMC+PHA共培养组Treg、Th2、Tc2细胞亚群的比例均较PBMC+PHA组明显上升(P<0.05),Th1、Tc1细胞亚群的比例均较PBMC+PHA组明显下降(P<0.05),且hAMSC+PBMC+PHA、hBMSC+PBMC+PHA共培养组T细胞亚群的变化差异无统计学意义(P>0.05);(2)ELISA结果提示,与PBMC+PHA组相比,hAMSC+PBMC+PHA、hBMSC+PHA+PBMC共培养组上清液中IL-2的水平均明显下降(P<0.05),hAMSC+PBMC+PHA、hBMSC+PHA+PBMC共培养组上清液中IL-10水平均明显上升(P<0.05),hAMSC+PBMC+PHA、hBMSC+PBMC+PHA共培养组上清液中IL-2、IL-10含量的变化无统计学差异(P>0.05).结论 hAMSC、hBMSC对外周血淋巴细胞具有相似的免疫调节功能,提示hAMSC可能为移植物抗宿主病的预防和治疗提供一种新的选择.     

人胎盘来源间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征比较

目的:从人足月的胎盘羊膜中和Wistar 大鼠股骨及胫骨骨髓中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,研究人胎盘来源MSCs（HPMSCs）和大鼠骨髓来源MSCs（BMSCs）的分离培养方法和生物学特征、表面标志及其多分化潜能。方法:将人足月胎盘组织通过胶原酶Ⅱ消化培养获取HPMSCs,采用全骨髓贴壁法从4周龄Wistar大鼠双侧股骨及胫骨中分离、纯化大鼠BMSCs,运用活细胞计数法检测其增殖能力,采用流式细胞术检测2种细胞表面标志物的表阳性率;
用地塞米松、维生素C和β磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,用茜素红染色鉴定;用胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,以油红O染色鉴定。结果:HPMSCs为梭形贴壁细胞,增殖能力较强,CD44和CD34表达阳性率分别为94.45%和1.67%;BMSCs为圆形、梭形和多角形,增殖能力强,CD44和CD34表达阳性率分别为93.11%和2.68%。2种细胞经过成脂诱导液和成骨诱导液诱导后,茜素红和油红O染色结果均为阳性,表明2种细胞均可向脂肪细胞和成骨细胞分化。结论:HPMSCs与大鼠BMSCs的生物学特征相似,同样具有多分化潜能,HPMSCs具有更强的增殖能力。     

pEGFP-C1-PEX真核表达载体的构建及其在大鼠骨髓间质干细胞中的表达

目的构建pEGFP-C1-PEX真核表达载体并转染大鼠骨髓间质干细胞(MSCs),观察其在MSCs内的表达。方法用RT-PCR法从大鼠C6胶质瘤细胞中扩增出带有XhoI、BamHI酶切位点的PEX基因片段,将PEX基因片段克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因真核表达载体pEG-FP-C1上,通过脂质体将pEGFP-C1-PEX转染入大鼠MSCs。结果pEGFP-C1-PEX真核表达载体构建成功,荧光显微镜下观察,pEGFP-C1-PEX表达载体转染到MSCs24h后可见PEX融合蛋白表达。结论pEGFP-C1-PEX真核表达载体能够在大鼠MSCs中表达PEX融合蛋白。     

Biological features of mesenchymal stem cells from human bone marrow

Objective To study the biological characteristics of mesenchymal stem cells (MSCs) from human bone marrow. Methods A culture of mesenchymal stem cells was initiated from bone marrow low-density mononuclear cells separated by Percoll Centrifugation and maintained in low-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) with 10% selected fetal calf serum. Cell growth pattern and its responses to cytokines were evaluated by trypan blue exclusion and MTT test, respectively. Cell cycle and surface antigenic features were analyzed by flow cytometry technique. Cytochemistry characteristics of MSCs were determined.Results Easy-handling methods to isolate and culture expand MSCs were developed in this study. MSCs were unique in their phenotypes. They were positive for CD29, CD44, CD166, and negative for CD34, CD45, HLA-DR and Ulex europaeus. Cytochemistry evaluation showed that MSCs were homogeneously positive for acid α-naphthl acetate esterase (ANAE), glycogen (periodic acid Schiff reaction, PAS), and negative for acid phosphatase (ACP) and the Sudan black reaction (SB). Around 5% of them were positive for alkaline phosphatase (ALP). The cells had a population doubling time of 30 hours and cell cycle analysis showed that approximately 10% of them were in S phase. MSCs grew at significantly different rates when incubated in the presence of various recombinant human cytokines, of which interferon γ, tumor necrosis factor α, stem cell factor and insulin-like growth factor promoted the proliferation of MSCs dramatically, while others tested had no effects on cell growth. Conclusions MSCs are a homogenous population of cells that have unique growth, phenotypical and cytochemical characteristics. Furthermore, the diverse responses of MSCs to different cytokines provide a clue for the selection of optimal expansion and maintenance of MSCs.     

IL-10基因修饰对骨髓间充质干细胞体外免疫效应的影响

目的：研究IL-10基因修饰的骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）体外免疫效应。方法:RT-PCR克隆大鼠IL-10基因并构建逆转录病毒pLNCX-IL-10,转染大鼠BM-MSCs;流式细胞术检测IL-10基因修饰的BM-MSCs（BM-MSCsIL-10）体外对T淋巴细胞亚群的影响,CCK-8法检测BM-MSCsIL-10及其培养上清液对体外混合淋巴细胞增殖的影响。结果:BM-MSCsIL-10能明显减少CD4 T,降低CD4 /CD8 比值,比BM-MSCs作用明显（P<0.05）;BM-MSCsIL-10及其培养上清液比BM-MSCs更能明显抑制T淋巴细胞增殖反应（P<0.05）。结论:IL-10基因修饰能增强BM-MSCs的体外免疫抑制作用。     

重组腺相关病毒载体介导的绿色荧光蛋白在急性髓性白血病患者骨髓间充质干细胞中的表达

目的 探讨重组腺相关病毒载体(rAAV-2-eGFP)是否可高效转导入骨髓间充质干细胞(BMSCs)。方法 从初发的急性髓性白血病(AML)患者骨髓中分离培养出BMSCs,在不同的感染复数(MOI =102, 103, 104, 105, 106,107)下用包含增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的rAAV-2-eGFP感染BMSCs,寻找最佳的感染条件,并在转染后的不同时间点用倒置荧光显微镜以及流式细胞仪观察其表达情况。结果 转染后10~14 d, eGFP在BMSCs中表达,转染效率为0.3%~2%,增加MOI亦不能明显增加转染效率。在MOI=105的条件下转染后观察了61 d, eGFP保持低水平长期稳定表达,在转染后的12~ 33 d,eGFP阳性的BMSCs从起始时的1.16%下降到(0.5~0.6)%,33~61 d一直维持在这一水平。结论 rAAV-2-eGFP和BMSCs可用于体外基因治疗,但极低的转染效率可能是其进一步应用的障碍。     

骨髓间充质干细胞的免疫调节活性

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种多潜能的非造血干细胞,可以向多系分化,如骨、脂肪和软骨,并优先归巢于损伤组织,有利于组织修复。体外研究显示它们不诱导免疫应答,对识别、清除同种异体抗原的免疫细胞具有抑制作用。在动物实验中,骨髓间充质干细胞可以诱导外周免疫耐受并向损伤处迁移,抑制致炎细胞因子的释放,促进损伤组织修复。这种独特作用说明它们在细胞治疗和自身免疫性疾病治疗中发挥了积极作用。     

deltex-1腺病毒载体的构建及其在大鼠bMSCs中的表达

目的构建deltex-1基因腺病毒载体并研究其在大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,bMSCs)中的表达。方法采用高保真酶PCR扩增deltex-1基因并测序,亚克隆至pAdTrack-CMV腺病毒穿梭载体后在BJ5183细菌中进行重组,挑选正确的重组子在FT293细胞中包装成病毒。以CsCl2方法纯化病毒,并进行滴度测定。将目的基因病毒感染bMSCs细胞后收集总RNA及蛋白,用PCR及Western blot方法检测目的基因表达水平。结果①成功扩增了大小为1 883 bp的大鼠deltex-1,并成功构建了大小为4.5 kb的同源重组腺病毒穿梭载体,滴度为1.23×1011 IU/ml;②对培养的大鼠bMSCs进行流式检测,结果为CD90、CD44阳性表达,分别为99.57%和85.66%,而CD45表达阴性,阳性率为0.35%;③荧光显微镜观察deltex-1转染效率为60%～70%,RT-PCR及Western blot检测结果显示转染后deltex-1表达明显增强,说明转染成功。结论成功构建deltex-1基因腺病毒载体并能在bMSCs中高表达。     

人肝细胞生长因子基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的:构建人肝细胞生长因子(HGF)基因慢病毒载体pNL-HGF-增强绿色荧光蛋白(EGFP)并转染骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测HGF基因在BMSCs中的表达.方法:采用基因重组技术,利用限制性内切酶酶切获取HGF基因序列并克隆到慢病毒载体pNL-EGFP上,构建重组慢病毒质粒pNL-HGF-EGFP;将慢病毒...     

VCAM-1和EGFP双基因共表达重组腺病毒的构建

目的 构建VCAM-1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因VCAM-1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒;在BJ5183细胞中与pAdeasy-l质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体.结果 (1)VCAM-1基因与pAdTrack-CMV载体成功连接,经NotⅠ/XhoⅠ双酶切后电泳可见2个大小约为9kb和2kb左右条带,经PCR法扩增后电泳可见一个600bp左右条带,证明pAdTrack-CMV-VCAM-1重组质粒构建成功;(2)pAdTrack-CMV-VCAM-1质粒与pAdeasy-l质粒同源重组后,产物经PacⅠ酶切后电泳可观察到2个大小约为31kb和4kb左右条带,与预期结果相符.结论 Ad-VCAM-1-EGFP重组腺病毒载体构建成功.     

大鼠骨髓间质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的建立大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)最佳的体外分离培养方法,并研究其基本的生物学特性。方法采用密度梯度离心和贴壁培养两种方法分离大鼠的MSCs,进行形态学观察及增殖生长方面的测定;免疫细胞化学染色鉴定表面标志。结果大鼠MSCs体外培养呈梭形;细胞生长曲线为“S”型;密度梯度离心法原代培养15d达到80%～90%的融合,而改良的直接贴壁法只需要5d;细胞周期显示G0/G1期88.29%;免疫细胞化学染色显示CD44表达阳性,CD34、CD45为阴性。结论两种方法均可获得骨髓间质干细胞,但贴壁培养法操作更简便、快速,具有对细胞活性影响较小,更利于其贴壁和增殖的优点。MSCs体外培养条件下生长性状稳定,适于做组织工程的种子细胞。     

绿色荧光蛋白基因腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

[摘要] 目的：研究腺病毒载体绿色荧光蛋白基因（Ad-GFP）在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCc)转染和表达的量效关系及对细胞生物学特性的影响,探讨用该载体构建基因修饰BMSCc的可行性。方法：在体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞免疫表型,293细胞包装制备病毒,以不同滴度的Ad-GFP(1×103-1×1010 PFU/ml)转染BMSCc,细胞计数法分析转染率,倒置显微镜观察细胞形态学改变,CCK8法检测细胞增殖活性,用血清撤离加入β- 巯基乙醇诱导感染Ad-GFP的BMSCc向神经样细胞定向分化。结果：3-6代BMSCc表面标志CD34、CD45阴性而CD29、CD44阳性,当病毒滴度为1×107PFU/ml时感染率为55%,为1×109及1×1010PFU/ml感染率均为85%,但1×1010PFU/ml时出现细胞病理现象,7d荧光表达最强,28d 仍可见荧光表达,感染Ad-GFP的BMSCc经β- 巯基乙醇诱导可分化为神经元样细胞,神经元特异性烯醇化酶（NSE）阳性。结论：合适滴度的Ad-GFP可以高效感染BMSCc,对细胞的生物学特性影响较小不影响诱导分化功能,BMSCc可以作为Ad-GFP载体系统进行基因治疗的种子细胞。     

hsa-miR-654-5p通过抑制骨形态发生蛋白2调控人骨髓基质干细胞成骨分化

目的明确萎缩性骨不连组织水平表达上调的hsa-miR-654-5p在人骨髓基质干细胞(hBMSCs)中对其预测靶基因骨形态发生蛋白2(BMP2)mRNA和蛋白的抑制作用,探索其在成骨分化过程中的生物学调控功能。方法分离培养hBMSCs,将第4代hBMSCs培养16 h后分别按相应体系转染细胞,再培养48 h后取六孔板内细胞提取总RNA和总蛋白,进行实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blotting,取24孔板内细胞进行双荧光素酶报告基因检测。结果当hBMSCs中hsa-miR-654-5p过表达时,BMP2的mRNA和蛋白表达水平均发生明显下调;双荧光素酶报告基因检测提示,BMP2的预测靶位点直接受hsa-miR-654-5p的抑制调控,该靶位点被突变后hsa-miR-654-5p对BMP2的抑制作用消失。结论 hsa-miR-654-5p可通过作用于BMP2的特定靶位点而直接抑制BMP2的mRNA和蛋白表达。hsa-miR-654-5p的变化在成骨分化调控过程中具有重要作用。     

人骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

目的:探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)体外分离培养及鉴定。方法:成人骨髓取自手术中非血液系统疾病、非肿瘤及乙肝表面抗原阴性患者摘取的肋骨,采用贴壁筛选法进行体外扩增;用免疫组织化学法对培养的细胞进行鉴定。结果:体外培养的原代hMSCs9d融合,免疫组织化学染色CD44表达阳性。结论:贴壁筛选法在体外很容易分离培养和扩增hMSCs,可作为获得hMSCs的一种有效手段。     

体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的体外分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)并研究其一般的生物学特性.方法通过密度梯度离心法分离MSCs、体外培养传代细胞计数、流式细胞仪检测细胞增殖周期、表面分子测定以及细胞化学染色了解人MSCs一般的特点.结果人MSCs经过体外培养均一地表达CD29、CD44、CD166,而CD34、CD45阴性.细胞化学结果显示,细胞糖原(PAS)强阳性,脂肪(SB)为阴性,5%～10%细胞碱性磷酸酶(ALP)阳性.细胞周期分析表明:G0/G1、S和G2/M所占比例分别为83.11%、5.17%和11.72%.分离细胞在成骨诱导体系下进一步向成骨细胞分化.结论密度梯度离心法能够分离纯化MSCs有其特殊的生物学特点,能够向成骨细胞分化.     

体外成骨诱导增加人骨髓间充质干细胞刺激PBMCs增殖

目的初步观察人骨髓间充质干细胞(human bonemarrow derivedmesenchymal stem cell,hMSCs)及其成骨分化后代的免疫原性,为异基因hMSCs作为骨组织工程种子细胞研究提供理论基础.方法应用Percoll密度梯度离心法从人骨髓中分离、培养细胞hMSCs;将第3代hMSCs及其体外诱导成骨3周的分化后代分别与人外周血单个核细胞(human peripheral blood mononuclear cell,PBMC)混合培养,观察上述细胞对PBMC的刺激指数.结果Percoll(1.073g/ml)分离培养的原代hMSCs为均匀一致的梭形,呈漩涡样排列.其在体外成骨诱导3周时Von-Kossa染色见细胞间质有大量的钙盐沉积,免疫细胞化学检测见到大多数细胞骨钙素表达阳性.混合细胞培养结果显示:不同细胞数量的hMSCs对PBMCs的刺激指数(stimulation index,SI)均小于2;而1×104、5×103、103的hMSCs-Osteo对PBMCs的刺激指数大于2.结论hMSCs的免疫原性较低,在体外不能刺激PBMCs增殖.但hMSCs的成骨分化后代的免疫原性增加,一定数量细胞在体外能够刺激PBMCs增殖,其在异基因宿主体内可能引起免疫排斥反应.本实验结果提示:异基因骨髓间充质干细胞要作为骨组织工程种子细胞,必须克服免疫方面的障碍.