脐带间充质干细胞对皮肤创伤愈合影响的实验研究

目的:探讨脐带间充质干细胞(MSCs)对皮肤创伤愈合影响的实验研究。方法:在重度烧伤大鼠中抽取80例作为研究对象,从脐血内分离出MSCs,依据随机数字法分为MSCs胶原凝胶组、单纯MSCs组、胶原凝胶组和生理盐水组各20例,对其进行GFP荧光检测、FISH原位杂交检验、Western Blotting、Real-Time PCR检验创面组织内VEGF、Ang-1、Ang-2、Tie-1and-2Receptor Tyrosine Kinases基因与蛋白表达、血管生成情况。结果:相较于单纯MSCs组、胶原凝胶组和生理盐水组,MSCs胶原凝胶组皮肤愈合率最高(P0.05),且Ang-1、Ang-2、Tie-1and-2Receptor Tyrosine Kinases基因与蛋白表达最强(均P0.05),MVD数量最多(P0.05)。结论:脐带间充质干细胞应用于皮肤创伤移植,可促使创伤表面的新愈细胞修复和重建,提升创面愈合率,并改善创面愈合效果。     

同一供者及不同供者的人胎盘MSCs与脐静脉内皮细胞复合培养的比较研究北大核心CSCD

目的比较同一供者及不同供者的人胎盘MSCs(human placenta-derived MSCs,HPMSCs)与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)三维复合培养效果,为体外构建三维血管化组织工程骨提供实验依据。方法取健康足月产妇自愿捐赠的胎盘及脐带组织,采用Ⅳ型胶原酶消化和人淋巴细胞分层液密度梯度离心法分离培养HPMSCs,通过流式细胞学检测细胞表型,取第2代细胞向成骨细胞诱导培养鉴定;以Ⅰ型胶原酶消化分离培养HUVECs,通过Ⅷ因子相关抗原因子免疫组织化学染色进行鉴定。实验分为两组,A组取不同供者的第3代HUVECs和成骨诱导培养3周的第3代HPMSCs以1∶1比例复合种植于胶原水凝胶,制备细胞-胶原水凝胶复合物;B组将同一供者的以上两种细胞同法复合制备复合物。复合培养第1、3、5、7天取材,行CD31免疫荧光染色,于激光共聚焦显微镜下观察其成血管倾向,测量复合物中的索道长度和节点数,并进行统计学分析。结果经鉴定,成功分离培养HPMSCs及HUVECs。CD31免疫荧光染色示,与A组相比,B组细胞-胶原水凝胶复合物中的HUVECs可在三维空间上较早、较好地伸展,在水凝胶内部相互交织能力较强,形成的索道更长,节点更多,网络更密集。第7天时B组索道长度和节点数分别为(8.11±0.62)mm/mm2及(21.30±1.41)个/mm2,显著优于A组的(6.68±0.35)mm/mm2及(17.10±1.10)个/mm2,差异均有统计学意义(t=0.894,P=0.000;t=0.732,P=0.000)。结论将同一供者的HPMSCs与HUVECs体外复合种植于胶原水凝胶支架上,比不同供者来源的细胞形成的网络成血管倾向更明显,交织连续性好,层次丰富。     

两性离子水凝胶敷料用于压疮创面的实验研究

目的观察两性离子(含磺酸甜菜碱甲基丙烯酸酯,SBMA)水凝胶敷料对大鼠压疮创面愈合的影响。方法取24只SD大鼠,根据压疮缺血-再灌注原理制作压疮模型。按随机数字表法将模型大鼠分为NS组、PEG组和SBMA组,每组8只,去除创面坏死组织后,分别采用生理盐水、含聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEG)水凝胶和两性离子水凝胶敷料处理创面,干预后第4、7、10、14天观察创面面积,干预后第7、14天观察组织结构及胶原沉积情况、免疫组织化学观察CD31、VEGF、Ki67、CK10表达。结果 SBMA组创面愈合率在各时间点显著高于其他两组(均P<0.05),且PEG组高于NS组(均P<0.05);干预后第7天SBMA组CD31、VEGF表达水平最高(P<0.05),第14天CD31、VEGF表达水平有所下降;上皮组织Ki67表达水平逐渐上升,SBMA组上升最快,PEG组次之,NS组最慢;三组均在第14天出现创面上皮化,相较于其他两组,SBMA组表皮分化程度最高。结论两性离子水凝胶敷料在促进压疮创面血管生成和再上皮化方面具有一定优势,能促进压疮创面愈合。     

磷酸钙骨水泥复合物/脐带间充质干细胞凝胶构建组织工程骨

目的构建新型可注射强化型磷酸钙骨水泥复合物/脐带间充质干细胞凝胶组织工程骨,探讨其力学性能,细胞活性和成骨作用。方法选用第四代hUCMSCs,1.2%海藻酸钠水凝胶构建hUCMSCs水凝胶微球。高温煅烧钙/磷比约为1.9的磷酸氢钙和碳酸钙混合物,按摩尔质量比以1：1混合制备CPC粉末。15%Chitosan,8mm长度可吸收纤维用于提高CPC复合物力学强度。实验组分为四组：（1）单纯hUCMSCs微球;（2）CPC＋hUCMSCs微球;（3）CPC＋chitosan＋hUCMSCs微球;（4）CPC＋chitosan＋可吸收纤维＋hUCMSCs微球,分别检测力学性能,细胞活性和成骨作用。结果新型组织工程骨力学性能显著增强,抗弯曲强度提高到（11.7±2.1）MPa,弹性模量提高到（2.0±0.4）GPa,断裂功提高到（1.65±0.66）kj/m2（P〈0.05）。hUCMSCs的ALP活性第7天时明显增高,第14天时达峰,第21天时有所减弱,各组间比较无明显统计学差异（P〉0.1）。第7天时,所有实验组中的hUCMSCs均见少量矿物合成。第14天和第21天时,矿物合成数量明显增多。hUCMSCs中ALP基因表达培养第1天最低,第4天达峰,第8天时稍减弱。OC基因表达第8天达峰。结论构建完成新型可注射强化型磷酸钙骨水泥/脐带间充质干细胞凝胶构建组织工程骨。水凝胶微球中hUCMSCs在CPC中具有良好的成骨作用。CPC-chitosan-可吸收纤维组织工程骨力学性能满足松质骨力学要求,支持水凝胶微球中hUCMSCs的细胞活性和成骨作用。为组织工程骨研究和临床应用提供新思路和新方法。     

骨髓间充质干细胞分化为皮肤附属器细胞的初步实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs)分化为创面皮肤附属器细胞的可能性,及其参与创面修复的可能机制。方法无菌条件下取Wistar大鼠股骨骨髓细胞,密度梯度离心分离、纯化MSCs,体外培养扩增后,用BrdU标记细胞。另于同种雄性Wistar大鼠背部正中,制备1cm×1cm全厚皮肤缺损创面模型,将BrdU标记的1×106/mlMSCs从阴茎静脉输注,术后第3天与第7天切取创面组织,行BrdU免疫组织化学单染色,以及BrdU和广谱角蛋白免疫组织化学双染色。结果BrdU阳性细胞出现在创面皮下组织、皮脂腺、毛囊和骨髓腔中。免疫组织化学双染色结果显示,皮脂腺和毛囊有BrdU阳性细胞,同时表达广谱角蛋白。结论创面愈合过程中,MSCs归巢并参与创面修复;在实验性全身皮肤缺损创面微环境下,MSCs可分化为皮肤附属器细胞。     

脂肪干细胞来源外泌体促进糖尿病小鼠创面愈合的实验研究

目的探讨脂肪干细胞来源外泌体(adipose-derived stem cell released exosomes,ADSC-Exos)对糖尿病小鼠创面愈合的影响。方法取患者自愿捐赠脂肪组织,采用酶消化法分离培养ADSCs,并于第3代细胞上清液提取Exos(ADSC-Exos);透射电镜观察ADSC-Exos形态,Western blot检测膜表面标志性蛋白Alix、CD63,纳米颗粒跟踪分析仪检测粒径分布。取患者自愿捐赠皮肤组织,采用酶消化法分离培养成纤维细胞。将PKH26标记的ADSC-Exos与第5代成纤维细胞培养,共聚焦荧光显微镜观察其能否进入细胞,采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)及划痕法观察ADSC-Exos对成纤维细胞增殖及迁移的影响。取24只8周龄Balb/c雄性小鼠制备糖尿病模型后,背部制备直径8 mm全层皮肤缺损创面,实验组(n=12)及对照组(n=12)创面真皮层分别注射0.2 mL ADSC-Exos及PBS。第1、4、7、11、16、21天大体观察创面愈合情况,计算创面愈合率;第7、14、21天取材,行组织学(HE及Masson)及CD31免疫组织化学染色,观察创面结构、胶原纤维及新生血管情况。结果ADSC-Exos为边缘清晰、大小分布均匀的膜性囊泡;粒径为40~200 nm,平均102.1 nm;膜表面标志性蛋白Alix、CD63均呈阳性。ADSC-Exos与成纤维细胞复合培养观察示,ADSC-Exos可进入成纤维细胞胞内,并能促进成纤维细胞增殖及迁移。动物实验显示,实验组小鼠背部创面愈合明显快于对照组,各时间点创面愈合率差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,实验组创面结构愈合更好,愈合前期新生微血管更多,愈合后期胶原纤维沉积更多;其中,第7、14、21天创面缺损长度,第7、14天微血管数量,第14、21天胶原纤维沉积百分比,组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论ADSC-Exos通过促进创面血管新生以及成纤维细胞增殖、迁移和胶原合成来促进糖尿病小鼠创面愈合。     

胰岛素基因转染的人脐带间充质干细胞与丝素蛋白支架构建组织工程脂肪的研究

目的 探讨携带重组人胰岛素基因慢病毒载体转染的人脐带间充质干细细( human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)与丝素蛋白支架在体外构建组织工程化脂肪(tissue engineering adipose)的可行性.方法 以最适感染复数(MOI)为10重组慢病毒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP转染hUCMSCs组为实验组(A组),EGFP基因转染组为对照组(B组);将两组细胞接种于丝素蛋白支架,观察细胞在支架上的生长及黏附情况;尔后行细胞-支架复合物成脂诱导.四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测重组慢病毒转染对hUCMSCs生长增殖的影响以及基因转染后的hUCMSCs在丝素蛋白支架上的活性.结果 细胞-支架复合物成脂诱导5～7 d后,见A组支架内脂肪样细胞数量明显多于B组,差异有显著统计学意义(P=0.007,P＜0.01);逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测显示,A组hUCMSCs表达的成脂特异性基因PPARγ-2明显高于B组.MTT法检测结果显示,转染重组慢病毒的hUCMSCs与未转染组各时间点吸光度A值比较,差异均无统计学意义(P=0.056,P＞0.05).细胞组与细胞支架组A值比较,差异无统计学意义(P=0.066,P＞0.05).结论 转染胰岛素基因的hUCMSCs成脂分化能力明显提高,且能有效地与丝素蛋白支架在体外构建组织工程化脂肪.     

VEGF165-胰岛素复合凝胶对糖尿病大鼠局部深Ⅱ度烫伤创面MVD及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响

目的:制备外用VEGF165-胰岛素复合凝胶并观察其对糖尿病大鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合的作用。方法:以新型凝胶卡波姆980为基质,分别加入VEGF165、胰岛素,分别配制成胰岛素凝胶、VEGF165凝胶、VEGF165-胰岛素复合凝胶和空白对照凝胶。观察各组凝胶性状,检测其p H值。75只SPF级雄性Wistar大鼠,体重190~290g,随机分为正常对照组、糖尿病对照组、胰岛素凝胶组、VEGF165凝胶组、VEGF165-胰岛素复合凝胶组,每组15只。各组大鼠禁食12h后,除正常对照组外,其余各组一次性腹腔注射链脲佐菌素(55 mg/kg)制备1型糖尿病模型,正常对照组大鼠注射相同剂量柠檬酸钠缓冲液。1型糖尿病大鼠造模成功后,采用恒温水浴箱80℃,制备深Ⅱ度烫伤模型。正常对照组、糖尿病对照组创面外敷空白凝胶基质,其余各组外敷对应凝胶制剂,每天换药1次。深Ⅱ度烫伤造模成功后观察各组大鼠存活情况,于3、7、11、15、21天时点观察糖尿病大鼠创面愈合情况并计算创面愈合率,在各时点随机处死每组3只大鼠取烫伤皮肤全层留取标本,行组织学切片及免疫组化染色观察各时点炎性细胞,微血管形成及胶原蛋白。结果:制备的各组凝胶透明,保湿性极佳,黏附性良好,便于涂抹及清洗,无组织毒性。各组大鼠无感染及死亡发生。3天后烫伤各组创面无明显缩小,7、11、15、21天时,VEGF165-胰岛素复合凝胶组创面愈合率最高,糖尿病组最低。VEGF165-胰岛素复合凝胶组愈合率与其余各组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。病理切片观察示各时点VEGF165-胰岛素复合凝胶组肉芽组织形成及上皮化均优于其余各组。免疫组化染色示各组微血管数量、Ⅰ型胶原蛋白阳性率均于3天开始表达,且随时间阳性细胞增多明显;各时间点VEGF165-胰岛素复合凝胶组微血管密度及Ⅰ型胶原蛋白最高,糖尿病组最低,与其余各组比较以及VEGF165-胰岛素复合凝胶组、糖尿病组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论:糖尿病大鼠皮肤深Ⅱ度烫伤外用VEGF165-胰岛素复合凝胶对创面愈合有明显的促进作用     

壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵复合人脐带间充质干细胞用于异位成骨的实验研究

目的通过构建壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵,与人脐带间充质干细胞(human umbilical cordmesenchymal stem cells,hUCMSCs)复合构建组织工程骨并行成骨诱导培养,探讨其异位成骨效果,为骨组织工程寻找理想支架材料。方法在壳聚糖分子中引入亚磷酸根基团,制备亚磷酸化壳聚糖,并进行表征。分别将浓度为2%的壳聚糖和亚磷酸化壳聚糖溶液,按1∶1体积比混合均匀,构建壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵;然后在模拟体液中进行原位矿化,通过扫描电镜观察矿化前后复合海绵的结构。用酶消化法分离培养hUCMSCs,取生长良好的第3代细胞与壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵复合培养,构建细胞-支架复合物,并行成骨诱导培养。成骨诱导培养1、2周,分别于光镜及扫描电镜下观察细胞黏附情况;培养1、2、3、4、5、6 d时,MTT法分析细胞增殖情况。取3～4月龄新西兰大白兔40只,雌雄不限,体重2.1～3.2 kg,平均2.5 kg;制备双侧竖脊肌肌袋,在每只兔右侧肌袋内植入细胞-支架复合物(A组,n=40),于其中20只兔左侧肌袋植入壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵(B组,n=20),剩余20只兔左侧肌袋不植入材料(C组,n=20)。术后观察动物一般情况,4周后处死动物取材,行大体及组织学观察。结果亚磷酸化壳聚糖分析表明亚磷酸化反应主要发生在羟基上,其质子类型和化学位移强度与化学结构一致。扫描电镜观察到壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵孔洞均匀,孔壁较薄;原位矿化后孔壁表面有钙磷涂层,晶体颗粒生成;细胞在壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵支架上黏附、生长良好。体内实验大体观察A组可见细胞-支架复合物大小、形态基本保持原状,质地有所增韧,材料周围有薄层结缔样组织;B组复合海绵体积缩小,质地松软;C组肌袋手术创口已愈合。组织学观察A组支架材料部分吸收,边缘有均质类骨物质出现,并见成骨细胞;B组植入区形成圆形空腔,残留壳聚糖支架网络;C组创面基本愈合,肌肉纤维间可见少量淋巴细胞浸润。结论壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵是一种具有良好生物相容性的支架材料,与hUCMSCs复合构建的组织工程骨在兔体内可异位成骨。     

脂肪干细胞-透明质酸复合物促进放射性复合损伤创面愈合的初步研究

目的将脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)作为种子细胞,以透明质酸(hyaluronic acid,HA)作为载体制备复合物,观察分析其对放射性复合损伤创面愈合的影响。方法取10只近交系SD大鼠双侧腹股沟部脂肪组织,采用酶消化法分离培养ADSCs,取第6代细胞与HA(10 mg/mL)混合均匀,制备密度为5×106个/mL的ADSCs-HA复合物。取30只近交系SD大鼠,雌雄各半,随机分为3组(n=10)。首先在3组大鼠背部制备2 cm×2 cm的皮肤全层缺损创面并行20 Gy 60Co辐照,制备放射性复合损伤模型。模型制备后1周,创面彻底清创后,A组覆盖凡士林纱布,B组创面滴加HA 0.4 mL并覆盖凡士林纱布,C组创面滴加ADSCs-HA复合物0.4 mL并覆盖凡士林纱布。于治疗后观察各组创面情况,并于第1、2、3、4周取创面标本行HE染色观察微血管密度,免疫组织化学染色观察CD90阳性细胞的分布情况。结果 A组创面愈合缓慢,第4周时仍以肉芽组织为主;B组创面愈合较A组快,第4周时创面中央呈凹陷样,未完全愈合;C组创面第4周时完全愈合,无明显凹陷,边缘见增厚的表皮。组织学观察示,C组第1、2、3周微血管密度均高于A、B组(P<0.05),第3周时B组明显高于A组(P<0.05)。第4周时,C组与B组比较差异无统计学意义(P>0.05),但这两组仍明显高于A组(P<0.05)。免疫组织化学染色示各时间点A、B组创面均未见CD90阳性细胞,C组CD90阳性细胞随时间延长逐渐减少。结论 ADSCs-HA复合物通过促进并调控大鼠放射性复合损伤创面微血管的新生,加速创面修复。     

海藻酸钙敷料对大鼠创面愈合影响的组织学研究

目的：探讨海藻酸钙敷料对大鼠创面愈合的影响。方法：48只雄性SD大鼠随机分为实验组和对照组,每组24只。制作大鼠背部全层皮肤缺损模型,在创面局部以海藻酸钙敷料（实验组）或干棉纱布（对照组）包扎,观察伤后3、7、14 d创面愈合率的变化;于伤后3、7、14 d取创面组织,石蜡包埋、切片、分别行HE和Masson染色,计算血管横断面面积与肉芽组织面积的比值、肉芽组织厚度和胶原蛋白含量（胶原面积与创面面积比值）。结果：术后第3天时实验组大鼠较对照组创面愈合率明显增加（P〈0.05）。术后第3天实验组与对照组肉芽组织厚度[分别为（1 540.0±118.5）μm和（1 504.6±131.8）μm,P〉0.05]和新生肉芽组织血管面积与肉芽组织面积之比[分别为0.118±0.007和0.113±0.007,P〉0.05）差异均无显著性,但术后3 d实验组胶原蛋白面积较对照组明显增多[分别为（45.7±5.3）%和（11.6±2.5）%,P〈0.05];术后第7天实验组以上指标均高于对照组（P〈0.05）,第14天时这种趋势依然存在（P〈0.05）。结论：海藻酸钙能提高伤口皮肤组织内的胶原蛋白含量,加速创面肉芽组织形成,促进伤口的愈合。     

羊膜负载骨髓间充质干细胞与表皮细胞对放创性皮肤损伤促愈合研究

目的探讨治疗放创性全厚皮肤缺损创面的方法及效果. 方法贵州小香猪8只,每只背部脊柱两侧均有放创性全层皮肤缺损圆形创面(Ф3.67cm)各3个,共48个创面.将经处理的人羊膜(human amniotic mambrane, HAM)分别负载自体骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)和表皮细胞,移植到其左侧24个创面作为实验组(A组);以单纯无种植细胞的HAM敷盖其右侧前16个创面(B组);以单纯油纱布敷盖其右侧后8个创面(C组).B、C作为对照组.观察移植后1～3周内各组创面愈合、肉芽组织生长及上皮化等情况,并进行创面组织HE染色及vWF免疫组织化学检测.用图像分析法测算各组各时间点创面平均面积(cm2),并计算其愈合百分率. 结果 C组于伤后 22～23天愈合,B组于伤后19～21天愈合;A组于伤后15～17天愈合,较B、C组分别提前6～7天和5～6天,愈合质量好.移植15～17天,A组与B、C组创面平均残留面积及愈合面积百分率比较,差异有统计学意义(P＜0.01). A组创面的新生上皮已完全覆盖整个创面,肉芽组织生长旺盛,肉芽组织中vWF、成纤维细胞和毛细血管含量丰富,可见胶原沉积;B、C组创面仍见许多炎性细胞浸润,肉芽组织中vWF、成纤维细胞和毛细血管含量少,胶原沉积不明显. 结论 HAM负载自体MSCs和表皮细胞植入对放创性全厚皮肤缺损创面有较好的促愈合作用,愈合质量较高.     

康复新凝胶剂对小鼠创面组织修复的作用及相关机制探讨

目的:观察康复新凝胶剂对小鼠皮肤创面损伤的作用,并探讨其可能的作用机制。方法:60只C57BL/6J小鼠随机分成模型组、康复新凝胶剂组(凝胶剂组)、林可霉素利多卡因凝胶剂组(林可霉素组),每组20只,采用全层皮肤切除法在C57BL/6J小鼠背部制备伤口,伤口造模后开始按组对应给药10d;于治疗第3、7、10天拍照观察伤口图像并计算创面愈合率;酶联免疫吸附法(ELISA)检测血液中白细胞介素-6(IL-6)与转化生长因子-β(TGF-β)的含量;于治疗后第10天处死各组小鼠,苏木精-伊红染色法(HE)观察创面组织变化;免疫组化染色检测创面组织血管内皮生长因子(VEGF)、M1型巨噬细胞标志物(iNOS)与M2型巨噬细胞标志物(CD206)蛋白表达;荧光定量PCR(qRT-PCR)检测创面组织中IL-6、TGF-β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与白细胞介素-10(IL-10)mRNA表达水平。结果:与模型组比较,康复新凝胶剂组小鼠于治疗后第3、7、10天伤口愈合较为明显,创面愈合率显著增加,差异有统计学意义(P0.05);血清中IL-6含量显著下降且TGF-β含量显著升高(P0.05)。治疗10d后,与模型组比较,康复新凝胶剂组小鼠创面炎性细胞浸润明显,新生致密肉芽组织,有大量新生毛细血管形成,同时VEGF阳性表达率显著增加(P0.05),IL-6、TNF-αmRNA表达水平显著下降(P0.05),IL-10、TGF-βmRNA表达水平显著升高(P0.05),iNOS阳性细胞数显著减少而CD206阳性细胞数显著增加(P0.05),且与林可霉素利多卡因凝胶剂作用等效。结论:康复新凝胶剂能够促进小鼠伤口愈合,减轻伤口部位炎症反应,其机制可能与创面巨噬细胞表型转化有关。     

复方中药软膏在猪断层皮创面愈合中的作用研究

目的:研究复方中药软膏在猪断层皮创面愈合中的作用。方法:制备猪断层皮创面模型,创面深度至真皮深层,深度达真皮厚度约3/4。实验分为复方中药软膏组(A组)、斯丽凯纳米银抗菌凝胶组(B组),空白对照组(C组),创面分别用复方中药软膏、斯丽凯纳米银抗菌凝胶、生理盐水纱布覆盖,创面定量涂抹上述药物。每天一次观察三组创面的愈合时间及不同时间点愈合情况。伤后每隔5天取上述三组创面组织,测定猪皮肤转化生长因子β(TGF-β)含量、过氧化氢酶(SOD)、丙二醛(MDA),并取创面组织行HE染色,观察表皮及真皮变化。结果:1动物实验显示,A组、B组、C组,愈合时间依次为(13.17±1.75)天、(18.42±1.93)天、(24.67±2.64)天,P0.05;2各组创面TGF-β含量的比较,在伤后第5天,A组(196.36±1.53)pg/ml、B组(160.52±1.43)pg/ml、C组(150.65±3.60)pg/ml,A组高于B组和C组,P0.05;伤后第9天比较,A组(183.39±1.73)pg/ml、B组(157.19±3.58)pg/ml、C组166.68±6.50,A组高于B组和C组,P0.05;其它时间点A组低于B组和C组;3各组创面中SOD含量的比较,伤后第5、第9、第14,A组高于B组和C组,P0.05;伤前一天和伤后第29天,P0.05;4各组创面中MDA含量的比较,在伤后第5至第24天,A组低于B组和C组,P0.05;伤前一天和伤后第29天,P0.05。结论:制备猪断层皮缺损创面模型可靠稳定复方中药软膏在猪断层皮创面愈合过程中,可缩短创面愈合时间,提高创面愈合速率,升高创面组织中TGF-β含量,促进创面愈合复方中药软膏可提高创面组织中SOD含量,加强药物抗氧化能力;降低创面组织中MDA含量,减轻细胞毒性损伤。可减轻皮肤损伤造成的局部或全身炎症反应,发挥抗炎作用.复方中药软膏减少创面组织中渗出液,体现抗渗出功能。     

自体富血小板血浆凝胶技术在网状植皮治疗大面积皮肤缺损创面中的临床研究

目的 探讨自体富血小板血浆(PRP)凝胶技术在网状植皮治疗大面积皮肤缺损创面中的临床疗效。方法 2018年1月～2019年12月我院收治的需要大面积创面植皮的39例病人为对照组,2020年1月～2021年12月收治的需要大面积创面植皮的41例病人为观察组。两组病人均用电动取皮刀取大腿内侧皮肤制成大张网状皮片,观察组用PRP凝胶均匀涂于网状皮片内表面,对照组用生理盐水湿润,术后第7天、10天、13天换药更换无菌纱布。计算两组病人术后第7天、10天、13天创面网状植皮皮片愈合率;采用视觉模拟评分法(VAS)评估两组病人术后第1周、2周疼痛程度;采用温哥华瘢痕量表(VSS)评估两组病人第1、2个月瘢痕增生情况;观察治疗过程中两组病人不良反应发生情况。结果 术后第7天、10天、13天,观察组皮片愈合率分别为(51.1±9.8)%、(79.3±7.8)%和(95.5±3.5)%,对照组皮片愈合率分别为(45.5±9.1)%、(67.8±8.1)%和(86.3±5.7)%,观察组创面移植皮片愈合率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);术后第1、2周观察组疼痛VAS评分分别为(3.1±...     

雪旺细胞促进骨髓间充质干细胞增殖的实验研究

目的通过雪旺细胞(Schwann cell,SC)与骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)复合培养,观察SC对MSCs增殖的影响,为其在构建组织工程血管中应用提供实验依据。方法选用体重40gSD大鼠,用组织块培养法获取SC,用骨髓差速贴壁法获取MSCs;用免疫组织化学法分别对两种细胞进行鉴定。用Transwell培养板复合培养两种细胞,实验组于板上层接种MSCs,下层接种SC;同时上下两层均接种MSCs设为对照组。各组均选择第1、3、5和7天4个时间点进行检测,用氚标胸腺嘧啶核苷酸标记MSCs,液体闪烁仪进行细胞计数(counts per minute,CPM)。提取实验组SC、MSCs和对照组MSCs的细胞蛋白,分别对血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和其受体Flk-1,协同受体1(neuropilin-1,NRP-1)进行Westernblot检测。结果SC呈梭形,表达S-100蛋白,阳性率达90%。MSCs表达CD105和CD44,不表达CD34和CD45。Transwell复合培养:MSCs,第1、3、5和7天增殖数量分别为2411.00±270.84、3016.17±241.57、6570.83±2848.27、6375.83±1431.28,明显大于对照组2142.17±531.63、2603.33±389.64、2707.50±528.55、2389.00±908.01,差异有统计学意义(P<0.05),实验组CPM值于第5天最高。于复合培养第5天Westernblot显示:SC表达VEGF、Flk-1和NRP-1;VEGF、Flk-1、NRP-1在实验组MSCs中表达明显强于对照组。结论两种细胞体外复合培养后,SC在第1、3、5和7天均能显著增加MSCs的数量,并促进增殖,增殖高峰在第5天。与SC复合培养后,MSCs表达VEGF明显增加,其相应受体Flk-1、NRP-1表达上调,SC通过促进MSCs分泌VEGF增加参与了细胞的增殖过程。     

转基因的骨髓间充质干细胞治疗大鼠缺血皮瓣

目的探讨转染血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)同种异体移植促进缺血皮瓣的血管新生,从而提高皮瓣存活率的可能性。方法体外分离、培养、鉴定SD大鼠MSCs,PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染MSCs,免疫荧光方法检测MSCs体外表达VEGF的情况,CM-DiI标记MSCs。SD大鼠随机分3组:A组[PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染的MSCs移植]、B组(单纯MSCs移植)、C组(DMEM-F12培养基)。每只大鼠背侧皮下按组分别注射细胞悬液和培养基,注射后ELISA法连续检测大鼠血浆VEGF浓度,注射后第4天掀起1个蒂在尾侧的9 cm×2 cm的随意皮瓣。在术后第14天分别观察皮瓣的存活率、激光多普勒血液监测仪监测血流灌注、CD34免疫组织化学检测皮瓣毛细血管密度、荧光显微镜检测MSCs在皮瓣内的分布和存活状况。结果转染VEGF165基因的MSCs体外和体内检测均高表达VEGF165蛋白。A、B、C三组的皮瓣存活率分别为(83.1±2.6)%、(66.4±6.1)%、(51.5±7.5)%(P< 0.05);A、B、C三组的毛细血管密度(条/mm2)分别为:89.2±6.1、57.1±4.7、28.7±2.8(P< 0.05);血流灌注比值A组高于B、C两组,B组高于C组(P<0.05);转染VEGF165基因的MSCs移植SD大鼠皮瓣后,MSCs存活并参与血管新生。结论转染VEGF基因的大鼠MSCs体外培养后异体移植可促进缺血皮瓣的血管新生,提高存活率。     

人胎盘蜕膜基层来源MSCs参与裸鼠皮肤创面修复的研究

目的探讨人胎盘蜕膜基层来源MSCs(placental decidua basalis derived MSCs,PDB-MSCs)参与裸鼠全层皮肤缺损修复的效果。方法取自愿捐赠人胎盘组织,采用酶消化法结合密度梯度离心法分离培养PDBMSCs并传代,取第4代细胞进行实验。倒置相差显微镜观察细胞形态,行成骨与成脂诱导鉴定,检测细胞表面特异性抗原表达以鉴定细胞。取42只4~5周龄雌性BALB/c裸鼠,随机分为两组(n=21);分别将200μL浓度为5×106个/m L的第4代PDB-MSCs及等体积PBS经尾静脉注射入实验组及对照组裸鼠体内;注射后3 d实验动物于背部制备大小为1.5 cm×1.5 cm全层皮肤缺损模型。术后1、2、4、7、14、18、21、25、30 d大体观察创面愈合情况,待创面开始脱痂后测量创面愈合率。术后1、7、14、21、30 d取材行HE染色,观察创面修复情况;7、14、30 d实验组采用免疫荧光染色法行细胞定位分析。结果经鉴定胎盘蜕膜组织所分离的细胞为MSCs,具有多向分化能力和MSCs免疫组织表型。术后两组裸鼠存活至实验完成。大体观察示,实验组创面愈合较对照组快,其中实验组于术后12~14 d、对照组于14~17 d开始脱痂。实验组术后14、18、21 d创面愈合率均显著高于对照组(t=4.001,P=0.016;t=3.380,P=0.028;t=3.888,P=0.018);25、30 d两组比较差异无统计学意义(t=1.565,P=0.193;t=1.000,P=0.423)。组织学观察示,与对照组比较,实验组皮肤创面组织炎性反应低,并且随时间延长皮肤各层组织及腺体等再生良好。免疫荧光染色示,术后各时间点实验组皮肤创面区域均可见人线粒体抗原染色阳性,提示存在人源细胞。结论通过酶消化法结合密度梯度离心法可稳定获得PDB-MSCs,预先注射入裸鼠体内后,在皮肤损伤条件下细胞可向皮肤损伤部位迁移,并促进创面修复。     

恒磁场对SD大鼠深创面愈合的影响

目的：探讨恒磁场对SD大鼠深创面愈合的影响,恒磁场对创面愈合过程中VEGF表达的影响,以及不同强度恒磁场治疗SD大鼠深创面的区别。方法：将48只清洁级SD大鼠随机分成0．16T、0．32T磁疗组和对照组。分别在术后第3、6、9、12天每组处死4只大鼠,测定创面愈合指数,免疫组化检测肉芽组织VEGF表达。比较各组的创面愈合指数及VEGF表达情况。结果：④愈合指数。0．16T磁疗组在第6、9天时的愈合指数高于对照组,差异有统计学意义;0．32T磁疗组在第3、6、9、12天时的愈合指数高于对照组,差异有统计学意义。0.32T磁疗组与0．16T磁疗组相比差异无统计学意义。②创面修复不同时期VEGF表达观察结果。在术后第3、6天磁疗组VEGF表达强于对照组,差异有统计学意义;第9、12天磁疗组与对照组相比差异无统计学意义（P〉0．05）。0．32T磁疗组与0．16T磁疗组相比差异无统计学意义。两个磁疗组在第6天时VEGF阳性率达到整个愈合过程中的峰值,而对照组在第9天时才达到高峰,且VEGF表达强度低于两个磁疗组。结论：0．16T及0．32T恒磁片均能促进SD大鼠深创面的愈合,恒磁场促进深创面愈合的机制可能和在创面愈合早、中期增强VEGF的表达有关。     

积雪草酸葡糖胺盐凝胶通过调节巨噬细胞迁移和极化促进创面愈合及表皮再生

目的探索水溶性积雪草酸葡糖胺盐(AAGS,凝胶形式)对大鼠皮肤缺损创面的作用及其机制。方法选取14只5周龄SD大鼠,每只大鼠背部两侧均建立相同的创面模型,一侧设为实验组,一侧设为对照组。实验组每天外用AAGS凝胶(30 mg/mL溶于PBS);对照组每天外用凝胶敷料(清得佳)。分别在第0、3、7、10和14天进行大体观并测量创面面积。分别在第3天(n=4)、第7天(n=4)和第14天(n=6)取材,HE染色观察并测定表皮厚度和表皮嵴数量,半定量分析炎性细胞聚集情况;免疫组化染色观察创面愈合处巨噬细胞向M1型、M2型极化的情况。小鼠单核巨噬细胞(RAW 264.7)培养过程中加入梯度浓度AAGS,Q-PCR检测M1、M2型巨噬细胞标记基因的表达情况。结果第0、3、7、10和14天大体观可见实验组相对愈合较快,定量分析显示在第10天实验组创面面积明显小于对照组(P0.05)。实验组表皮嵴数量明显多于对照组(第14天,P0.05),表皮厚度明显低于对照组(第14天,P0.05)。实验组早期(第3天和第7天)的炎症细胞数量明显多于对照组(P0.05)。此外,经过14 d的治疗,实验组巨噬细胞向M2型极化,体外细胞学研究也证实AAGS可诱导巨噬细胞向M2型的极化。结论 AAGS凝胶具有增强局部表皮结构再生的潜力,可作为局部使用药物来促进创面愈合。AAGS凝胶在创面早期促进炎症过程以增强新生组织形成,并在创面晚期诱导巨噬细胞M2型极化以达到重塑和再生皮肤结构的作用。