组织工程骨修复山羊胫骨节段性缺损的实验研究

目的应用自体骨髓基质干细胞（BMSCs）复合β-磷酸三钙（β-TCP）构建组织工程化骨，修复山羊胫骨节段性缺损。方法体外扩增培养、成骨诱导山羊BMSCs。实验组将第2代细胞复合β-TCP后修复山羊自体右侧胫骨26mm的节段性缺损（n=8），对照组以单纯β-TCP材料植入骨缺损处（n=8），旷置组（n=2）。术后16、32周分别通过大体形态观察、影像学、组织学和生物力学的方法检测骨缺损的修复效果。结果旷置组术后32周骨缺损未修复，表明动物模型确实可靠。大体观察、X线片和MicroCT显示16周时实验组已有新骨形成，β-TCP材料降解吸收；对照组则只形成少量骨痂，材料无明显降解。组织学检测示实验组有大量幼稚编织骨生成，对照组为纤维结缔组织，并有大量材料残余。实验组骨密度和力学强度低于正常胫骨组（P〈0．05），但明显高于对照组（P〈0．01）。术后32周时大体观察X线片和MicroCT显示术后实验组骨愈合良好，对照组为骨不连；骨密度检测示实验组明显高于对照组（P〈0．05），且与正常胫骨组差异无统计学意义（P〉0．05）。组织学检测示实验组呈骨性愈合，有较多成熟骨组织，对照组为纤维连接。生物力学测试实验组与正常胫骨力学强度差异无统计学意义（P〉0．05）。结论成骨诱导的自体BMSCs复合β-TCP形成的组织工程骨可良好修复山羊胫骨节段性缺损。     

雪旺细胞复合PLGA修复兔面神经缺损的实验研究

目的：探讨高分子可吸收材料PLGA(聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物)复合体体外培养的雪旺细胞修复兔面神经缺损的可行性。方法：取胎兔坐骨神经体外增殖培养雪旺细胞后，复合于PLGA，用于修复兔面神经1cm缺损，以单用导管修复组为对照。评价修复效果。结果：术后8周及16周的组织学及电生理结果表明，导管加细胞修复效果优于单纯导管修复。结论：导管复合雪旺细胞是一种较好的外周神经缺损修复手段。     

构建组织工程骨修复兔颅骨极限缺损的实验研究

目的观察以胶原缓释重组人骨形成蛋白2(recom b inan t hum an bone m orphogenetic prote in 2,rhBM P-2)复合骨髓间充质干细胞(m arrow m esenchym a l stem ce lls,M SC s)及珊瑚构建的组织工程骨修复兔颅骨极限缺损的能力。方法新西兰大白兔40只,制备颅骨极限缺损,按植入的修复物不同随机分为5组,每组8只。Ⅰ组:自体髂骨,为阳性对照组;Ⅱ组:珊瑚,为阴性对照组;Ⅲ组:rhBM P-2+珊瑚;Ⅳ组:胶原+rhBM P-2+珊瑚;Ⅴ组:M SC s+胶原+rhBM P-2+珊瑚。将其分别植入兔颅骨极限缺损处,术后8、16周行大体观察、X线片、HE染色及M asson三色染色法观察比较骨缺损修复的情况。结果术后Ⅴ组材料与Ⅰ组修复颅骨极限缺损的效果相近,缺损区大体标本可见骨样组织充填,硬度与周边骨质相近,并与周边骨质形成明显骨融合;X线阻射程度高,16周时达80.45%±2.52%;组织学观察为板层状结构的新骨组织,空白孔隙区较少。Ⅳ组修复效果次之,Ⅲ组材料成骨能力较弱,Ⅱ组大部为半透明的纤维薄膜,缺损区界限清晰。结论胶原是rhBM P-2适宜的缓释载体,胶原及M SC s对促进复合支架材料修复骨缺损有重要意义。以M SC s+胶原+rhBM P-2+珊瑚构建的组织工程骨可成为一种良好的骨缺损修复材料。     

成年鼠坐骨神经雪旺细胞体外培养的实验研究

目的探讨从成年鼠坐骨神经分离培养获得大量雪旺细胞的有效手段。方法取SD大鼠双侧预变性的坐骨神经．预变性后，剪碎至1mm^3。大小的组织块，单酶消化法进行分离培养，GenetiCin液抑制成纤维细胞生长，低浓度酶快速消化传代进一步纯化雪旺细胞，通过相差显微镜活细胞计数和S-100细胞化学标记相结合鉴定了雪旺细胞增值和纯化程度。结果通过上述方法分离培养获得了经S-100蛋白鉴定纯度为85％的第三代雪旺细胞，细胞数量为2．764×10^7／ml，细胞形态多数为梭形。结论本方法可从大鼠预变性的坐骨神经获得形态与活力良好的雪旺细胞。     

组织工程神经修复大鼠坐骨神经缺损的研究

目的观察组织工程神经修复SD大鼠1．5cm长坐骨神经缺损的效果。方法用甘油处理10只SD大鼠2．0cm长坐骨神经，制备成同种异体脱细胞基质，备用。取SD乳鼠10只，分离坐骨神经，去神经外膜后，剪成小碎块，在DMEM中培养3周，扩增后的细胞鉴定、备用。3个月龄的SD雌性大鼠40只，单纯随机分成4个神经移植组（A、B、C、D），每组10只。A组：用扩增的雪旺细胞加同种异体脱细胞基质桥接，即组织工程化人工神经组。B组：用元雪旺细胞但具有内部支架结构的同种异体脱细胞基质桥接。C组：自体神经移植组。D组；空白对照组。术后12周，进行一般情况、小腿三头肌湿重、再生神经的组织学观察。结果完成对40只大鼠（每组10只）的实验评估。所有大鼠伤口瑚愈合，元死亡。A、B、C组大鼠足部元溃疡形成，D组7只足部有溃疡形成，所有组实验侧小腿三头肌较健侧萎缩，但以D组最明显。小腿三头肌湿重、神经电生理监测A组、C组差异无统计学意义（P〉O．05），A、C组与B、D组差异有统计学意义（P〈O．05），B组与D组差异有统计学意义（P〈0．05）。A组和C组的胫前肌中均能诱发出波幅明显的神经肌肉复合动作电位（CMAP），B组、D组中则仅录到波幅很低的CMAP。A组和C组再生轴突已通过移植段神经全长，远端肌肉轻度萎缩。B组部分通过移植段神经；D组不能通过移植段神经，6例形成神经瘤。结论组织工程人工神经可用来修复大鼠长段神经缺损。     

组织工程化骨修复胸壁缺损的实验研究

目的　探索利用组织工程化骨修复胸壁缺损的可行性。方法　实验借助组织工程的基本原理和方法 ,利用猪骨脱细胞基质作为可降解支架材料 ,同时体外扩增自体骨髓间质干细胞作为种子细胞 ,体外构建组织工程化骨组织修复实验用北格犬双侧胸壁各 5cm× 5cm缺损 ,同时在构建的组织工程化骨组织中设计“辅助灌流系统” ,定时注入DMEM培养液、BMP等细胞因子和自体骨髓间质干细胞 ,即保证组织工程化骨中细胞早期营养 ,又维持了局部成骨微环境 ,并同时保证了种子细胞来源。结果　 5只实验动物胸廓未见反常呼吸 ,病理切片证明局部骨组织形成 ;单纯材料对照组可降解支架材料基本吸收 ,伴纤维组织形成。结论　组织工程化骨具有良好的生物相容性 ,并具有一定的强度 ,可防止反常呼吸 ,是一种理想的胸壁缺损修复材料     

异种脱蛋白皮质骨管复合组织工程骨修复大段骨缺损的实验研究

目的评估异种脱蛋白皮质骨管复合组织工程骨修复大段骨缺损的力学作用及成骨效果。方法 36只成年猪,随机分成3组,实验组植入异种脱蛋白皮质骨管复合骨基质明胶、骨形态发生蛋白及骨膜细胞,对照组植入异种脱蛋白骨皮质骨管复合自体髂骨微粒,空白对照组植入单纯异种脱蛋白骨管,三组均采用锁定钢板及异种皮质骨板固定。通过X线检查、病理组织学、生物力学及灰量测定检查观察骨缺损修复情况。结果术后24周,实验组及对照组骨缺损处新生骨生长良好,骨小梁排列整齐,空白对照组骨缺损新生骨较少,且与断端部分相连。植入后24周实验组与对照组的生物力学及骨矿含量相比无统计学差异,且均明显高于空白对照组。结论异种脱蛋白皮质骨管复合骨基质明胶、骨形态发生蛋白及骨膜细胞修复大段骨缺损具有良好的应力支撑作用,其成骨效果与自体松质骨相当。     

雪旺细胞移植促进中脑损伤神经元修复的实验研究

目的探讨雪旺细胞移植对损伤的大鼠中脑神经元修复的影响。方法BrdU标记的新生大鼠雪旺细胞移植至电针损伤的大鼠中脑区域,不同时间处死动物,免疫组织化学方法观察BrdU、GAP43的表达并通过图像分析系统处理实验结果。结果雪旺细胞移植后8个月仍可见BrdU阳性细胞,其数目增加15％,并主要向大脑皮层迁移;移植后1个月损伤的中脑神经元GAP-43的表达与对照组相比差异有显著意义。结论雪旺细胞移植可促进中脑损伤神经元的修复。     

组织工程化人工神经修复周围神经缺损的实验研究

目的　研究雪旺细胞和生物降解支架材料复合后构建成的组织工程化人工神经修复神经缺损的效果。方法　将雪旺细胞制成 1× 1 0 8/ml的ECM (extracellularmatrix,ECM)凝胶 ,与PLA无纺纤维布复合培养 7d ,置入PLA中空纤维管中 ,构建成组织工程化人工神经。建立大鼠坐骨神经缺损 1 0mm的动物模型 ,A组为人工神经组 ;B组为雪旺细胞复合ECM凝胶组 ;C组为单纯ECM凝胶组 ;D组为自体神经移植组。术后 8周、1 2周 ,行神经电生理和组织学检测评价疗效。结果　术后 1 2周A组的再生神经纤维已越过远端缝合口 ,有髓神经纤维数和神经纤维密度稍差于D组 ,但再生神经组织的面积显著高于后者 ;A、D组的髓鞘厚度和dLAT、NCV、AMP、AREA均无显著差别 ,但明显高于B、C组。结论　雪旺细胞、ECM凝胶和PLA多孔材料与PLA中空纤维管组合后构建成的组织工程化人工神经 ,修复周围神经缺损的效果接近于自体神经移植     

修饰后的聚羟基乙酸和聚乳酸共聚物支架与人胚雪旺细胞联合培养的实验研究

目的：探索人体组织工程神经构建的方法。方法：应用鼠尾胶和层粘蛋白包埋纤维状的聚羟基乙酸和聚乳酸共聚物支架与人胚雪旺细胞培养2周，观察细胞在支架上的吸附迁移和生长情况，结果：人雪旺细胞能在共聚物纤维上迁移包裹，雪旺细胞均匀分布于以鼠尾胶和层粘蛋白共同包埋后的纤维之间及吸附在纤维表面，且基质分泌旺盛，结论：人胚雪细胞在修饰后的polyglytin纤维上得到大量扩增，形成的三维立体结构具有人工神经的基本特性。     

Novel three-dimensional nerve tissue engineering scaffolds and its biocompatibility with Schwann cells

To develop a novel scaffolding method for the copolymers poly lactide-co-glycolide acid (PLGA) to construct a three-dimensional (3-D) scaffold and explore its biocompatibility through culturing Schwann cells (SCs) on it. Methods: The 3-D scaffolds were made by means of melt spinning, extension and weaving. The queueing disci-pline of the micro-channels were observed under a scan-ning electronic microscope (SEM).The sizes of the micropores and the factors of porosity were also measured. Sciatic nerves were harvested from 3-day-old Sprague Dawley (SD) rats for culture of SCs. SCs were separated, purified, and then implanted on PLGA scaffolds, gelatin sponge and poly-L-lysine (PLL)-coated tissue culture poly-styrene (TCPS) were used as biomaterial and cell-support-ive controls, respectively. The effect of PLGA on the adherence, proliferation and apoptosis of SCs were exam-ined in vitro in comparison with gelatin sponge and TCPS. Results: The micro-channels arrayed in parallel manners, and the pore sizes of the channels were uniform. No significant difference was found in the activity of Schwann cells cultured on PLEA and those on TCPS (P>0.05), and the DNA of PLGA scaffolds was not damaged. Conclusion: The 3-D scaffolds developed in this study have excellent structure and biocompatibility, which may be taken as a novel scaffold candidate for nerve-tissue engineering.     

运用组织工程学原理构建许旺细胞三维培养体系

目的 探讨普通重力和模拟微重力条件下构建许旺细胞三维培养体系的方法。方法 对聚羟基乙酸细丝支架进行化学改性处理后再以层粘连蛋白进行生物学修饰;分别在普通重力和模拟微重力条件下把原代许旺细胞悬液接种在支架材料上,观察许旺细胞的粘附生长情况。结果 两种重力条件下许旺细胞在聚羟基乙酸支架表面都能良好贴壁生长,培养2d时细胞生长稳定、密度适中;模拟微重力条件下许旺细胞在支架表面的分布更均匀。结论 普通重力和模拟微重力环境都适宜构建许旺细胞的三维培养体系,模拟微重力环境可能为有利。     

小肠黏膜下层复合雪旺细胞构建组织工程化人工神经修复周围神经缺损的研究

目的小肠黏膜下层（small intestinal submucosa，SIS）复合雪旺细胞构建组织工程化人工神经并探讨其修复周围神经缺损的效果。方法SD大鼠60只随机分成三组，每组20只。构建右侧坐骨神经14mm缺损，A组：单纯SIS修复组；B组：复合雪旺细胞的SIS修复组；C组：自体神经移植对照组。术后不同时间段通过大体观察、电生理检测、组织学、透射电镜、图像分析、逆行示踪和小腿三头肌称重等方法分析评价修复效果。结果术后16周，B组移植段与近远段神经外观相似，未有神经瘤形成。组织学和透射电镜检查见B组再生神经组织可顺利通过缺损区，再生神经纤维排列整齐呈束状，含有大量的有髓神经纤维，与C组相似。电生理检测见第16周B组神经传导速度和复合动作电位的波幅均较第12周有所提高，与C组相比差异无统计学意义。真蓝逆行示踪证实B组和C组再生神经轴突轴浆运输功能恢复良好。图像分析证实B组再生神经组织面积百分比、有髓神经纤维密度和髓鞘厚度与C组相比差异无统计学意义，优于A组。B组和C组患侧小腿三头肌肌肉重量和恢复率均优于A组，C组优于B组，且差异有统计学意义。结论SIS复合雪旺细胞构建组织工程化人工神经能有效修复大鼠长距离坐骨神经缺损，有望成为自体神经的替代材料应用于周围神经缺损的修复。     

大鼠骨髓基质干细胞体外诱导分化为类许旺细胞

目的 研究大鼠骨髓基质干细胞在体外分化为类许旺细胞的方法。方法 采用β—巯基乙醇、全反式视黄酸、Forskolin、碱性成纤维细胞生长因子等依次按顺序诱导。神经胶质纤维酸性蛋白、S—100免疫细胞化学染色鉴定、计数诱导前后不同时间的细胞阳性表达率。结果 诱导后骨髓基质干细胞形态改变，胞体呈椭圆形，有2—3个纤细的细胞突起，成纵形栅栏状排列，免疫细胞化学染色神经胶质纤维酸性蛋白表达率为42．5％-68.7％、S—100表达率为39．6％-60.2％。结论 采用β—巯基乙醇、全反式视黄酸、Forskolin、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子、HRG可以诱导大鼠骨髓基质干细胞在体外分化为类许旺细胞。     

Experimental study on the adhesion, migration and three-dimensional growth of Schwann cells on absorbable biological materials

Objective: To study the adhesion, migration and three-dimentional growth of Schwann cells on PLA(polylactic acid) nonspinning fibre cloth and polyglycolic/polylactic acid (PLGA) fibres. Methods: Schwann cells/ECM gel solution and PLA nonspinning fibre cloth and PLGA fibres pretreated by collagen, polylysine and ECM were co-cultured. Then the migration and three-dimensional growth of Schwann cells on the fibres were observed under phase contrast microscope and laser scanning confocal microscope. Results : Schwann cell/ECM solution was compounded with PLA nonspinning fibre cloth. With formation of gel, most Schwann cells resided in the fibre net holes, and adhered to the fibres to form a multiplayerarranged Schwann cell column like Biingner band.Schwann cells could adhere to PLGA fibres and grew and migrated along the fibres. ECM gel could significantly increase the adhering and migrating cell number. Conclusions: ECM gel can facilitate the adhesion,growth and migration of Schwann cells on the seteroframe.It is a good integrating material for tissue engineering bioartificial nerve.     

神经妥乐平促进雪旺细胞体外增殖作用的研究

目的　研究神经妥乐平促进周围神经修复的机制和体外作用的最适浓度。方法　将成年兔坐骨神经用植块法分离纯化雪旺细胞 ,将纯化后的细胞培养 2 4h后分成 4组 :神经妥乐平药物组 (按用药浓度分 3组 )和正常组。相差显微镜观察下每日计数测定雪旺细胞的增殖曲线 ,2 4h和 72h后用流式细胞仪测定S期的比例。结果　 0 .1NU/ml浓度的神经妥乐平对雪旺细胞的增殖作用不明显。 0 .5NU/ml和 1NU/ml浓度的神经妥乐平组 ,在 2 4h和 72h后处于S期的雪旺细胞明显增多。 10d后药物组细胞计数明显高于对照组 ,其中 0 .5NU/ml组、1UN/ml组和对照组的倍增时间分别为 6.1d ,5 .5d和8.1d ,两者相比 ,差异有非常显著性意义 (t =16.91、17.15 ,P <0 .0 1)。结论　神经妥乐平能显著地促进雪旺细胞的增殖从而促进周围神经损伤的修复     

雪旺细胞种于医用组织引导再生胶原膜构建自体人工神经的实验研究

目的;设计并构建一种新型的神经引导导管。方法：将兔雪旺细胞种到用成粘蛋白多孔医用组织引导的再生胶原膜支架培养2周后,用倒置显微镜、扫描电镜观察雪旺细胞吸附、生长迁移情况;以雪旺细胞胶原膜管的形式植入体内,观察它诱导神经再生的能力。结果：成年兔雪旺细胞在医用组织引导再生胶原膜上生长良好,并均匀分布于支架表面,且基质分泌旺盛。体内模型发现神经已通过移植物长入远端,胶原膜已吸收。结论：雪旺细胞可以在多聚医用组织引导再生胶原膜上得到扩增,种有雪旺细胞的医用组织引导再生胶原膜导管可以形成一个诱导神经轴突再生的微环境,形成的三维立体结构具有人工神经的基本特性,为组织工程方法修复长段神经缺损提供了研究基础。