不同活性氧成分在血卟啉单甲醚-PDT诱导HeLa细胞死亡中的作用

目的探讨不同活性氧成分在血卟啉单甲醚(HMME)-PDT诱导HeLa细胞死亡中的作用。方法将接种人宫颈癌HeLa细胞的培养皿随机分成单纯HMME-PDT组、HMME-PDT加叠氮钠(单线态氧淬灭剂)与HMME-PDT加甘露醇(羟自由基淬灭剂)组。以功率密度为15mW/cm2,能量密度为5.4J/cm2、波长为510.6mm的激光照射。用膜联蛋白(annexin)V-碘化丙啶(PI)双染法检测激光照射后第6和24h三组中HeLa细胞的凋亡率和坏死率。结果PDT后第6小时,单纯HMME-PDT组和HMME-PDT加入叠氮钠组的坏死率17.68%±1.05%和4.15%±2.19%(P=0.0006),单纯HMME-PDT组和HMME-PDT加D-甘露醇组的HeLa细胞凋亡率分别为11.48%±3.42%和3.19%±1.01%(P=0.0158)。PDT后第24小时,单纯HMME-PDT组的HeLa细胞凋亡率和坏死率分别为48.51%±2.85%和19.26%±1.57%,加入叠氮钠组为40.45%±3.56%和13.12%±2.75%,加入D-甘露醇组为39.43%±4.37%和21.00%±4.31%。结论HMME-PDT产生的单线态氧以导致HeLa细胞坏死为主,而羟自由基则以导致细胞凋亡为主。     

钙在血卟啉单甲醚-光动力学疗法处理后HeLa细胞中的变化及作用

目的 了解钙离子在血卟啉单甲醚-光动力学疗法(HMME-PDT)处理后HeLa细胞中的变化和作用。方法 Fura-2／AM孵育荧光分光光度计检测细胞质游离钙浓度[Ca^2 】i的变化，MTT法分析PDT及钙离子对HeLa细胞存活率的影响，Western印迹法分析HMME-PDT后HeLa细胞的肌浆／内质网钙泵(SERCA2)蛋白的降解情况。结果 HMME-PDT处理后即刻HeLa细胞内【Ca^2 】i就开始增高，且与PDT剂量成正相关用，BAPTA／AM拮抗【Ca^2 】i的升高可增加HeLa细胞的存活率。同时HMME-PDT可引起SERCA2蛋白的降解。结论 HMME-PDT处理后HeLa细胞内【Ca^2 】i可迅速增高，【Ca^2 】i，升高可能与SERCA2蛋白的降解相关，并可促进HeLa细胞的死亡。     

血卟啉甲醚-PDT诱导C6胶质瘤细胞凋亡机制的研究

目的探讨血卟啉甲醚-光动力学疗法（PDT）诱导C6胶质瘤细胞的凋亡机制。 方法常规传代培养C6胶质瘤细胞系,取处于对数生长期细胞按实验要求分组接种于96孔培养板上,应用光敏剂血卟啉甲醚,以不同照光剂量（40、80、120、160、200、240、280和320J/cm^2）处理C6胶质瘤细胞。MTT法检测不同照光剂量的细胞死亡率;电镜观察PDT后C6细胞形态学变化;以Fluo-3/AM为细胞内钙离子荧光指示剂,激光共聚焦显微镜测定不同照光剂量作用后C6胶质瘤细胞内[Ca^2＋]i。 结果PDT组对C6胶质瘤细胞死亡率影响显著,照光剂量与细胞死亡率正相关,随照光剂量增加,细胞死亡率逐渐增大,当达到能量密度大于200J/cm^2时,细胞死亡率不再明显增加。PDT作用后早期出现一定数量凋亡的C6胶质瘤细胞和多数线粒体、内质网等亚细胞结构肿胀。PDT作用晚期可见大量坏死细胞和部分凋亡细胞。PDT作用后C6胶质瘤细胞内游离钙明显升高。 结论血卟啉甲醚-PDT诱导C6胶质瘤细胞坏死和凋亡,钙超载在广泛超微结构损伤中起重要作用。     

血卟啉单甲醚在生理盐水溶液中光漂白的研究

目的观察在光动力学反应过程中血卟啉单甲醚(HMME)的光漂白现象,探讨其影响因素。方法通过本研究建立的光敏剂荧光分析系统,应用光学多通道分析仪对生理盐水溶液中HMME介导的光动力反应过程中光漂白的情况进行监测。HMME的浓度分别为1、10μg/ml。Nd∶YAG倍频532nm激光作为光动力的照射光源,同时利用其作为荧光激发光源。在光动力反应过程中采集溶液的荧光光谱,并进行分析处理。结果光敏剂HMME在一定的浓度范围内,初始浓度越高,光漂白的速率越快。在HMME的光漂白过程中于639nm处出现新的荧光峰。根据漂白造成的自体背景的变化,HMME的光漂白可以分为两个阶段:(1)在0～45min阶段,随着照光过程的持续,HMME在613nm与674nm处的荧光特征峰强度下降,同时在639nm处出现新的荧光峰,且其强度持续增强,自体背景强度起伏很小,稳定在HMME初始荧光强度的0.16倍左右;(2)而45～90min阶段,随着照光时间延长,在613、674和639nm处荧光峰的强度均下降,自体背景强度呈接近于线性持续增强,到照光结束时增至HMME初始荧光强度的约0.45倍。结论HMME的光漂白是一个较复杂的过程,初始浓度影响其漂白的速度,并伴有光漂白产物的生成及其再漂白的现象。     

血卟啉单甲醚光动力学疗法对体外培养的人角质形成细胞增生的影响

目的观察人角质形成细胞株Hacat对血卟啉单甲醚(hematoporphyrinmonomethylether,HMME)的吸收特性及HMME-PDT对角质形成细胞增生的影响。方法对数生长期的Hacat细胞分别与浓度为0、10、20和40μg/ml的HMME孵育1h;同时将另一实验组的Hacat细胞与10μg/ml的HMME分别孵育0和30min、1和2h,分别以流式细胞仪检测孵育时间和孵育浓度对Hacat细胞吸收HMME的影响;在此基础上,将Hacat细胞分别与0、2·5、5、10、20和40μg/ml的HMME孵育2h,用532nm的倍频Nd∶YAG激光以20mW/cm2的功率密度分别照射0、2·5、5、10、20min,同时设立完全空白对照组和单纯光敏剂组,24h后以MTT法检测Hacat细胞的存活率。结果Hacat细胞对HMME吸收量随着孵育浓度的增高和孵育时间的增加而增多。单独照光或以高达40μg/ml的HMME孵育对Hacat无明显杀伤(P>0·05)。在激光功率密度相同的情况下,HMME-PDT对Hacat细胞的杀伤呈孵育浓度和激光能量密度相关性。结论Hacat细胞对HMME吸收呈孵育浓度和孵育时间相关性,孵育浓度及激光能量密度是影响HMME-PDT杀伤效应非常重要的影响因素,在实验范围内的HMME-PDT能对Hacat细胞产生明显的杀伤作用。     

体外超声激活血卟啉单甲醚抗C6胶质瘤细胞的研究

目的 研究超声激活血卟啉单甲醚(HMME),对C6胶质瘤细胞的生物效应,为声动力疗法(sonodynamic therapy,SDT)治疗脑胶质瘤奠定实验基础. 方法实验分为SDT组(超声 HMME组)、超声组、HMME组及仅加入肿瘤细胞的对照组.HMME终浓度为10 μg/ml,SDT组、超声组进行超声照射(频率:1.0 mHz,声强度:0.5 W/cm2,时间:120 s)处理.采用噻唑蓝比色分析法(MTT法)观察SDT处理后6、12、24、48和72 h的抑瘤率;流式细胞学检测SDT处理后6 h C6细胞凋亡率及细胞周期百分比.结果 SDT组抑瘤率显著增高;超声组也有一定的抑瘤率;HMME组抑瘤率与对照组无明显差别.SDT后凋亡率升高,G0/G1期、G2/M期百分比降低,S期百分比升高、凋亡增殖比(APR)升高.结论 SDT能显著杀伤C6胶质瘤细胞,并诱导其凋亡,使细胞阻滞于S期→G2期.     

血卟啉单甲醚-PDT对骨髓基质细胞及K562白血病细胞杀伤效应的初步研究

目的:对比研究血卟啉单甲醚(HMME)-PDT对骨髓基质细胞及白血病K562细胞的杀伤效应。材料与方法:实验选用白血病K562细胞株及原代培养骨髓基质细胞,光敏剂为血卟啉单甲醚(HMME),KTP激光(532nm)作为照射光源,MTT法检测细胞杀伤效应。结果:在照光剂量为10J/cm2、HMME浓度为10μg/m     

血卟啉单甲醚光动力学疗法对体外培养的人角质形成细胞增殖的影响

目的：观察人角质形成细胞株Hacat对血卟啉单甲醚（hematoporphyrin monomethyl ether，HMME）的吸收特性及HMME-PDT对角质形成细胞增殖的影响，为HMME-PDT用于临床银屑病的治疗提供初步的实验依据。     

血卟啉单甲醚-光动力学疗法对兔移植静脉再狭窄的抑制作用

目的探讨局部灌注血卟啉单甲醚(HMME)结合血管外激光照射的方法对移植静脉吻合口处内膜增生的抑制作用。方法采用兔颈外静脉颈总动脉移植模型，将实验动物随机分为光动力学治疗组、单纯激光照射组、单纯光敏剂灌注组、空白对照组，每组4只兔。光动力学治疗组局部应用血卟啉单甲醚HMME(15／μg／ml)溶液充盈在移植静脉段，再以532nm波长半导体激光器在吻合口(每只兔2处吻合口)附近进行血管外照射5min，功率密度100mW／cm^2，能量密度30J／cm^2；单纯激光照射组以生理盐水充盈移植静脉段，再用激光照射；单纯光敏剂灌注组仅用HMME(15μg／ml)溶液充盈移植静脉段5min；空白对照组应用生理盐水充盈移植静脉段5min.术后第4周于各实验组移植静脉的动静脉连接都及其两侧0.5cm处的动脉端、静脉端取材，常规石蜡包埋切片HE染色，组织病理观察，采用IMAGE-Pro Plus生物医学图像分析系统，观察不同处理组内膜增生程度的差异。     

血卟啉单甲醚光动力学疗法对小鼠接触性超敏反应的抑制效应

目的 探讨血卟啉单甲醚光动力学疗法(hematoporphyrin monomethyl ether mediated photodynamic therapy,HMME-PDT)对小鼠接触性超敏反应(contact hypersensitivity,CHS)的影响.方法 雌性BALB/c小鼠按功率密度分为50和100mW/cm2两个实验组,同时设置单纯照光组、单纯光敏剂组、空白对照组以及DNFB组.PDT处理后3 d,各实验组分别以2,4-二硝基氟苯(DNFB)诱发小鼠右耳变应性接触性皮炎,以游标卡尺测量发敏前后右耳的厚度差;对于功率密度为50 mW/cm2组,进一步观察了PDT处理前4 d或PDT处理后1、3和12 d,DNFB发敏前后小鼠右耳的厚度差,并对PDT后3 d组行组织学检查,以目镜网格测微尺计算浸润炎症细胞数量.结果 处理前4d预先以DNFB致敏,PDT对CHS无抑制作用(P＞0.05).反之,PDT照射后1、3或12 d再以DNFB致敏,则PDT能对CHS产生显著抑制作用(P＜0.01),其抑制率分别为58%,63%,47%.且无论是以50mW/cm2还是以100mW/cm2功率密度的激光照射,这种抑制作用均存在.未经任何干预,DNFB致敏组致敏右耳浸润的单核细胞和中性粒细胞的数量增加,而经PDT处理后,浸润的炎性细胞明显减少,二者之间存在显著性差异(P＜0.01).结论 HMME-PDT能对正常小鼠接触性超敏反应产生明显抑制作用,并有短暂持续效应.     

光动力药物血卟啉单甲醚HPLC-荧光检测法的建立及其药代动力学研究

目的建立测定血浆中血卟啉单甲醚(HMME)的HPLC-荧光检测法,并用以进行HMME在犬体内的药代动力学研究。方法血浆中的HMME采用乙酸乙酯液-液萃取,荧光素为内标。选用C18柱(4·6mm×150mm,5μm),0·02mol/L醋酸钠(用冰醋酸调pH6·0)-四氢呋喃(60∶40)组成为流动相,荧光检测器激发波长为395nm,发射波长为613nm。结果HMME血药浓度的范围为0·025~5·000μg/mL,采用两条标准曲线定量的方法,两条标准曲线的线性范围分别为:0·025~0·500μg/ml(r=0·9973)和0·25~5·00μg/ml(r=0·9999),提取回收率92·1%~99·2%,日内、日间RSD分别为3·3%~8·4%和3·8%~8·5%。静脉给药后,HMME在犬体内的药代动力学符合开放二房室模型。其主要药代动力学参数:T1/2α(分布半衰期)=(0·18±0·16)h,T1/2β(消除半衰期)=(14·24±3·41)h,Vd(中央室表观分布容积)=(6·37±3·70)L/g,CL(清除率)=(0·31±0·17)L·kg-1·L-1,AUC(0-tn)(血药浓度-时间曲线下面积)=(27·40±11·72)mg·h-1L·-1。结论HPLC-荧光检测法准确、灵敏,适用于HMME药代动力学研究。HMME在犬体内的药代动力学过程符合开放二室模型,其在犬体内可以迅速消除,可很好地消除光动力学疗法的主要副作用———正常组织的持久光毒反应。     

血啉甲醚用于光动力疗法治疗鲜红斑痣的初步临床研究

经六年大量临床验证，光动力疗法已成为具有高度选择性和稳定可靠疗效的无瘢痕治疗鲜红斑痣的新方法。为解决治疗后的较长时间皮肤光敏反应这一主要副作用，本文对２１例志愿鲜红斑痣患者的２６个病灶应用血啉甲醚（ＨＭＭＥ）为光敏剂进行了治疗，对ＨＭＭＥ的作用进行了临床观察，发现ＨＭＭＥ具有良好的疗效、较轻的局部反应、较短的避光期和可行重复治疗的间隔期等优点，值得对其进行深入的研究。     

血啉甲醚体外光敏反应机制研究

目的：探讨血啉甲醚（HMME）及血卟啉衍生物（HpD)体外光敏化反应的机制。方法：采用HMME及HpD光敏引起还原型辅酶I（NADH）氧化为中介的鲁米诺(luminol)化学发光法（CL），探讨HMME及HpD光敏反应特点，选择性应用单态氮（^1O2)及活性氧物质（ROS）的专一清除剂，研究^1O2及RSO在HME及HpD光敏反应中的作用。结果:^1O2专一清除剂几乎完全抑制了HMME和HpD的化学发光，ROS清除剂对化学发光没有明显影响。HMME化学发光值最高可达509595mV，反应持续时间48s,^1O2的总产量12230280。HpD的化学发光值最高49000mV，反应时间235s,^1O2的总产量5757500。结论：HMME及HpD的光敏化产物主要是^1O2，HMME光敏化产生^1O2的光量子产率高于HpD，^1O2生成速度比HpD快，HMME自敏光氧化速度也比HpD快。在鲜红斑痣的的治疗中，当血供正常时，HMME光敏损伤作用可能更强，组织选择性可能更好。     

血啉甲醚与血卟啉衍生物对鸡冠皮肤光敏损伤特点的比较研究

目的：采用形态学方法观察比较国产新型光敏剂－血啉甲醚（HMME）与传统光敏剂－血卟啉衍生物（HpD)对鸡冠表皮层、真皮乳头层毛细血管网、乳头下网状层和真皮深层组织的光敏损伤特点。方法：成年莱亨鸡234只,随机分为对照组42只,实验组192只。实验组动物静脉注射HMME或HpD1、5、10或20mg/kg,于给药后即刻、1、2、3或4h对鸡冠进行激光照射,波长为488．0和514．5、510．6、578．2或627．8nm,功率密度为50、100或150mW/cm^2,能量密度为30、60、90、120、150、180或270J/cm^2,于照射后即刻、1、3、7、14和28天取材,进行大体和光镜观察。结果：PDT作用区的红色鸡冠安全变白,乳头层毛细管肉皮细胞（EC）坏死,管壁破坏及血管数量减少,其作用程度与光敏剂给药量和激光照射量相关。HMME和HpD对乳头层毛细血管的损伤程度相似;HMME组未见皮及乳头下各层损伤,而部分HpD组见表皮基底细胞层有局灶性坏死、乳头下网状层有微血管及结缔组织损伤和淋巴细胞浸润。结论：HMME和HpD对鸡冠真皮乳头层毛细血管肉的损伤程度相似,但HMME的组织选择性优于HpD.