人工生物可降解支架构建组织工程食管的实验研究

目的 研究食管上皮细胞在聚乳酸-聚乙醇酸[poly（1actic-co-glyeolic acid），PLGA]三维支架材料上的黏附和生长情况，探索利用组织工程技术构建组织工程食管的可行性。方法 应用粒子浸出常温模压法制作PLGA三维多孔支架材料；分离培养6只犬食管上皮细胞，体外扩增后，种植到预涂Ⅳ型胶原的PLGA支架材料上。在体外和犬腹腔内分别培养食管上皮细胞-支架复合物，分期终止培养，体外培养3d，1、2、3和4周，其中将体外培养3d后细胞-支架复合物植入同只犬腹腔内，于体内培养1、2、3和4周后行组织学、扫描电镜观察，以及细胞角蛋白抗体免疫组织化学检测。结果 分离培养的犬原代食管上皮细胞呈铺路石样，体外可大量扩增，细胞角蛋白抗体免疫组织化学染色呈阳性；体外及体内培养可见食管上皮细胞在支架材料上黏附、生长良好，持续培养仍保持食管上皮细胞特性；犬腹腔内培养4周后，可形成食管黏膜样组织。结论预涂Ⅳ型胶原的PLGA支架材料适合食管上皮细胞黏附生长，可作为组织工程食管的支架材料。利用组织丁程的方法在体外和犬腹腔内培养有可能获得适于移植的组织工程食管。     

脱细胞软骨细胞外基质取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的实验研究北大核心CSCD

目的探讨脱细胞软骨细胞外基质(acellular cartilage extracellular matrix,ACECM)取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的可行性。方法取市售猪关节软骨组织,分离培养关节软骨细胞并传代。取第3代软骨细胞行PKH26荧光标记,MTT检测标记对细胞增殖无影响后,分别取标记及未标记的软骨细胞复合ACECM取向支架并体外培养后,大体观察支架形态,倒置显微镜、荧光显微镜观察软骨细胞在支架中的黏附、生长和分布情况,扫描电镜观察支架中细胞形态,Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察软骨细胞外基质分泌情况。将PKH26标记的软骨细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下腔隙,术后观察裸鼠一般情况,4周后分子荧光活体成像系统无创伤性评估细胞-支架复合物生长情况,取材行大体观察以及番红O、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,评价形成软骨组织的能力。结果细胞-支架复合物体外培养7 d,大体观察呈半透明并具有一定硬度;倒置显微镜和荧光显微镜观察软骨细胞在支架上能良好黏附生长,并沿支架管道方向生长,分泌Ⅱ型胶原。细胞-支架复合物植入裸鼠皮下后,分子荧光活体成像系统观察示细胞均存活;术后4周,大体观察见复合物呈类软骨样组织,组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示细胞周围软骨细胞外基质分泌,可见"陷窝"样结构形成。结论 ACECM取向支架有利于软骨细胞的黏附、增殖及取向性分布类似于正常软骨结构,并在裸鼠皮下成功异位构建组织工程软骨。     

脱细胞软骨细胞外基质取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的实验研究

目的探讨脱细胞软骨细胞外基质(acellular cartilage extracellular matrix,ACECM)取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的可行性。方法取市售猪关节软骨组织,分离培养关节软骨细胞并传代。取第3代软骨细胞行PKH26荧光标记,MTT检测标记对细胞增殖无影响后,分别取标记及未标记的软骨细胞复合ACECM取向支架并体外培养后,大体观察支架形态,倒置显微镜、荧光显微镜观察软骨细胞在支架中的黏附、生长和分布情况,扫描电镜观察支架中细胞形态,Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察软骨细胞外基质分泌情况。将PKH26标记的软骨细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下腔隙,术后观察裸鼠一般情况,4周后分子荧光活体成像系统无创伤性评估细胞-支架复合物生长情况,取材行大体观察以及番红O、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,评价形成软骨组织的能力。结果细胞-支架复合物体外培养7 d,大体观察呈半透明并具有一定硬度;倒置显微镜和荧光显微镜观察软骨细胞在支架上能良好黏附生长,并沿支架管道方向生长,分泌Ⅱ型胶原。细胞-支架复合物植入裸鼠皮下后,分子荧光活体成像系统观察示细胞均存活;术后4周,大体观察见复合物呈类软骨样组织,组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示细胞周围软骨细胞外基质分泌,可见"陷窝"样结构形成。结论 ACECM取向支架有利于软骨细胞的黏附、增殖及取向性分布类似于正常软骨结构,并在裸鼠皮下成功异位构建组织工程软骨。     

3D打印制备PLGA/脱细胞软骨细胞外基质支架材料及其理化特性研究

目的采用低温沉积3D打印技术制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]支架,复合脱细胞软骨细胞外基质(decellularized articular cartilage extracellular matrix,DACECM)制备PLGA/DACECM组织工程软骨支架,探讨其理化特性。方法利用低温沉积3D打印技术制备PLGA支架。采用改良式物理、化学脱细胞方法制备DACECM混悬液。利用冷冻干燥和物理化学法交联技术制备DACECM取向支架,同法将DACECM混悬液与PLGA支架复合制备PLGA/DACECM取向支架。通过大体观察、扫描电镜观察3种支架宏观、微观结构,组织学及免疫组织化学染色定性分析DACECM取向支架成分,生物力学试验检测3种支架压缩模量。于SD大鼠皮下包埋3种支架,HE染色观察免疫排斥反应。分离培养新西兰大白兔软骨细胞,制备3种细胞-支架复合物,扫描电镜观察细胞在支架上的生长黏附情况。取鼠L-929成纤维细胞分别于3种支架浸提液进行培养,以DMEM培养液培养细胞作为对照,细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测细胞增殖情况。结果大体观察和扫描电镜观察示,PLGA支架表面较光滑,可见大孔;DACECM取向支架表面粗糙,为疏松多孔相互连通的三维立体结构;PLGA/DACECM取向支架表面粗糙,大孔与小孔相互连通,具有垂直三维立体结构。组织学及免疫组织化学定性分析显示,DACECM脱细胞完全,保留了软骨基质的糖胺聚糖和Ⅱ型胶原蛋白成分。生物力学检测示,DACECM取向支架压缩模量显著低于其余2种支架(P0.05),PLGA支架和PLGA/DACECM取向支架间差异无统计学意义(P0.05)。SD大鼠皮下包埋实验示,DACECM取向支架和PLGA/DACECM取向支架的免疫排斥反应明显低于PLGA支架。细胞-支架复合物扫描电镜观察示,软骨细胞在PLGA支架上未见明显黏附,大量软骨细胞在PLGA/DACECM取向支架和DACECM取向支架表面黏附、生长。CCK-8检测示,随培养时间延长,各组细胞数量均呈递增趋势,各时间点组间吸光度(A)值比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论 PLGA/DACECM取向支架具有无细胞毒性、优良的理化性能,有望成为一种组织工程软骨支架材料。     

再造组织工程尿路移行上皮组织的实验研究

目的采用组织工程技术，将培养扩增的膀胱移行上皮细胞与可降解的聚乳酸／聚羟基乙酸共聚物（polylactical／glycolic acid copolymer，PLGA）支架材料复合并植入裸鼠体内进行培育，探讨构建尿路移行上皮组织的可行性。方法取幼兔膀胱，机械分离与酶消化法获取膀胱移行上皮细胞，并在体外行原代培养与传代扩增，将第4～5代扩增的上皮细胞接种至8个PLGA聚合材料的表面作为实验组，4个单纯支架材料作为对照组。实验组：细胞材料复合体培育4周和8周各4个，对照组：单纯支架培育4周和8周各2个，分别植入各组裸鼠体内进行培育，按各时间点取出标本后进行大体观察、组织学及免疫组织化学检测。结果实验组标本经HE和马森染色，4周显示在材料表面形成数层上皮细胞；8周移行上皮细胞进一步增殖形成上皮组织，抗角蛋白免疫组织化学染色，胞浆呈棕黄色阳性。对照组4周和8周经HE染色材料表面见少量成纤维细胞沉积，马森染色呈蓝色，经抗角蛋白免疫组织化学染色为阴性。结论采用组织工程技术可再造人尿路移行上皮组织，为尿路组织工程进一步实验研究奠定了基础。     

组织工程颌下腺细胞与胶原海绵复合培养的实验研究

目的研究大鼠颌下腺细胞在胶原海绵材料支架上的生长情况。方法取8d龄Wistar大鼠颌下腺细胞，传代培养至第2代细胞，按2×10^4／ml注射法接种于5mm×5mm×2mm胶原海绵表面进行培养。术后1、2、3周行组织学观察、扫描电镜观察胶原海绵上接种颌下腺细胞形态结构特点；取复合培养3周的颌下腺细胞行免疫组织化学细胞角蛋白（cytokratin8．13，CK8．13）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscular actin，α-SMA）染色，透射电镜观察细胞超微结构，鉴定细胞来源。分别取复合培养1d，1、2、3周的培养上清，用Amano法测定淀粉酶含量，检测与胶原海绵复合培养的颌下腺细胞功能。结果细胞接种后第1周细胞分散于材料表面，无细胞突起形成；第2周细胞数量有所增加、细胞突起形成并锚定于胶原海绵表面；第3周时附着的细胞数目增多，可见细胞表层有丝状纤维形成。免疫组织化学染色观察复合培养的颌下腺细胞上皮细胞特异性抗体CK8。13呈强阳性，肌上皮细胞特异性抗体α-SMA染色呈阳性。透射电镜下颌下腺上皮细胞表面可见微绒毛、胞浆皱褶和细胞顶部的酶原颗粒，胞核大卵圆形，胞质内见线粒体和粗面内质网。随着接种后培养时间的延长，与胶原海绵复合培养的颌下腺细胞分泌的淀粉酶含量有不同程度的增加。结论胶原海绵具有良好的细胞相容性，颌下腺细胞与胶原海绵复合培养，细胞可保持增殖分化能力及分泌功能，有望成为颌下腺细胞的载体应用于组织工程支架材料。     

组织工程人口腔黏膜的制备及异体移植的临床应用

目的观察自行制备的复层组织工程人口腔黏膜移植后生长情况.方法取3月龄患儿唇裂术中切取的多余口腔黏膜组织,分离成纤维细胞与上皮细胞,分别接种于聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物(polylactic/glycolic acid copolymer,PLGA)胶原复合膜上培养,后将其移至气液面进行复合,制成复层组织工程口腔黏膜.7例行口腔内良性肿瘤切除后遗留黏膜缺损的患者,缺损范围为1.8 cm×1.6 cm～3.2 cm×2.6 cm.采用组织工程口腔黏膜修复,术后观察其生长情况.1例志愿者在移植术后18和30 d分别取移植部位黏膜行组织学观察.结果制备的组织工程口腔黏膜生长良好,具有上皮层和上皮下层双层结构,之间为PLGA膜;上皮层5～6层细胞,角蛋白染色阳性,上皮下层3～7层细胞,角蛋白染色阴性.7例患者移植修复术后10 d,组织工程口腔黏膜与创面生长良好,颜色较正常黏膜深;18 d后仍可辨出移植区与正常黏膜;30 d后无法区别界限,创面均Ⅰ期愈合,无明显瘢痕组织.组织学观察:18 d创面上皮层及下方肉芽组织生长良好,毛细血管增生有上皮钉突形成,成纤维细胞卵圆形;30 d胶原化更明显,移植区结构与周边正常组织相似.结论应用组织工程口腔黏膜异体移植修复后,黏膜生长良好,但愈合组织上皮的来源还需进一步研究.     

聚乳酸-羟基乙酸胶原膜生物相容性的实验研究

目的　评价海绵状聚乳酸 羟基乙酸 (PLGA)胶原膜作为真皮支架材料的生物相容性。　方法　利用SD大鼠和培养的人表皮细胞、成纤维细胞 ,观察PLGA胶原膜在体内的降解过程和在体外的细胞毒性、溶血性以及与人体细胞的亲和性。　结果　PLGA胶原膜在体内具有适当的降解速率 ,9周可完全降解 ;置入皮下 3周后可见血管化 ,新生组织不断长入 ,未见明显的炎症反应。浸泡液对培养细胞没有明显的毒性作用 ,不发生溶血反应。成纤维细胞和表皮细胞在PLGA胶原膜上可快速黏附、增殖。　结论　PLGA胶原膜具有良好的生物相容性和细胞亲和性 ,具有适当的降解速率 ,符合作为组织工程支架材料的要求     

离心力下构建组织工程纤维环的实验研究

目的 探讨离心力对体外构建组织工程纤维环的影响. 方法 取兔胸腰段椎间盘纤维环组织,经胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化后细胞原代培养,体外扩增至第3代,5×10<'7>/mL的细胞悬液种植于聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)无纺网支架上.实验组在离心力下培养(相对离心力:85.86×g,每天2次,每次离心15min),对照组静态培养.每组5个标本,培养4周后取出纤维环细胞与支架复合物,行大体标本观察,组织学和免疫组织化学染色,检测Ⅰ型胶原分泌情况. 结果 体外培养4周后,实验组与对照组均为类纤维环样组织,实验组纤维环厚度和组织弹性均优于对照组,Ⅰ型胶原免疫组织化学染色,实验组阳性染色面积为(45.39±6.78)%,对照组为(33.53±4.58)%,两者差异有统计学意义(P<0.01).实验组细胞排列较对照组更具方向性. 结论 离心力刺激纤维环细胞增加Ⅰ型胶原的分泌,有利于在体外构建组织工程纤维环.     

质粒修饰BMSC联合纳米支架促进软骨缺损修复的相关研究

目的探究慢病毒介导聚蛋白多糖(Aggrecan)过表达质粒转染骨髓间充质干细胞联合Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架向软骨细胞转化及软骨缺损修复的作用效果。方法构建慢病毒聚蛋白多糖过表达载体,培养骨髓间充质干细胞,构建兔模型软骨缺损模型,实验组造模后植入Gelatin/PLGA三维支架+转染聚蛋白多糖过表达载体骨髓间充质干细胞复合物;阴性对照组造模后植入Gelatin/PLGA三维支架+未转染骨髓间充质干细胞复合物;模型组造模后加入生理盐水处理。体外实验利用HE染色和免疫组织化学染色检测骨髓间充质干细胞联合Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架的联合培养体系向软骨细胞转化中聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达。构建兔膝关节软骨缺损模型,HE染色和免疫组织化学分析复合支架材料对软骨缺损的修复效果。结果 a)实验组(Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架+转染Aggrecan过表达载体骨髓间充质干细胞复合物)中支架表面黏附的细胞与对照组(Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架+未转染骨髓间充质干细胞)相比,细胞数明显增多;b)动物模型大体观察结果显示,实验组的修复效果要明显优于阴性对照组;c)动物模型HE染色结果显示,阴性对照组多为纤维性修复,而实验组多为细胞性修复;d)免疫组织化学染色结果显示,实验组修复软骨组织中Aggrecan和Ⅱ型胶原含量要明显优于阴性对照组。结论 Gelatin/PLGA三维支架加转染Aggrecan过表达载体骨髓间充质干细胞复合物可以促进BMSC向软骨细胞的分化,并且分泌更多的含Aggrecan和Ⅱ型胶原成分的细胞外基质,从而发挥其促进软骨缺损修复的作用。     

人脂肪来源干细胞与胶原支架共培养的实验研究

目的观察评价人脂肪来源干细胞(Human adipose derived stem cells,hADSCs)在胶原支架中的生长情况,为进一步体内组织修复研究提供依据。方法取人抽脂术后脂肪,经胶原酶解、过滤、离心获得hADSCs,代传代扩增后,接种到胶原支架上。细胞-材料复合物分别体外培养1周、2周,裸鼠体内培养2周、4周后,HE染色观察细胞在支架上的生长情况,免疫组化HLA-Ⅰ检测经裸鼠体内培养后的复合物上的细胞的种属来源。结果原代培养的hADSCs呈"梭形"或"成纤维细胞"样,并以克隆团形式生长。免疫荧光Vimentin染色阳性。第3代hADSCs经流式细胞鉴定,CD29、CD44、CD105表达阳性,CD45、CD34表达阴性。胶原支架复合hADSCs经过体外、体内培养,hADSCs均能长入胶原支架的空隙内,且体内培养比体外培养有更多的细胞长入支架。体外培养1周,已有细胞粘附生长在胶原支架的边缘,体外培养2周后,更多的细胞渗透到材料内部。体内培养2周后,大量细胞占据材料的边缘,有部分细胞能渗透到材料内部甚至材料全层。体内培养4周后,大量细胞渗透支架全层。HLA-Ⅰ抗体检测发现,支架材料内部细胞阳性表达,说明胶原支架内部的细胞来源于hADSCs。结论胶原支架与hADSCs具有较好的相容性,可作为hADSCs的载体材料,用于组织工程缺损修复的研究。     

小肠黏膜下层复合上皮细胞及成肌细胞构建组织工程食管的初步研究

目的初步探索利用小肠黏膜下层(smallintestinalsubmucosa,SIS)作为支架材料,复合食管鳞状上皮细胞与成肌细胞构建组织工程食管的可行性。方法4周龄无胸腺小鼠20只,体重20.0±2.5g,雌雄不限。体外分离、培养人胚胎食管鳞状上皮细胞、成肌细胞,并行5-BrdU标记;制备SIS材料并切割成1cm×1cm大小,在SIS材料同一表面接种两种细胞,待细胞在材料表面贴附后将其植入裸鼠体内深筋膜下,于术后第3天及1、2、3周取材行组织学和抗角蛋白、平滑肌肌动蛋白(smoothmuscleactin,SMA)免疫组织化学观察,以了解食管鳞状上皮细胞、成肌细胞在SIS材料上的增殖、分化情况和复合物在裸鼠体内的血管化情况。结果人胚胎食管鳞状上皮细胞、成肌细胞能够渗透、生长于SIS材料中,并形成数层结构。植入体内第3天可见细胞增殖为多层覆盖于材料表面,并分泌大量细胞间基质。第2周时已经形成7~8层细胞,并伴有血管长入。3周时细胞增殖为十几层,大量血管长入。通过5-BrdU标记抗体染色观察,示SIS支架材料上生长的细胞多为所植入细胞。抗角蛋白,SMA免疫组织化学染色示移植细胞能够在体内分化。结论成肌细胞与鳞状上皮细胞在SIS材料上的复合培养物,在体内能继续增殖分化形成多层细胞结构,并能快速血管化,可用于组织工程化食管的构建。     

重组人BMP-2修饰的β磷酸三钙/胶原材料制备及其诱导成牙性能的初步研究

目的构建重组人BMP-2(recombinant human BMP-2,rhBMP-2)修饰的β磷酸三钙(βtricalciumphosphate,β-TCP)/胶原生物支架材料,初步探讨其在牙组织工程中发挥的作用,评价其作为牙组织工程支架材料的可行性。方法将纳米级β-TCP粉末与胶原在强碱性水溶液中复合,制备β-TCP/胶原生物支架材料,并与rhBMP-2复合,制备牙组织工程支架材料。SPF级8～10周龄SD大鼠46只,雄性34只,雌性12只,体重250～300 g。体视显微镜下分离新生SD大鼠的下颌骨,取牙胚消化成细胞悬液,与支架材料复合培养制备组织工程牙胚。通过扫描电镜观察、细胞黏附率测定和MTT测定细胞增殖情况评价支架材料对牙胚细胞体外生长的影响。将组织工程牙胚植入SD大鼠肾被膜下作为实验组(n=12),另分别植入单独牙胚细胞团块(细胞对照组,n=12)及单独支架材料(材料对照组,n=4)作为对照,4、8周时取出标本行大体及组织学观察。结果扫描电镜示β-TCP/胶原生物支架材料呈疏松多孔状,质地柔软,亲水性良好;复合培养3 d后牙胚细胞可紧密贴附于支架材料,生长状态良好。牙胚细胞接种至支架材料上经4、8、12 h孵育后,细胞黏附率分别为27.20%±2.37%、44.52%±1.87%、73.81%±4.15%。MTT检测示牙胚细胞在β-TCP/胶原生物支架材料上的增殖情况与未放置支架材料相似,差异无统计学意义(P>0.05)。各组植入物移植于大鼠肾被膜下4、8周后大体观察可见白色钙化物形成;植入后4周,实验组镜下可见明显牙样形态及典型的釉质和牙本质样结构形成,细胞对照组可见釉质和牙本质样结构,但排列相对紊乱;植入后8周,实验组釉质及牙本质样结构较4周成熟,层次也更加清晰,细胞对照组也可见较为成熟的釉质和牙本质样结构;植入后4、8周,材料对照组均未见牙样结构形成。结论 rh BMP-2修饰的β-TCP/胶原生物支架材料与牙胚细胞生物相容性良好,可作为牙组织工程支架材料的良好选择。     

3D打印制备聚己内酯/Ⅰ型胶原组织工程半月板支架及其理化特性的研究

目的采用低温沉积技术3D打印制备聚己内酯(polycaprolactone,PCL)/Ⅰ型胶原组织工程半月板支架(以下简称PCL/Ⅰ型胶原半月板支架),探讨其理化特性。方法制备15%PCL/4%Ⅰ型胶原溶液及15%PCL溶液,利用低温沉积技术3D打印制备PCL/Ⅰ型胶原半月板支架及PCL半月板支架。大体及扫描电镜观察支架形态及微观结构,生物力学试验测量支架压缩模量及拉伸模量,红外光谱分析支架成分,测量支架表面接触角;将两种支架及其浸提液分别与兔半月板细胞复合培养,细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测细胞增殖,并以正常培养细胞作对照;扫描电镜观察支架-细胞复合物中细胞黏附及生长情况。结果大体及扫描电镜观察显示,两种支架均具有取向的三维微观结构及孔隙,但PCL/Ⅰ型胶原半月板支架表面更粗糙。生物力学测试,两种支架压缩模量及拉伸模量比较,差异均无统计学意义(P0.05)。红外光谱分析提示,PCL/Ⅰ型胶原半月板支架中PCL和Ⅰ型胶原成功混合。PCL/Ⅰ型胶原半月板支架表面接触角为(83.19±7.49)°,较PCL半月板支架(111.13±5.70)°显著减小(t=6.638,P=0.000)。CCK-8检测显示,随培养时间延长,两种支架浸提液培养的细胞数量呈递增趋势,与对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。支架-细胞复合物扫描电镜观察示,PCL/Ⅰ型胶原半月板支架表面黏附细胞多于PCL半月板支架。结论低温沉积技术3D打印制备的PCL/Ⅰ型胶原半月板支架具有优良的理化学性能,无细胞毒性,有望作为半月板组织工程支架材料。     

组织工程化膀胱壁复层结构的体外构建

目的 探讨膀胱缺损组织工程修复方法.方法 机械法去除膀胱黏膜层、肌层和浆膜层,仅保留膀胱黏膜下层.经SDS、Trixon-100和三蒸水处理去除细胞结构,制备获得膀胱脱细胞基质移植物(BAMG)作为支架材料.取成年猪膀胱壁,机械法分离膀胱肌层和黏膜层.以酶消化法分别获取膀胱尿路上皮细胞和平滑肌细胞.常规细胞传代和扩增后,将膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞分别接种在BAMG浆膜面和黏膜面.细胞-材料复合物体外培养4周并行组织学鉴定.结果 HE和Masson染色鉴定发现,BAMG以胶原成分为主,内部未见明显细胞残留.免疫荧光方法鉴定结果显示,膀胱尿路上皮细胞uroplakin Ⅱ阳性,膀胱平滑肌细胞α-平滑肌肌动蛋白阳性.体外培养4周后,BAMG浆膜面和黏膜面分别形成连续的复层结构尿路上皮层和膀胱平滑肌层,免疫组化显示平滑肌层α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,尿路上皮层广谱角蛋白表达阳性.结论 以膀胱脱细胞材料作为支架,尿路上皮细胞和膀胱平滑肌细胞作为种子细胞,能够在体外构建形成包含膀胱黏膜层及平滑肌层的复层膀胱壁结构.细胞-材料复合物的体外构建将为体内膀胱缺损的组织工程修复提供实验依据.     

壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架与滑膜成纤维样细胞构建颞下颌关节盘的研究

目的 探讨利用滑膜成纤维样细胞(SFBs)及壳聚糖/Ⅰ型胶原(CS/COL-Ⅰ)复合支架构建颞下颌关节盘软骨的可行性.方法 获取兔颞下颌关节滑膜组织进行SFBs培养,第3～5代SFBs三维培养于通过冷冻干燥法制备的CS/COL-Ⅰ支架材料中7 d,用噻唑蓝(MTT)比色法分别在1、3、5、7 d检测支架材料对细胞增殖的影响.细胞支架复合物在体外经过人重组转化生长因子β1(rhTGF,10μg/L)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,50 μg/L)诱导后,植入裸鼠体内4、8周后获取标本,进行组织学检测细胞在支架材料上的生长状态及黏多糖(GAGs)形成,免疫组织化学和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量分析Ⅱ型胶原的表达.结果 支架材料表面及内部均呈多孔隙蜂窝状结构.SFBs在CS/COL-Ⅰ中的增殖要明显高于平板培养(P＜0.05).细胞支架复合物植入裸鼠体内4、8周后,组织学及免疫组织化学半定量分析显示在8周时GAGs(6.900±0.316)和Ⅱ型胶原(0.0952±0.0248)IA/μm2与4周时GAGs(3.600±0.699)和Ⅱ型胶原(0.0411±0.0127)IA/μm2差异有统计学意义(P＜0.05).结论 体外诱导后的SFBs/CS-COL-Ⅰ复合物具有应用于组织工程化颞下颌关节盘构建的可能.     

新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外构建组织工程化髓核的实验研究

[目的]观察以新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外构建组织工程化髓核的可行性。[方法]分离培养兔髓核细胞,与丝素蛋白多孔支架在体外复合培养,建立组织工程化髓核模型,通过扫描电镜、HE染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化以及酶联免疫吸附测定观察细胞在支架上1周和3周的生长及增殖情况。[结果]培养1周后,扫描电镜显示细胞呈球状均匀地贴附在支架内部。细胞-支架复合体HE染色可见支架内部有大量髓核细胞,甲苯胺兰染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。培养3周后,扫描电镜显示细胞成层黏附于支架表面,细胞重叠生长,分泌大量细胞外基质,HE染色可见支架内部有大量髓核细胞填满支架孔隙并分泌大量细胞外基质,甲苯胺兰染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。酶联免疫吸附测定:3周组蛋白多糖含量(52.4±4.5)ng/ml明显高于1周组(29.3±3.6)ng/ml,P<0.05,3周组的II型胶原含量(24.3±1.8)ng/ml明显高于1周组(15.16±1.5)ng/ml,P<0.05。[结论]新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外培养生长良好,分泌大量类似髓核样细胞外基质,可以用于体外构建组织工程化髓核。     

胶原凝胶构建神经组织工程支架的实验研究

目的研究胶原凝胶支架对大鼠BMSCs增殖和分化的影响,探讨其作为神经组织工程支架的可行性。方法利用Ⅰ型胶原制备胶原凝胶支架。采用密度梯度离心法分离培养大鼠BMSCs,取第5代细胞制备胶原凝胶-BMSCs复合体。采用扫描电镜、HE染色观察胶原凝胶支架的形态结构及复合培养后细胞形态;MTT检测该支架对BMSCs增殖的影响。取绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性(GFP~+)BMSCs于胶原凝胶支架中培养24 h,通过激光共聚焦显微镜及活细胞工作站观察细胞生长及与材料的黏附情况。结果激光共聚焦显微镜及活细胞工作站观察示,GFP~+BMSCs均匀分布于胶原凝胶支架内,大部分GFP~+BMSCs呈梭形,部分细胞伸出突起,部分细胞间形成连接,提示BMSCs在三维空间中生长良好。扫描电镜示胶原凝胶支架为多孔纤维网状结构,BMSCs可黏附于该支架材料上,细胞形态良好。MTT检测示,BMSCs于胶原凝胶支架中培养后3、5、7 d的吸光度(A)值均高于单纯BMSCs培养,其中5、7 d时组间差异有统计学意义(t=4.472,P=0.011;t=4.819,P=0.009)。HE染色示,胶原凝胶支架呈均质淡粉染细丝样物质。BMSCs在胶原凝胶内培养24 h后均匀分布其中;7 d时BMSCs形态多样,部分细胞伸出细长突起,具有体外培养的神经元样形态。结论胶原凝胶支架制备简便,具有良好的生物相容性,可作为神经组织工程支架材料。     

不同细胞接种密度构建组织工程椎间盘的实验研究

目的:探索构建组织工程椎间盘时合理的细胞接种数量.方法:取孕20周自然流产的人胚胎椎间盘细胞为种子细胞,聚乳酸-羟基乙酸(polylactic-glycolic acid.PLGA)材料为支架分别构建细胞接种密度为0(A组,空白对照组)、104个/150μl(B组)、105个/150μl(C组)、106个/150μl(D组)的细胞-支架复合物,体外培养48h后植入裸鼠背部皮下,8周后取材行形态及HE和免疫组织化学染色组织学观察,生化测定Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白和糖胺聚糖,观察BrdU(5-bromo-2-deoxyuridine,5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷)标记细胞.结果:人胚胎椎间盘细胞可与PLGA支架在体外及裸鼠体内实现良好的复合并初步发挥生理功能.8周时,实验组复合物维持了良好的外形,有效阻挡了外源纤维组织长人支架内部.细胞-支架复合物内有大量BrdU阳性细胞.C组及D组细胞-支架复合物中胶原蛋白及糖胺多糖的表达量明显高于A组和B组,差异有显著性(P<0.01).结论:人胚胎椎间盘细胞在体外培养条件下可与PLGA支架完成良好的立体结合,细胞可顺利完成贴附及增殖.构建组织工程椎间盘时比较理想的细胞接种密度应不低于105个/150μl.     

聚羟基乙酸作为支架材料体外构建复层膀胱壁结构的探讨

目的：探讨聚羟基乙酸（polyglycolic acid,PGA）作为支架材料并复合成年猪膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞,体外构建复层膀胱壁结构的可行性。方法：采用PGA作为支架材料。并以聚乳酸（polylact acid,PLA）塑形。以酶消化法分别获得猪膀胱尿路上皮细胞和平滑肌细胞,并体外扩增。以MTT法分别检测P3代膀胱平滑肌细胞（SMC）和尿路上皮细胞（UC）的体外增殖能力。将P3代膀胱平滑肌细胞先接种在支架上,再接种尿路上皮细胞。将细胞一材料复合物体外培养1～2周并行组织学鉴定。结果：酶消化法获得的膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞经过体外培养仍具有较强的体外增殖能力。细胞材料复合物体外培养1周后形成分层排列结构,包括黏膜上皮层和膀胱平滑肌层。免疫组织化学显示平滑肌层α-Smooth Muscle Actin表达阳性,黏膜上皮层广谱角蛋白表达阳性。而细胞材料复合物继续体外培养至2周,细胞从支架上大量脱落。结论：PGA适合作为复层膀胱壁结构体外构建的支架材料。采用PGA作为支架材料并复合膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞,可以体外构建出类似复层膀胱壁结构。细胞材料复合物体外培养1周左右较适合进行体内回植修复。