血小板裂解液对人脐带间充质干细胞体外成软骨分化的影响

目的探讨血小板裂解液(platelet lysate,PL)在体外定向诱导人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,hUCMSCs)分化成软骨细胞中的作用。方法取健康产妇自愿捐赠脐带,采用胶原酶消化法分离hUCMSCs,体外培养扩增,流式细胞仪进行细胞表型鉴定。根据加入诱导培养基成分不同将实验分为以下3组:A组为H-DMEM培养基、10%FBS及10%PL,B组为H-DMEM培养基、10%FBS、10 ng/mL TGF-β1、1×10-7 mol/L地塞米松、50μg/mL维生素C及1%胰岛素铁硒传递蛋白(insulin-transferrin-selenium,ITS),C组为H-DMEM培养基、10%FBS、10 ng/mL TGF-β1、1×10-7 mol/L地塞米松、50μg/mL维生素C、1%ITS及10%PL。诱导培养2周,甲苯胺蓝染色检测各组软骨细胞基质的分泌,免疫荧光检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达,半定量RT-PCR检测蛋白聚糖(Aggrecan)和Ⅱ型胶原表达。结果分离得到的hUCMSCs不表达造血细胞的表面标记CD45、CD34和HLA-DR,而表达黏附分子和MSCs表面标记CD44、CD105和CD146。甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色示C组呈阳性,B组呈弱阳性,而A组均呈阴性。半定量RT-PCR检测示Aggrecan和Ⅱ型胶原在B、C组中均有表达,A组中未见表达;C组Aggrecan mRNA和Ⅱ型胶原mRNA表达明显高于B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论单纯10%PL不能诱导hUCMSCs成软骨分化,但它可当作成软骨诱导培养基的辅助添加剂,对hUCMSCs成软骨分化有明显促进作用,为构建组织工程软骨提供了新的可利用条件。     

残耳软骨细胞诱导脂肪来源干细胞体外软骨形成实验研究

目的探讨残耳软骨细胞能否在体外模拟软骨诱导微环境,促进脂肪来源干细胞(adipose derived stemcells,ADSCs)向软骨分化并形成软骨样组织。方法取外耳再造术中废弃的先天性小耳畸形患者残耳软骨组织与皮下脂肪组织分离培养,分别收集第2代残耳软骨细胞与第3代ADSCs,以3∶7比例混合培养作为实验组(A组),单纯残耳软骨细胞和单纯ADSCs作为对照(分别为B组和C组)。取各组细胞1.0×106个离心培养获得细胞球后,体外培养28 d,大体观察各组细胞球取材时的外观变化,测量湿重;阿利辛蓝比色法检测糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG)含量;RT-PCR检测各组标本的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖(Aggrecan)mRNA表达;并行HE、甲苯胺蓝、番红O组织学观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。结果体外培养28 d后,A、B组标本形成白色半透明圆盘状组织块,表面光滑,弹性可;C组标本组织块有明显收缩,呈黄色球状,无弹性。A、B组标本湿重及GAG含量显著高于C组(P<0.05);A、B组间差异无统计学意义(t=1.820 3,P=0.068 7;t=1.861 4,P=0.062 7)。RT-PCR检测示A、B组标本均可见Ⅱ型胶原与Aggrecan mRNA条带清晰表达,C组未见明显表达;A、B组Ⅱ型胶原与Aggrecan mRNA表达均显著高于C组(P<0.05),A、B组间差异无统计学意义(t=1.457 6,P=0.144 9;t=1.519 5,P=0.128 6)。组织学观察示:A组与B组细胞球标本形成了大量软骨陷窝样结构,细胞外基质均有不同程度染色;C组细胞球标本组织内主要为纤维性成分,未见软骨陷窝,细胞外基质染色阴性。A、B组可见在软骨陷窝周围有不同程度棕黄色沉淀即Ⅱ型胶原表达,C组未见明显表达;A、B组灰度值显著低于C组(P<0.01),A、B组间差异无统计学意义(t=1.661 5,P=0.097 0)。结论残耳软骨细胞可在体外独立模拟软骨诱导微环境,促进ADSCs软骨定向分化并形成软骨组织。     

力学刺激联合诱导因子对组织工程软骨的影响

目的力学刺激与诱导因子是软骨组织工程中的重要诱导因素,研究力学刺激联合诱导因子对组织工程软骨的影响。方法 7日龄长枫杂交仔猪,体重3～6 kg,用于分离培养BMSCs,取第2代细胞以5×107个/mL密度接种于聚羟基乙酸-聚乳酸[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]支架上制备细胞-支架复合物。实验随机分为5组,A、B、C组分别对细胞-支架复合物采用软骨诱导培养液诱导、单纯力学加载、力学加载联合软骨诱导液培养处理,其中力学加载参数为1 Hz、0.5 MPa、4 h/d;D、E组分别为单纯细胞-支架复合物阴性对照和猪自体软骨阳性对照。4周后各组分别取材行大体观察、组织学检测及实时荧光定量PCR检测。结果 C组细胞-支架复合物厚度、弹性模量及最大值负荷均显著高于A、B组(P<0.05)。A、B、C组组织切片HE染色均可见有软骨陷窝形成,番红O染色提示支架复合物的细胞外基质中有大量蛋白聚糖(glycosaminoglycan,GAG)形成,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均显示阳性结果,其中A组染色深度强于B组,C组强于A、B组,且最接近E组;C组GAG含量显著高于A、B组(P<0.05)。实时荧光定量PCR检测示,C组Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖mRNA表达量均显著高于A、B组,且A组各基因表达量均高于B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论力学刺激联合软骨诱导因子能更好地促进细胞-支架复合物上的BMSCs产生更多胶原和GAG等细胞外基质,增强其力学特性,更有助于其向软骨细胞分化。     

三种亚型软骨组织来源干细胞的分离培养及鉴定

目的分离培养猪不同亚型软骨组织(弹性软骨、透明软骨以及纤维软骨)来源干细胞并鉴定,为软骨组织工程提供理想种子细胞。方法利用纤维连接蛋白黏附法分别从猪耳软骨、关节软骨以及椎间盘软骨中分离培养干细胞,并进行传代。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞术鉴定细胞表面抗原表达水平(阳性标志物CD29、CD90及阴性标志物CD34、CD45),单克隆形成实验鉴定软骨干细胞单克隆形成能力。三向诱导分化鉴定软骨来源干细胞的成软骨、成骨及成脂多向分化潜能。RT-PCR检测成骨(Ⅰ型胶原、Ⅹ型胶原)、成软骨[蛋白聚糖(Aggrecan)、II型胶原]、成脂[脂联素(Adiponectin)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)]相关基因表达,并以猪BMSCs作为对照。结果通过纤维连接蛋白黏附法分别从耳软骨(弹性软骨)、关节软骨(透明软骨)、椎间盘软骨(纤维软骨)分选出一群细胞,细胞高表达干细胞表面阳性标志物CD29、CD90,几乎不表达干细胞表面阴性标志物CD34、CD45。经过体外2周培养,单个细胞均能形成细胞克隆。三向诱导分化显示软骨来源的干细胞具备成软骨、成骨和成脂分化能力。RT-PCR结果显示,成骨诱导后关节和椎间盘来源软骨干细胞的Ⅰ、Ⅹ型胶原基因相对表达量明显高于BMSCs(P0.05),耳软骨来源干细胞与BMSCs比较差异无统计学意义(P0.05);成软骨诱导后,3种亚型软骨组织来源干细胞Aggrecan、Ⅱ型胶原基因相对表达量均高于BMSCs(P0.05);成脂诱导后,3种来源软骨干细胞Adiponectin及FAS基因相对表达量均低于BMSCs,但比较差异无统计学意义(P0.05)。结论不同亚型的猪软骨组织中均存在软骨干细胞,具有干细胞的典型特征。     

人间充质干细胞成软骨分化中DNA甲基化调控Ⅹ型胶原表达

目的在人间充质干细胞(hMSCs)诱导成软骨分化过程中，探讨Ⅹ型胶原与其启动子甲基化状态之间的关系，为揭示表观遗传学调控参与成软骨分化的可能机制提供理论基础。 方法收集6例来源于深圳市第二人民医院脊柱外科患者的腰椎椎体骨髓间充质干细胞为研究对象，运用离心沉淀法进行细胞微球培养，用含有转化生长因子β3(TGF-β3)及2%胎牛血清(FBS)的高糖细胞培养基(DMEM)进行成软骨诱导并作为实验组(3例)；在该诱导液中加入5’-氮杂胞苷(5’-AZA)作为诱导组(3例)；不含TGF-β3的2%胎牛血清的高糖细胞培养基的为对照组(3例)。在分化3 d后进行定量PCR，检测成软骨分化相关基因表达以及Ⅹ型胶原启动子区域甲基化改变情况，采用方差分析及多样本间的均数比较(q检验)分析基因水平表达差异；组间DNA甲基化水平差异采用Kruskal-Wallis检验统计学差异。 结果通过生物信息学预测Ⅹ型胶原的启动子区域可能存在CpG富集区域，在含有5’-氮杂胞苷的成软骨诱导分化过程中，Ⅹ型胶原表达逐渐上升，与对照组相比差异具有统计学意义(F＝37.526, P<0.001)，而Ⅹ型胶原启动子区域的甲基化水平与对照组相比逐渐下降，差异也具有统计学意义(F＝11.066，P<0.01)。 结论在体外诱导人间充质干细胞成软骨分化过程中，参与维持Ⅹ型胶原启动子甲基化状态降低，分化能力得到增强；提示表观遗传学调控方式是影响干细胞分化方式之一。     

低氧诱导因子1α及2α在人BMSCs成软骨分化中的表达规律

目的通过诱导人BMSCs(human BMSCs,hBMSCs)成软骨分化,观察低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)、HIF-2α在分化过程中的表达趋势,为阐明HIF参与调控成软骨分化机制提供依据。方法对已消化的悬浮hBMSCs进行离心沉淀,形成细胞微球。将细胞微球分为2组,对照组加入含2%FBS的H-DMEM培养基,成软骨诱导组加入软骨诱导液,于低氧(2%O2)条件下培养。培养3周后行甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,培养1周行Western blot检测HIF-1α、HIF-2α蛋白表达,培养1、2、3周行实时定量PCR检测成软骨分化关键转录因子及相关标志基因表达。结果甲苯胺蓝染色示,对照组染色细胞核整体分布稀疏,而成软骨诱导组分布致密;成软骨诱导组细胞外基质染色明显较对照组深。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示阳性信号主要位于细胞质内;与成软骨诱导组相比,对照组细胞核分布较稀疏且着色浅。Western blot检测示,培养1周成软骨诱导组HIF-1α和HIF-2α蛋白相对表达量均显著低于对照组(t=8.345,P=0.001;t=7.683,P=0.002)。实时定量PCR检测示,与对照组比较,成软骨诱导组HIF-1αmRNA相对表达量在培养1周时降低、2周时显著升高,差异均有统计学意义(P0.05);3周时两组比较差异无统计学意义(P0.05)。成软骨诱导组培养各时间点HIF-2αmRNA相对表达量均显著低于对照组,Sox-9 mRNA相对表达量均显著高于对照组,差异均有统计学意义(P0.01)。培养过程中,Ⅱ型胶原及Ⅹ型胶原表达呈逐渐增加趋势,第2、3周时两者的mRNA相对表达量显著高于对照组(P0.05)。而成软骨诱导组多聚蛋白聚糖mRNA相对表达量在各时间点均高于对照组(P0.05)。结论 HIF-1α参与诱导hBMSCs成软骨分化过程,但HIF-2α表达在该分化过程中受抑制。     

盐酸氨基葡萄糖对关节内出血引起的软骨损伤修复作用研究

目的探讨盐酸氨基葡萄糖(glucosamine-hydrochloride,Glu/Ch)对关节内出血引起的软骨损伤(blood-induced joint damage,BJD)修复作用。方法取健康成年新西兰大白兔32只,随机分为高剂量Glu/Ch组(A组)、低剂量Glu/Ch组(B组)、阳性对照组(C组)、阴性对照组(D组),每组8只。A、B、C组制备关节内出血模型,D组不建模。建模后第1天开始A、B组每天以Glu/Ch灌胃(剂量分别为250、21.5 mg/kg)8周,C、D组以生理盐水灌胃8周。建模后3、7 d及2、8周检测关节损伤标志物血清软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP)、血清硫酸软骨素846(chondroitin sulfate 846,CS846)、尿Ⅱ型胶原羧基端前肽(C-terminal telopepide of typeⅡcollagen,CTX-Ⅱ)浓度。8周时处死动物,抽取关节液采用ELISA法检测炎性因子IL-1β、TNF-α浓度。取关节软骨组织分别行免疫组织化学染色,测量基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)表达量;行阿尔新蓝、番红O染色,计算阳性染色面积百分比;对关节软骨中的蛋白多糖含量行半定量检测。结果建模后3 d A、B、C组COMP浓度显著高于D组(P0.05),B、C组高于A组(P0.05);7 d A、B、D组间比较差异无统计学意义(P0.05),且均低于C组(P0.05);2、8周各组间比较差异均无统计学意义(P0.05)。各时间点各组间CS846浓度比较,差异均无统计学意义(P0.05)。各时间点A、B、C组CTX-Ⅱ浓度均显著高于D组(P0.05);除3 d外,7 d及2、8周时,A组CTX-Ⅱ浓度显著低于B、C组(P0.05)。建模后8周,A、B组TNF-α浓度显著高于D组、低于C组(P0.05);A、B组间比较差异无统计学意义(P0.05)。A、B、D组IL-1β浓度显著低于C组(P0.05),A、D组低于B组(P0.05),A、D组间比较差异无统计学意义(P0.05)。免疫组织化学染色示,C组MMP-13表达量显著高于A、B、D组,A、B组高于D组(P0.05),A、B组间比较差异无统计学意义(P0.05)。各组均见阿尔新蓝及番红O阳性染色,其中D组染色范围最大、着色最深,其次分别为A、B、C组;两种阳性染色面积百分比各组间比较,差异均有统计学意义(P0.05)。各组关节软骨蛋白多糖相对含量由低到高依次为C、B、A、D组,各组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论兔关节出血模型会引起关节软骨代谢异常和滑膜炎性反应,每天给予Glu/Ch 250 mg/kg灌胃能在一定程度上阻止BJD,其作用机制可能是减少炎性反应引起的关节损伤,下调IL-1β、TNF-α、MMP-13,增加蛋白聚糖合成。     

骨髓基质细胞与关节软骨细胞生物学特性的比较研究

目的观察兔骨髓基质细胞(MSCs)诱导和基因修饰后的主要生物学特性,并与关节软骨细胞进行比较. 方法抽取成年雄性新西兰大白兔髂骨骨髓,密度梯度离心获得骨髓基质细胞,培养传至第5代,按处理方法分为常规培养液组(A组)、条件培养液组(B组)及重组缺陷型腺病毒携带肝细胞生长因子cDNA转染组(C组).条件培养液为常规培养液中含转化生长因子-β1(10 ng/ml)、碱性成纤维细胞生长因子(25 ng/ml)和地塞米松(10-7 mol/L).切取兔膝关节软骨,3 mg/ml Ⅱ型胶原酶消化传代培养至第3代(D组).观察原代MSCs及第5代MSCs(体外培养8～10周后)细胞形态,对第5代MSCs及第3代软骨细胞进行Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,MTT法检测细胞增殖情况.阿利新蓝法检测细胞培养上清液中糖胺多糖(GAG)含量.提取各组培养细胞总RNA,RT-PCR检测Ⅰ、Ⅱ型胶原表达. 结果原代MSCs为短梭形、簇状生长,传代细胞呈长梭形、旋涡样生长.A组细胞爬片Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阴性,GAG含量低,与D组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).B组细胞爬片Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性,GAG含量升高,与D组比较差异无统计学意义(P＞0.05);C组转染后第4天增殖率降低,与A组比较差异有统计学意义(P＜0.05),其余时间点各组间无统计学意义(P＞0.05).RT-PCR表明A、B、C组均表达Ⅰ型胶原,B、D组可表达Ⅱ型胶原,C组有较弱的Ⅱ型胶原表达. 结论 MSCs体外培养过程中自然转归趋向于成骨.传代后经向成软骨方向诱导,具有向软骨分化的能力;体外传代培养的MSCs具有干细胞自我增殖和定向分化的特性,可作为靶细胞接受外源目的基因转染并能有效表达.     

不同相对分子质量透明质酸对兔骨髓来源间充质干细胞成软骨分化的影响

目的 观察不同相对分子质量透明质酸(HA)对兔骨髓来源间充质干细胞(MSCs)向软骨方向定向分化的影响.方法 取P3代未诱导的骨髓来源间充质干细胞,培养液中分别添加不同相对分子质量透明质酸做诱导剂,分为3个实验组,A组:相对低分子质量组(基础培养基+ HA 0.1 g/L,相对分子质量约1000×103),B组:相对中分子质量组(基础培养基+HA0.1 g/L,相对分子质量约1800×103),C组:相对高分子质量组(基础培养基+HA 0.1 g/L,相对分子质量约2000×103).同时设立阳性对照组[基础培养基+ 10 μg/L转化生长因子-β3( TGF-β3)]及空白对照组(基础培养基),观察细胞形态及增殖情况,分别于诱导后第7、14、21天行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,另外采用免疫组织化学染色及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测细胞Ⅱ型胶原表达.结果 经添加软骨诱导剂后,干细胞细胞增殖速度放缓,形态逐渐改变,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性.RT-PCR检测示实验组Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,诱导至21 d可见各实验组Ⅱ型胶原基因相对表达量分别为0.64±0.06、0.72±0.03、0.75±0.01,与阴性对照组(0.09±0.03)、阳性对照组(0.96±0.15)比较差异均有统计学意义,但B、C组间Ⅱ型胶原表达相似.结论 不同相对分子质量外源性HA诱导兔MSCs向软骨细胞分化的能力存在差异,相对高分子质量的HA的诱导能力较相对低分子质量HA的诱导能力强.证明透明质酸的相对分子质量与MSCs的软骨分化有关联性,但均比TGF-β3的诱导能力弱.     

BMP-2联合低氧环境诱导BMSCs向软骨表型分化的研究

目的探讨BMP-2联合低氧环境诱导BMSCs向软骨表型分化的可行性,并进一步研究其生物学机制。方法取4周龄健康清洁级雌性SD大鼠骨髓采用贴壁法体外培养BMSCs,取第2代细胞根据培养条件不同分为4组:常氧对照组(A组)、常氧加BMP-2诱导液组(B组)、低氧(O2浓度3%)对照组(C组)和低氧加BMP-2诱导液组(D组)。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,培养7、14、21 d阿利新蓝染色检测各组软骨基质糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAG)分泌水平,21 d时Western blot检测细胞内Ⅱ型胶原和低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)蛋白表达水平,RT-PCR检测成软骨、成骨以及低氧相关基因表达水平。结果诱导培养21 d,D组细胞变为类圆形,细胞密度降低,细胞周边呈陷窝样,基质包裹细胞;A、B、C组均未见上述典型变化。D组阿利新蓝染色明显较其他组深,并随诱导时间延长蓝染加深,21 d时出现成片深染蓝色,其他组各时间点仅见散在少量的淡染蓝色。Western blot检测D组细胞内Ⅱ型胶原蛋白表达水平较其他组显著增高,C、D组HIF-1α蛋白表达水平较A、B组显著增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测D组成软骨分化相关指标Ⅱ型胶原α1(collagenⅡα1,COL2α1)、聚集蛋白聚糖表达最高,而B组成骨分化相关指标COL1α1、ALP、Runt相关转录因子2表达水平最高,C、D组低氧相关指标HIF-1α较A、B组显著增强,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 BMP-2联合低氧(O2浓度3%)环境可以诱导大鼠BMSCs向软骨分化,并抑制其成骨分化,HIF-1α可能是参与促软骨生成过程中的一个重要信号分子。     

不同时期bFGF或副甲状腺激素相关肽对TGF-β1诱导的兔BMSCs向软骨细胞分化的影响

目的探讨bFGF和副甲状腺激素相关肽(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)对TGF-β1诱导兔BMSCs向软骨细胞分化的影响。方法 2月龄健康日本大耳白兔3只,雌雄不限,体重1.6～2.1 kg;取兔胫骨骨髓分离培养BMSCs。取第3代细胞行团块状立体培养,并按照不同诱导条件分为TGF-β1组(A组)、TGF-β1/bFGF组(B组)、TGF-β1/21 d bFGF组(C组)、TGF-β1/PTHrP组(D组)、TGF-β1/21d PTHrP组(E组)。于团块状立体培养开始时,各组均加入10 ng/mL TGF-β1;B、D组同时加入10 ng/mL bFGF或10 ng/mL PTHrP;C、E组于培养21 d时对应加入10 ng/mLbFGF或10 ng/mL PTHrP。培养后1、2、3、4、5、6周检测各组BMSCs向软骨细胞分化的标志性基因Ⅰ型胶原(collagentypeⅠ,ColⅠ)、ColⅡ、ColⅩ和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)13的表达,1、2、3、4、6周检测ALP活性,6周时行1,9二甲基亚甲蓝(1,9-dimethylmethylene blue,DMMB)染色观察细胞外基质分泌情况。结果 RT-PCR检测示,3周后C、E组ColⅠ基因表达呈显著下降趋势,4、5周时A组显著高于C、E组(P<0.05),3～6周A组显著高于B、D组(P<0.05);B、C组3、4周时及D、E组3周时比较,差异有统计学意义(P<0.05)。C、E组3周后ColⅡ、ColⅩ基因表达均逐渐下降,4～6周时显著低于A组(P<0.05);B、D组各时间点两基因表达均未见显著升高,与A组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。A组各时间点MMP-13均未见明显表达,3周时B组与A、C组比较差异有统计学意义(P<0.05),D组显著高于A、E组(P<0.05)。随着时间延长A组ALP活性逐渐升高,4周后C、E组显著下降,均低于A组(P<0.05);B、C组间及D、E组间比较,仅在2、3周时差异有统计学意义(P<0.05)。DMMB染色显示6周时A组软骨陷窝明显,其余各组软骨陷窝明显较少。结论 bFGF和PHTrP能通过改变软骨细胞外基质的合成和分解,抑制TGF-β1诱导的兔BMSCs向软骨细胞分化。这种抑制作用不仅通过抑制ColⅩ基因表达而实现,可能还通过抑制其他软骨分化相关蛋白实现。     

不同浓度葡萄糖对滑膜间充质干细胞成软骨能力调节作用的研究

目的研究分化前阶段不同浓度葡萄糖对滑膜间充质干细胞(SMSCs)成软骨能力的调节作用,并探究其分子调节机制。方法将分化前阶段SMSCs分组置于含有不同浓度葡萄糖的培养基中进行增殖培养:一组采用低浓度(1.0 g/L)葡萄糖培养SMSCs(LGMSMCs);另一组采用高浓度(4.5 g/L)葡萄糖培养SMSCs(HGMSMCs)。增殖培养7 d后,将两组SMSCs同时进行成软骨诱导分化,通过检测软骨标志基因的表达水平来评价两组SMSCs成软骨能力的大小;通过分析转化生长因子-β(TGF-β)和蛋白激酶-C(PKC)信号通路系统来研究其分子调节机制;设置平行实验,在高糖培养的SMSCs中加入PKC抑制剂G6983进一步研究TGF-β和PKC信号通路系统。不同浓度的葡萄糖培养基中分化前DNA总量,分化前、分化阶段的SMCSs成软骨相关基因的表达比较采用成组t检验。结果 SMSCs培养第21天,HGMSMCs组的蛋白聚糖(AGN)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)及Ⅱ型胶原(ColⅡ)的表达明显少于LGMSMCs组的(t=-3.69,P0.05;t=-77.57,P0.01;t=-34.42,P0.01);在SMSCs分化前阶段,GMSMCs组的TGF-βⅡ型受体(TGFβ-RⅡ)的表达明显高于LGMSMCs组的(t=4.5,P0.01);在SMSCs分化阶段,GMSMCs组的PKC磷酸化水平及TGF-βⅡ型受体(TGFβ-RⅡ)的表达明显低于LGMSMCs组的(t=-5.84,P0.01;t=-4.79,P0.01)。另外,在平行实验中,SMSCs分化前阶段,往高糖培养的SMSCs中加入PKC抑制剂G6983较未加入抑制剂更能上调SMSCs在分化阶段TGFβ-RⅡ的表达水平(t=-1.03,P0.05)。结论在SMSCs分化前阶段,低糖培养可以增加SMSCs成软骨能力;其分子机制是葡萄糖对分化前阶段TGF-β和PKC信号通路进行调节,进而调节分化阶段SMSCs成软骨能力。     

生长分化因子5促进软骨细胞肥大成熟的实验研究

[目的]探讨生长分化因子5(GDF-5)在诱导成人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成软骨分化的同时,促进其肥大成熟的作用.[方法]体外分离培养hBMSCs,取第四代细胞实验.将细胞消化、悬浮,以5×106/ml的细胞密度进行高密度培养,分别用含0.500ng/ml GDF-5的软骨诱导液(CM)诱导培养3、4周.免疫组化、甲苯胺蓝染色检测Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和蛋白多糖的表达情况.荧光实时定量RT-PCR检测两组微团Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和蛋白多糖mRNA的表达情况.[结果]实验组微团中的细胞体积较对照组稍大,细胞密度稍低.甲苯胺蓝和免疫组化染色结果显示各组微团均有Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和蛋白多糖的表达和分泌,且4周实验组的表达最为强烈.荧光实时定量RT-PCR检测示,干预后3周实验组Ⅱ型胶原、蛋白多糖基因表达量明显高于3周对照组(P＜0.05),但Ⅹ型胶原基因表达与对照组相比无显著性差异(P＞0.05);干预后4周实验组Ⅹ型胶原基因表达高于其余各组(P＜0.05),Ⅱ型胶原、蛋白多糖基因表达明显高于两对照组(P＜0.05),但与3周实验组相比较,差异无统计学意义(P＞0.05).[结论]GDF-5在诱导细胞成软骨分化的同时,还可促进其成熟肥大.     

β1转化生长因子浓度对体外诱导骨髓间充质细胞构建软骨的影响

目的 探讨β1转化生长因子（TGF-β1）浓度对体外诱导猪骨髓间充质细胞（BMSCs）构建组织工程化软骨的影响，明确TGF-β1诱导剂量对细胞分化的作用，为体外软骨构建提供适宜的诱导因子应用浓度参数。方法 抽取8周龄猪髂嵴骨髓，应用贴壁法分选单个核细胞，体外培养扩增后获得BMSCs，收集第2代细胞，以5×10^7个／cm。细胞的密度接种到聚羟基乙酸（PGA）制成的圆柱形三维支架材料上（直径5mm，厚度2mm），7d后应用不同浓度TGFβ1（A组：5ng／ml、B组：10ng／ml、C组：20ng／ml、D组：50ng／m1）与IGF-1（50ng／m1）及地塞米松（40ng／m1）组成诱导剂，分别进行体外诱导培养。8周后取材行大体观察，体积、湿重及聚合蛋白多糖（GAG）定量，组织学及Ⅱ型胶原免疫组织化学等检测。结果 B、C、D组形成细胞材料复合物组织学结构较为类似，有明显的软骨陷窝，分布有大量Ⅱ型胶原及GAG；A组软骨陷窝结构较少，胞外基质染色较浅。B、C、D组的组织湿重、体积和GAG含量均明显高于A组。结论 诱导三维支架上的BMSCs体外构建组织工程化软骨过程中，10ng／ml的TGF-β1诱导浓度具有良好的促分化效能，TGF-1的促分化作用并未表现出明显的剂量依赖性。     

骨髓基质干细胞体外分化软骨细胞的实验研究

目的 探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)对兔骨髓基质干细胞(BMSC)体外增殖、分化为软骨样细胞的影响。方法 24只兔等分为4组,抽取骨髓,分离基质干细胞,体外连续传代培养,A组为基础培养液,B、C、D组分别加入TGF-β1、b-FGF、TGF-β1和b-FGF,观察细胞生长情况及形态特征,阿新蓝染色,Ⅱ型胶原mRNA表达情况。结果B组细胞形态变化、C组增殖速度、D组增殖速度及形态变化均较A组加快。阿新蓝染色:原代阴性,传代细胞,A、c组淡染或阴性,B组呈蓝色,D组呈深蓝色。Ⅱ型胶原mRNA表达:A、c组未检出,B组阳性,D组有较强阳性表达。结论 兔BMSC在体外适当条件下可分化为软骨样细胞,TGF-β1能诱导BMSC向软骨方向分化,b-FGF不仅能促进BMSC的增殖,且能延长其生存时间。     

骨形态发生蛋白2和富血小板血浆凝胶对兔骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的影响

目的观察富血小板血浆(PRP)凝胶及腺病毒介导的骨形态发生蛋白2(BMP-2)基因转染对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外成软骨分化的影响。方法取新西兰大白兔骨髓培养BMSCs,抽取静脉血制备PRP,以Ad-GFP-hBMP-2(BMP-2-BMSCs组)及Ad-GFP(对照组)转染的BMSCs分别与PRP凝胶复合,继续培养。用扫描电镜、MTT检测PRP凝胶的生物相容性,RT-PCR检测各组的Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、蛋白聚糖、SOX-9表达。结果扫描电镜及MTT检测证实PRP凝胶具有良好的生物相容性。RT-PCR分析表明,单层培养的BMP-2-BMSCs组的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和SOX-9的表达水平均高于对照组(P0.05),但Ⅰ型胶原表达水平较对照组明显下降(P0.05),同时Ⅹ型胶原表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P0.05);与PRP复合后,BMP-2-BMSCs组的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和SOX-9表达水平较对照组升高(P0.05),而Ⅰ型胶原和Ⅹ型胶原表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论转染BMP-2的BMSCs在PRP凝胶中生长良好,BMP-2基因转染能促进BMSCs的体外成软骨分化。     

旋转微重力细胞培养系统下Indianhedgehogd转染兔BMSCs促进成软骨分化并抑制老化的实验研究

目的探讨模拟微重力环境下,Indianhedgehog(IHH)基因过表达对兔BMSCs成软骨分化的影响。方法取第2代兔BMSCs,分为旋转微重力细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)组和传统组2个大组,每个大组进一步分为3个亚组,即IHH基因腺病毒载体转染组(RCCS 1组和传统1组)、绿色荧光蛋白腺病毒载体转染组(RCCS 2组和传统2组)及空白对照组(RCCS 3组和传统3组)。RCCS组细胞均在模拟微重力环境下进行成软骨细胞诱导分化;常规组在6孔板中进行常规细胞培养及成软骨细胞诱导分化。诱导分化过程中,检测IHH蛋白表达(ELISA法)及ALP活性;实时荧光定量PCR检测软骨及软骨肥大相关基因表达;Wertern blot法检测Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖(aggrecan,ANCN)蛋白表达;并取细胞爬片行甲苯胺蓝染色及膜联蛋白V(Annexin V)-cy3免疫荧光染色观察。结果转染后荧光显微镜下RCCS 1、2组可见明显绿色荧光,转染效率约95%。ELISA检测示,RCCS及传统1组IHH蛋白均明显高于2、3组(P0.05);传统1组各时间点ALP活性均高于传统2、3组(P0.05),RCCS 1组ALP活性仅于诱导分化3、7 d稍高于RCCS 2、3组(P0.05)。实时荧光定量PCR检测示,传统1组在诱导分化早期高表达Ⅱ型胶原、ANCN,但在后期高表达Ⅹ型胶原、ALP及AnnexinⅤ(P0.05);RCCS1组在诱导分化各时期均高表达软骨相关基因Ⅱ型胶原、ANCN、SOX9,且低表达软骨肥大相关基因Ⅹ型胶原、ALP及AnnexinⅤ(P0.05)。Wertern blot法检测示,诱导21 d时传统1组Ⅱ型胶原蛋白表达量明显低于传统2、3组(P0.05);RCCS 1组各时间点Ⅱ型胶原、ANCN蛋白表达量均明显高于RCCS 2、3组(P0.05)。甲苯胺蓝染色示,诱导21 d时传统1组染色浅于传统2、3组,RCCS 1组各时间点染色均明显深于RCCS 2、3组;Annexin V-cy3免疫荧光染色示,各时间点传统1组红色荧光均强于传统2、3组,RCCS各亚组红色荧光表达均较弱且组间无明显差异。结论在模拟微重力环境下,IHH基因转染BMSCs可有效促进软骨生成,并抑制软骨老化或向成骨发展,适合软骨组织工程的需要。     

软骨PLGA-Ⅱ型胶原支架复合体修复兔膝关节骨软骨损伤

目的探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导的软骨细胞与聚乙醇酸-乳酸共聚物(PLGA)-Ⅱ型胶原支架通过管帽结构复合构建组织工程软骨复合体修复兔膝关节骨软骨损伤的效果及各界面耦合情况。方法BMSCs经软骨诱导液诱导成软骨细胞后接种于PLGA-Ⅱ型胶原支架的底层,支架表层戴管帽。将该细胞-支架复合物置入软骨条件培养液中培养2周,扫描电镜观察。将45只新西兰大白兔随机分为A、B、C 3组,每组15只,并于股骨髁处造模。分别于缺损处植入戴管帽结构复合的软骨支架复合体(A组)、PLGA-Ⅱ型胶原支架(B组)、不植入任何材料(C组)。于第4周和第12周取材行大体观察和组织学分析。结果 A组和B组缺损处均有软骨生成;C组缺损明显,只有纤维组织生长。A组软骨缺损部分软骨细胞修复,成骨区部分骨样细胞修复;两者耦合处犬牙交错,修复缺损程度及成骨区和成软骨区界面耦合情况明显优于B、C组。软骨组织学评分A组优于B、C组(P0.05)。结论 BMSCs诱导分化成的软骨细胞与PLGA-Ⅱ型胶原支架经过管帽结构构建成的软骨PLGA-Ⅱ型胶原支架复合体可有效修复兔膝关节骨软骨损伤,新生软骨、骨与宿主软骨、骨及新生软骨与软骨下骨各界面耦合良好。     

生长分化因子7体外促进BMSCs向肌腱细胞分化的研究

目的探讨生长分化因子7(growth differentiation factor7,GDF-7)在体外能否促进BMSCs向肌腱细胞分化,为改善BMSCs修复肌腱疗效提供依据。方法采用密度梯度离心法从绿荧光大鼠骨髓组织中分离培养BMSCs,通过成骨、成脂和成软骨分化鉴定其多向分化能力。取第3代BMSCs根据成肌腱培养液中加入不同浓度GDF-7(0、12.5、25.0、50.0ng/mL),分为A、B、C、D组。体外诱导培养2周后,实时荧光定量PCR检测各组scleraxis、tenomodulin、tenascinC和Ⅰ型胶原mRNA表达,免疫细胞化学染色观察tenomodulin、tenascinC和Ⅰ型胶原蛋白表达,Western blot法检测A、C组tenomodulin蛋白的表达。结果经鉴定,分离培养的BMSCs具有成骨、成脂和成软骨分化的多向分化能力。实时荧光定量PCR检测结果示,B、C、D组的tenomodulin mRNA表达分别较A组增加了2.85、3.41、3.07倍(P<0.05),scleraxis mRNA表达增加了2.13、1.50、2.56倍(P<0.05),tenascin C mRNA表达增加了2.45、2.86、1.88倍(P<0.05),但B、C、D组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。B、C组Ⅰ型胶原mRNA表达较A组分别增高了1.92和2.45倍(P<0.05);D组较A组有所增高,但差异无统计学意义(P>0.05)。免疫细胞化学染色示,B、C、D组均有tenomodulin、tenascin C和Ⅰ型胶原蛋白表达,而A组均未表达;除C组Ⅰ型胶原表达高于B、D组外,其他蛋白表达B、C、D组间无明显差异。Western blot检测示C组比A组有更高的tenomodulin蛋白表达。结论 GDF-7在体外能促进大鼠BMSCs向肌腱细胞分化。     

淫羊藿苷治疗小鼠骨关节炎后血清学及组织学改变的实验研究

目的通过早期和晚期应用淫羊藿苷(icariin,ICA)治疗小鼠骨关节炎(osteoarthritis,OA),观察ICA对小鼠血清骨代谢标志物以及软骨和软骨下骨组织形态学的影响。方法取80只8周龄雄性C57BL/6J小鼠,随机分为8组,每组10只,分别为假手术/早期生理盐水组(A组)、假手术/早期ICA组(B组)、前交叉韧带切断术(anterior cruciate ligament transaction,ACLT)/早期生理盐水组(C组)、ACLT/早期ICA组(D组)、假手术/晚期生理盐水组(E组)、假手术/晚期ICA组(F组)、ACLT/晚期生理盐水组(G组)、ACLT/晚期ICA组(H组)。各组小鼠对应给予ACLT或单纯打开关节囊处理后,B、D组于术后第1天开始,F、H组于第4周开始,每天采用灌胃方式给予小鼠ICA(10 mg/kg)至第8周;A、C组及E、G组于对应相同时间点给予相同体积生理盐水。于术后第8周收集小鼠全血制备血清,采用ELISA法测定血清中骨代谢标志物及细胞因子的含量,包括Ⅰ型胶原C末端肽(C-telopeptide of typeⅠcollagen,CTX)、骨钙素(osteocalcin,OC)、IL-6、TNF-α、IL-1β。同时切取膝关节组织行阿辛蓝/苏木精-酸性橙G染色,观察软骨及软骨下骨形态改变,并进行骨关节炎国际研究学会(OARSI)评分。结果早期给药组(A、B、C、D组)间比较:与A、B组相比,C组CTX、OC含量显著降低(P0.05),IL-6、TNF-α、IL-1β含量升高(P0.05),OARSI评分显著升高(P0.05);与C组相比,D组CTX、OC含量升高(P0.05),IL-6含量显著降低(P0.05),TNF-α、IL-1β含量差异无统计学意义(P0.05),OARSI评分降低(P0.05),组织学观察显示胫骨软骨缺失程度明显改善。晚期给药组(E、F、G、H组)间比较:与E、F组比较,G组CTX、OC含量显著降低(P0.05),IL-6、TNF-α、IL-1β含量升高(P0.05),OARSI评分显著升高(P0.05);与G组比较,H组CTX含量升高(P0.05),OC、IL-6、TNF-α、IL-1β含量差异无统计学意义(P0.05),OARSI评分无明显变化(P0.05),组织学观察显示胫骨软骨缺失程度相似。结论 ICA对透明软骨、钙化软骨及软骨下骨均有保护作用,并且能在一定程度上改善OA软骨下骨的骨重建,且ICA对OA早期干预作用更明显。