致病性大肠杆菌和出血性大肠杆菌的研究进展

致病性大肠杆菌(EPEC)是导致婴幼儿腹泻的主要病原菌，特别在发展中国家。近期研究表明，EPEC病原与宿主细胞的作用可视为三个阶段。第一阶段，局限性的粘附在上皮细胞；第二阶段，产生分泌蛋白：第三个阶段，紧密粘附和受体蛋白的作用。一些出血性大肠杆菌侵袭人的肠上皮细胞也靠粘附和损伤作用。     

致病性大肠杆菌绿色荧光蛋白标记

目的:用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记致病性大肠杆菌(enteropathogenic escherichia coli,EPEC),以方便研究细菌的黏附。方法:以真核表达载体p EGFP-C1为模板设计引物,采用PCR方法扩增EGFP基因并测序后,克隆入原核表达质粒载体p Trc99a,转染EPEC,用荧光显微镜观察IPTG诱导后EPEC对Hep-2细胞的黏附及荧光表达情况。结果:成功构建原核表达质粒p Trc99a-EGFP和菌株EPEC/EGFP,黏附到Hep-2细胞表面的细菌克隆能够表达绿色荧光蛋白。结论:对EPEC进行了EGFP标记,为计数细菌的黏附提供方便。     

致病性大肠杆菌致结肠癌细胞微绒毛损伤的毒力分子研究

目的:PEC感染结肠癌TC-7细胞致微绒毛损伤的毒力分子.方法:分别用EPEC野毒株、Ⅲ型分泌系统删除株(Δcfm-14)、束状菌毛删除株(ΔbfpA)、外膜蛋白删除株(Δeae)、效应分子Map删除株(Δmap)、效应分子Map和EspF联合删除株(Δmap espF)、外膜蛋白受体删除株(Δtir)及相应质粒互补株感染TC-7细胞,通过扫描电镜(SEM)检测细菌黏附及TC-7细胞微绒毛脱落损伤情况.结果:野生型EPEC感染时,大量细菌先局限性黏附,接着紧密黏附在TC-7细胞表面,细胞微绒毛大量脱落;ΔbfpA感染时,极少细菌黏附细胞,微绒毛完好,但补充表达BfpA后可以恢复到野生型表型;而Δcfm-14感染时,大量细菌局限性黏附,但微绒毛损伤轻微;Δeae或Δtir删除株感染TC-7细胞后,可见细菌呈局限性黏附,但细胞微绒毛大量脱落,相应质粒表达互补后可以恢复到野生型表型;而ΔespF或Δmap espF感染TC-7细胞后,有大量细菌紧密黏附,细菌下陷入微绒毛丛,但微绒毛损伤轻微,质粒表达互补可恢复删除株表型.结论:多个效应分子参与EPEC黏附,但EspF是造成微绒毛脱落损伤的重要分子.     

16种抗菌药物对致病性大肠杆菌和志贺氏菌的MIC测定

１６种抗菌药物对从小儿腹泻粪便标本中分离到的不同血清型别的１１株肠致病性大肠杆菌（ＥＰＥＣ），９株肠侵袭性大肠杆菌（ＥＩＥＣ）及１５０株志贺氏菌进行最低抑菌浓度（ＭＩＣ）测定。结果显示，各菌株对头孢三嗪、丁胺卡那、头孢哌酮和头孢唑啉均较敏感（ＭＩＣ９０为＜２～３２ｍｇ／Ｌ）；氟哌酸、庆大霉素和氟霉素对两者的ＭＩＣ９０相差较大（对致病性大肠杆菌的ＭＩＣ９０分别是＞２５６、６４和＞１２８ｍｇ／Ｌ，对志贺氏菌的ＭＩＣ９０分别是６４、１０和３０ｍｇ／Ｌ）．而其余９种抗菌药物的抑菌效果都很差（除卡那霉素外，ＭＩＣ９０均大于１００ｍｇ／Ｌ）。     

尿感方抗尿道致病性大肠杆菌的实验研究

目的:观察尿感方对尿道致病性大肠杆菌(UEC)在人尿道上皮细胞黏附效应的影响。方法:体外实验以营养肉汤组作空白对照,观察经三金片、蔓越莓、不同浓度的尿感方等药物处理后人尿道上皮细胞上UEC黏附数量的变化。体内实验比较经正常尿液及口服尿感方后4 h尿液、次日晨尿处理后的人尿道上皮细胞上UEC黏附数量的变化。结果:①体外实验:经不同药物处理后的各用药组其UEC黏附于尿道上皮细胞上的细菌数较未经药物处理的营养肉汤组明显减少(P<0.01);三金片、蔓越莓组与同等浓度的尿感方组比较,其黏附在尿道上皮细胞上的UEC细菌数无明显差异(P>0.05);三种不同浓度的尿感方组比较,尿感方浓度越高,抗黏附效果越好。②体内实验:经口服尿感方后4 h尿及次日晨尿处理过的UEC黏附于尿道上皮细胞上的数目较经服药前的正常尿液处理的UEC黏附数目明显减少(P<0.05,P<0.01)。结论:尿感方具有良好的体外、体内抗UEC黏附的作用,且药物浓度越高,抗黏附效果越好。尿感方阻止UEC在人尿道上皮细胞的黏附可能是其治疗尿路感染的作用机制之一。     

一株肠致病性大肠杆菌的全基因组序列分析

目的 分析并找出肠致病性大肠杆菌Deng(Enteropathogenic Escherichia coli Deng,EPEC Deng)的全基因组序列特点.方法 EPEC Deng来源于我国婴幼儿腹泻患者的粪便标本,菌株采用诊断血清鉴定血清型,通过自动细菌鉴定仪,使用微量肉汤法进行药敏试验.进一步提取细菌总DNA,构建测序文库,通过Illumina 2000仪器测序,然后利用多引物PCR等方法进行补缺口及拼接,最终获得完整的全基因组.采用相关软件获得基因序列,通过对比已知的蛋白数据库进行基因功能注释及生物信息学分析.结果 EPEC Deng菌株归属O119:H6,药敏结果显示该菌株对环丙沙星、左氧氟沙星、氨苄西林及氨苄西林/舒巴坦耐药,对其余的抗菌药物均敏感.EPEC Deng基因组包含5 233 046 bp,GC含量50.48％.基因组通过注释后总共有5 347个编码蛋白序列,80个tRNA的编码基因,以及22个完整的rRNA基因编码的操纵子.EPEC染色体基因组中含有致病岛,大小约为40Kb左右,与数据库中的一个37Kb的致病岛(AF200363.1)序列极为相似,相似度达到99％.结论 完成了肠致病性大肠杆菌基因组精细测序分析,PAI是EPEC致病的关键,为进一步研究菌株的进化关系提供了基因数据.     

肠出血性大肠杆菌O157:H7对抗生素敏感性的研究

目的了解和掌握O157H7大肠杆菌对抗生素的敏感性,以便选择防治O157H7大肠杆菌感染的药物,方法按NCCLS药敏试验法,选用MH平板,参照改良K-B法药敏试验判断标准进行结果判定.结果对选择的29种药物,其中21种敏感,4种为中敏,4种为耐药.结论肠出血性大肠杆菌O157H7对大多数抗生素敏感.     

尿路致病性大肠杆菌溶血素A基因的克隆和序列分析

目的构建尿路致病性大肠杆菌（Uropathogenic Escherichia coli,UPEC）溶血素A（hemolysin A,HLYA）hlya基因重组质粒。方法根据已知GenBank中的hlya基因序列,设计合成一对引物,用PCR方法从尿路致病性大肠杆菌溶血素A基因组DNA中扩增编码hlya的基因片段,克隆至pUC18质粒,转化大肠杆菌DH5aЭ感受态细胞,经酶切及PCR鉴定,而后进行测序。结果hlya基因体外扩增产物大小约744bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,测序结果与己知序列基本吻合。结论在国内首次克隆了尿路致病性大肠杆菌hlya基因,为研究hlya的功能和探讨hlya作为特异性诊断靶抗原的研究奠定了基础。     

大肠杆菌L型对小鼠致病性的研究

本文应用人工诱导的大肠杆菌L型经血行和膀胱感染小鼠,通过细菌学和病理学检查发现,大肠杆菌L型直接感染可引起小鼠多个脏器的间质性炎症,并观察到注射免疫抑制剂的小鼠较正常小鼠发病率高、病变重;血行感染较膀胱感染发病率高。     

肠出血性大肠埃希菌O157噬菌体的生物学特性

目的：分离并鉴定肠出血性大肠埃希菌O157噬菌体,对其生物学特性进行研究,为开发抗肠出血性大肠埃希菌O157的生物制剂提供实验依据。方法：以肠出血性大肠埃希菌O157为宿主菌,采用噬斑法从环境污水中分离出针对肠出血性大肠埃希菌O157的噬菌体。噬菌体经超滤浓缩后,电镜观察其大小和形态;将宿主菌和噬菌体以不同的比例混合,测定噬菌体的最佳感染复数并观察其一步生长曲线;利用SDS-PAGE分析噬菌体的结构蛋白和非结构蛋白;提取噬菌体基因组,进行酶切电泳分析。结果：电镜显示噬菌体的头部呈球形、直径40 nm,噬菌体的尾部长约80 nm。噬菌体的最佳感染复数为10^-2,即当宿主菌和噬菌体之间的比例为1∶100时裂解效率最高。一步生长曲线示噬菌体在裂解宿主菌时,潜伏期约为10 min,爆发期约为30 min,裂解量为130。SDS-PAGE凝胶电泳呈现13种蛋白,相
对分子质量为16 000～22 000。 琼脂糖凝胶电泳显示噬菌体基因组大小约23 000 bp。结论：成功分离并鉴定一株针对肠出血性大肠埃希菌O157的噬菌体,是一种裂解性强、特异性高的毒性噬菌体,肠出血性大肠埃希菌O157噬菌体属于有尾病毒目,管尾噬菌体科。     

3起肠致病性大肠埃希菌造成感染性腹泻爆发疫情的流行病学分析

目的对我市2005-2007年报告的3起由致病性大肠埃希菌感染性腹泻爆发疫情进行流行病学分析,为该类疫情的预防控制提供依据。方法运用回顾性流行病学分析法对我市2005-2007年报告的3起由致病性大肠埃希菌感染性腹泻爆发疫情进行分析,相关资料录人计算机,用Excel软件进行统计分析。结果①2005-2007年共发生3起由致病性大肠埃希菌感染性腹泻爆发疫情,占细菌性食源性疾病总数的6.98%。②发生高峰季节是春、夏和秋季。③人群年龄、性别和职业无特异性。④潜伏期最短的6h,最长的6d;临床症状以腹痛、腹泻为主。⑤传播方式以粪-口途径、人-人接触,食物、水源传播为主。结论我市致病性大肠埃希菌感染性腹泻发病率水平较高,且卫生管理上存在监管未到位等薄弱环节;提示今后应加强监督管理,提高自身检验能力,同时要在高峰季节前做好预防该类疫情的关键控制点的健康教育工作。     

双重实时荧光PCR检测肠出血型大肠埃希菌stx1和stx2基因方法的建立

目的建立一种检测肠出血型大肠埃希菌(EHEC)产毒基因stx1和stx2的TaqMan双重实时荧光PCR法。方法根据GenBank公布的EHECstx1和stx2基因序列进行比对后设计相应的PCR引物和TaqMan探针,探针报告基团分别使用FAM和HEX标记,淬灭基团使用BHQ1标记。建立双重实时荧光PCR反应体系并对反应条件进行优化,对方法的灵敏度、特异性及其重复性进行分析。结果建立了EHEC双重实时荧光PCR检测方法。菌液浓度为102～108cuf/ml时,均可观察到扩增曲线,且扩增曲线平滑;检测30份模拟临床样品,均检测到stx1和stx2基因,且均培养出EHEC,该方法灵敏度为100%;3次重复测定108、105、102cfu/ml3个高、中、低浓度的菌液DNA模板,得到其扩增曲线,计算各浓度的Ct值标准差及变异系数,均小于5%,在误差允许范围内。结论建立的双重实时荧光PCR法可快速、灵敏、特异、有效地检出EHEC。     

人骨形态发生蛋白-2的基因重组及其在大肠杆菌中的表达

目的用基因工程技术在大肠杆菌中表达人骨形态发生蛋白２（ｈＢＭＰ２）。方法将包含ｈＢＭＰ２部分前肽和成熟肽的３′端７３０ｂｐｃＤＮＡ片段,插入原核表达载体ｐｋｐＬ３ａ的多克隆位点,构建成ｐＫｐＬ３ａ／ｈＢＭＰ２重组表达载体,转化大肠杆菌ｐｏｐ２１３６,挑选阳性克隆,经诱导表达后用ＳＤＳＰＡＧＥ鉴定。结果该克隆表达的ｈＢＭＰ２为ＭＷ２７０００,表达量占菌体总蛋白１０％,部分纯化后植入大鼠股部肌肉,组织学观察到肌肉内大量间充质细胞增生及骨与软骨形成。结论说明重组ｈＢＭＰ２具有诱导异位骨与软骨形成的生物学功能。     

重组葡激酶及其在大肠杆菌中高效表达与纯化

目的：研究高效表达葡激酶载体的构建及其体外表达与产物的纯化。方法：用PCR方法扩增葡激酶cDNA,插入质粒pET-22b中构建成表达载体,转化入大肠杆菌BL21（DE3),经IPTG诱导表达,表达产物用Q-Poros和S-Sepharose纯化。结果：经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证明所构建质粒为葡激酶重组质粒,体外表达产物经离子交换纯化后HPLC纯度达98%以上,SDS-PAGE和Western Blot实验证实该产物为葡激酶。结论：成功构建了重组葡激酶表达载体,并经表达纯化获得高纯度葡激酶,为产业化和临床应用奠定了良好基础。     

致肾盂肾炎大肠埃希菌对细胞的粘附及侵袭

目的:研究致肾盂肾炎大肠埃希菌(UPEC)132对细胞的粘附和侵袭能力。方法:对比致病菌株UPEC132及无菌毛代表菌株E.coli K-12 p678-54对Vero、Ketr-3及EJ细胞的粘附率、粘附指数和侵袭指数。结果:E.coli K-12p678-54对此3种细胞无粘附无侵袭,而UPEC132对其有明显作用,可致细胞形态明显改变直至死亡。UPEC132对Vero、Ketr-3及EJ细胞的粘附率分别为(61.44±3.21)%、(55.22±4.09)%和(58.67±5.12)%,差别无统计学意义;对3种细胞的粘附指数分别为1.44±0.06、1.74±0.09和2.27±0.18,有显著性差异(P<0.05)。UPEC132对EJ和Ketr-3细胞的侵袭指数分别为(3.25±0.20)×10-3和(3.00±0.34)×10-3,两者之间无统计学差异,但均高于对Vero细胞的侵袭指数[(2.61±0.32)×10-3,P<0.05]。结论:UPEC132对Vero、Ketr-3、EJ细胞均有粘附和侵袭能力,其中对EJ细胞的粘附能力最强,侵袭力也较Vero细胞强,可利用该细胞深入研究UPEC132的毒力及致病机制。     

DinB基因的超表达短期内可显著降低大肠杆菌的死亡率

 [目的]探讨大肠杆菌dinB基因在进化上的选择优势.[方法]应用竞争共培养和超表达的策略,测定共培养后含dinB基因的目的菌株和对照菌株的生长优势.第1组为含质粒pUC-dinB-rrnb的E.coli AB1157＋含质粒pUC-dinBR-rrnb的E.coli YG7207;第2组为含质粒pUC-dinB-rrnb的E..coli AB1157＋含质粒pUC-phoE-rrnb的E.coli YG7207;第3组为含质粒pUC-phoE-rrnb的E.coli AB1157＋含质粒pUC-dinBR-rrnb的E.coli YG7207;第4组为卡那霉素抗性（K^＋）菌株YG7207与无卡那霉素抗性菌株AB1157.[结果]第4组中,卡那霉素抗性菌株YG7207与无卡那霉素抗性菌株AB1157在培养物中的比例保持着良好的稳定.第1组和第2组混合培养中,K^＋抗性的菌株在培养物中的比例急剧下降,并很快接近或等于0;第3组培养物中,K^＋菌株（YG7207）的比例呈明显上升.[结论]超表达dinB基因的大肠杆菌菌株的生长优势不是由于对数期的生长速率提高所造成,对数后期细胞死亡率降低应该是超表达dinB基因的大肠杆菌菌株的生长优势的主要原因.     

DinB基因的超表达短期内可显著降低大肠杆菌的死亡率

[目的]探讨大肠杆菌dinB基因在进化上的选择优势.[方法]应用竞争共培养和超表达的策略,测定共培养后含dinB基因的目的菌株和对照菌株的生长优势.第1组为含质粒pUC-dinB-rrnb的E.coli AB1157＋含质粒pUC-dinBR-rrnb的E.coli YG7207;第2组为含质粒pUC-dinB-rrnb的E..coli AB1157＋含质粒pUC-phoE-rrnb的E.coli YG7207;第3组为含质粒pUC-phoE-rrnb的E.coli AB1157＋含质粒pUC-dinBR-rrnb的E.coli YG7207;第4组为卡那霉素抗性（K^＋）菌株YG7207与无卡那霉素抗性菌株AB1157.[结果]第4组中,卡那霉素抗性菌株YG7207与无卡那霉素抗性菌株AB1157在培养物中的比例保持着良好的稳定.第1组和第2组混合培养中,K^＋抗性的菌株在培养物中的比例急剧下降,并很快接近或等于0;第3组培养物中,K^＋菌株（YG7207）的比例呈明显上升.[结论]超表达dinB基因的大肠杆菌菌株的生长优势不是由于对数期的生长速率提高所造成,对数后期细胞死亡率降低应该是超表达dinB基因的大肠杆菌菌株的生长优势的主要原因.     

牛生长抑素基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中克隆表达牛生长抑素基因并初步纯化。方法：根据牛生长抑素基因序列,按照大肠杆菌偏爱密码子设计合成2个DNA片段,经退火、Klenow酶补平及连接反应,获得牛生长抑素基因片段;经PCR扩增、EcoRⅠ和BarnHⅠ酶切,牛生长抑素基因被克隆在表达质粒pALEX中。结果：将重组质粒转化BL21(DE3),经IPTG诱导获得表达。表达产物经超声破碎和GST—Sepharose 4B亲和层析纯化获得重组蛋白。结论：牛生长抑素基因得到了高水平表达并初步纯化,为表达产物的大量制备、进一步的结构功能关系及在畜牧业生产上的应用研究奠定了基础。     

大肠杆菌分泌表达重组水蛭素Ⅲ的新方法研究

目的:在已有的分泌表达载体pTASH基础之上构建一种更为高效的新型大肠杆菌分泌表达载体,并检验其分泌表达水平是否提高。方法:提取原始质粒pTASH作为模板,用PCR扩增重组水蛭素基因表达盒片段以后,再插入到原表达载体pTASH的BamHⅠ位点上,从而产生含有两个串联的水蛭素基因表达盒单元的质粒p(TASH)2,转入大肠杆菌进行摇瓶表达。结果:双表达盒菌种p(TASH)2进行摇瓶水平的培养,其上清液抗凝血酶活性可达3 500 ATU.ml-1。结论:与单表达盒质粒pTASH的表达水平(2 000 ATU.ml-1)相比,双表达盒质粒p(TASH)2的摇瓶表达水平显著提高。