抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒核心蛋白相互作用蛋白编码基因C1的反式调节基因

目的：筛选、克隆与乙型肝炎病毒（HBV）核心抗原（HBcAg）相互作用的蛋白基因C1的反式激活基因,探索该基因可能的生物学功能．方法：以分子生物学技术构建C1真核表达载体pcDNA3．1（-）-C1,以表达质粒pcDNA3．1（-）-C1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1（-）转染的HepG2细胞为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应（PCR）,将产物与pGEM—Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选阳性克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析．结果：成功构建人类新基因C1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库．文库扩增后挑选40个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段,随机挑选含有插入片段的30个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得18种编码基因．结论：筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞周期及代谢、肿瘤发生发展及肝脂肪变及肝纤维化发生发展密切相关的蛋白编码基因,推测了C1在体内可能存在的调控机制的线索．     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5B反式激活基因的克隆化研究

目的：应用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5B（HCV NS5B）转染细胞差异表达cDNA消减文库，克隆HCV NS5B蛋白反式激活相关基因。方法：以HCV NS5B表达质粒pcDNA3.1（-）-NS5B转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1（-）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，进行抑制性消减杂交（SSH）分析。随机挑取克隆进行测序及同源性分析。结果：文库扩增后得到35个阳性克隆，经菌落PCR分析显示其中26个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段。测序及同源性分析，显示16种已知基因编码蛋白和1种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5B反式激活靶基因。结论：成功构建了HCV NS5B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，为进一步阐明HCV NS5B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP1的反式调节基因筛选

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP1反式激活的相关基因,从分子生物学的角度研究HCV致病机制。方法:以NS5ATP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照组,从中分别提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR)扩增,将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及生物信息学分析。结果:成功构建NS5ATP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后将阳性克隆经菌落PCR分析,得到90个200～1000bp的插入片断。挑选含插入片段的30个克隆进行测序,通过生物信息学分析得到3种已知序列的基因(Ras癌基因家族成员RAN、DNA依赖的RNA聚合酶Ⅱ多肽C、核糖体蛋白L2)和1个未知功能的序列(推测为新基因)。结论:筛选得到的cDNA基因全长序列包括一些与...     

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6的反式调节基因研究

目的：筛选、克隆新基因HCBP6转染肝癌细胞后的反式调节基因，探索HCBP6基因表达对肝细胞基因表达谱的影响。方法：应用酵母双杂交技术和生物信息学(bioinfonnatics)技术，筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)的基因。构建HCBP6基因的真核表达载体pcDNA3．1(-)-HCBP6，应用抑制性消减杂交技术对重组表达质粒pcDNA3．1(-)-HCBP6转染的HepG2细胞和空载体转染的相同细胞差异表达的mRNA进行研究，将富集的二次PCR产物与T／A载体连接，并转化大肠杆菌进行文库扩增，随机挑取克隆聚合酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析。结果：消减文库扩增后得到30个阳性克隆，菌落PCR分析显示，其中24个克隆含有200—1000bp插入片段。对插入片段测序，并通过生物信息学分析，结果共获得11种蛋白编码基因。结论：应用SSH技术成功筛选了HCBP6对肝癌细胞的反式调节基因，本实验结果对初步探索新基因的功能提供重要的信息，为进一步阐明HCV核心蛋白与HCBP6相互作用后的肝细胞生物大分子变化提供了理论依据。     

抑制性消减杂交构建凋亡肝癌细胞差异表达cDNA文库

目的 应用抑制性消减杂交技术构建肝癌细胞凋亡消减杂交cDNA文库 ,以期克隆肝癌细胞凋亡相关基因. 方法 用三氧化二砷诱导人肝癌HCC-9204细胞凋亡,提取poly A+ RNA,反转录合成cDNA,消化成短片段后分成两组,分别与 两种不同的接头连接,再与普通肝癌细胞的cDNA进行两次杂交及两次抑制性PCR扩增,将PCR 产物与PT-Adv线性载体连接,转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆进行酶切鉴定, 反向Northern blot分析差异基因的可靠性. 结果 成功地构建了具有高消 减效率的人肝癌凋亡细胞cDNA文库,随机挑取200个克隆制备质粒并酶切分析,其中83.5%的 克隆均具有100～600 bp左右的插入片段. 随机选取30个插入片段,分别以未凋亡和凋亡的肝 癌细胞cDNA为探针,进行Reverse Northern Blot,其中21个被证明为差异表达的细胞凋亡 相关基因cDNA片段. 结论 应用抑制性消减杂交技术成功构建了人肝癌凋 亡细胞cDNA消减文库,为大批量筛选、克隆肝癌细胞凋亡相关的未知新基因奠定了基础,有 助于了解细胞凋亡的分子机制.     

HBV感染培养人胎肝细胞后差异应答基因的初步分离和鉴定

目的:建立培养人胎肝细胞感染HBV后差异应答基因的消减文库,并从中克隆鉴定出新的应答基因.方法:分别从HBV感染及未感染的胎肝细胞中提取总RNA,用SMART PCR技术合成全长双链cDNA,经RsaⅠ酶切后将感染细胞的cDNA分为两组,分别衔接两个不同的接头,再与未感染细胞的cDNA进行两轮抑制性杂交及两轮抑制性PCR,将产物与T/A载体连接构建成消减cDNA文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,挑取克隆进行筛选排除假阳性,再行序列分析,鉴定胎肝细胞感染HBV后的差异应答基因.结果:成功构建高效消减的HBV感染胎肝细胞cDNA文库,得到158个白色的克隆,随机选择了128个克隆经PCR扩增获得含有明确单一目的片断的克隆99个,长约100～400 bp,经筛选后得到70个克隆,测序表明有16个差异表达的基因,其中可能的新基因有5个.结论:用抑制性消减杂交技术成功建立了HBV感染培养人胎肝细胞的消减cDNA文库,为进一步大规模筛选HBV感染后的应答基因奠定了基础,初步筛选出的新基因片断为进一步研究宫内感染的分子机制提供了依据.     

人毛乳头细胞凝集性生长差异表达基因cDNA文库的构建

目的 构建毛乳头细胞凝集性生长状态下差异表达基因的消减cDNA文库。方法 分别提取凝集性生长和非凝集性生长状态下毛乳头细胞中的总RNA，应用SMART cDNA合成技术和抑制性消减杂交技术分离毛乳头细胞凝集性生长状态下差异表达基因的cDNA片段并建立消减cDNA文库；利用PCR对随机挑选的100个白色菌落进行插入片段的验证，对其中证实有插入片段的30个克隆进行cDNA斑点杂交验证。结果 所构建的消减cDNA文库扩增后得到320个阳性克隆，随机挑选的100个阳性克隆中95％的均有长度在100—600bp的插入片段，cDNA斑点杂交验证显示27个(90．0％)克隆为阳性。结论 结合SMART cDNA合成技术，应用抑制性消减杂交成功地构建了毛乳头细胞凝集性生长差异表达基因消减cDNA文库，为进一步筛选和克隆毛乳头细胞凝集性生长相关基因奠定了基础。     

乳腺癌相关差异表达基因的筛选及分析

目的构建乳腺癌组织与癌旁正常乳腺组织差异表达的cDNA消减文库,筛选乳腺癌相关基因并进行分析。方法应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术对15对乳腺癌组织及正常癌旁乳腺组织进行差异基因的消减,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,采用数字表法随机挑选克隆经PCR鉴定后,对200个阳性克隆插入片段的序列进行测定及同源性分析。结果建立了乳腺癌差异表达片段cDNA消减文库;通过测序和同源性分析,得到173个差异表达基因,其中26个与肿瘤发生发展相关;26个基因中有15个已被文献明确报道在乳腺癌组织或细胞中有差异表达。结论应用SSH技术成功建立了乳腺癌差异表达基因cDNA消减文库,为乳腺癌的发病机制研究及寻找潜在的治疗靶点提供了有力的支持。     

应用抑制消减杂交技术构建哮喘病人嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库

目的构建哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法采用新近建立的抑制消减杂交方法,哮喘治疗前后的嗜酸细胞为试验和对比材料,分离哮喘病人嗜酸细胞中差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T／A连接构建文库,将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选,随机挑取100个白色克隆用菌落PCR进行鉴定。结果扩增消减cDNA文库获得3000余个白色阳性克隆,随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增,90％的克隆中均有200～600bp的插入片段,这些片段可能是哮喘嗜酸细胞差异表达基因的cDNA片段。结论用SSH法及T／A克隆技术成功构建了哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库,该消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆哮喘病人嗜酸细胞差异表达的新基因奠定了基础。     

二烯丙基二硫诱导HT-29细胞差异表达cDNA文库的构建

目的:构建二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人结肠癌HT-29细胞差异表达cDNA文库,以期寻找、克隆DADS特异性作用靶点基因。方法:用120μmol/L的DADS处理人结肠癌HT-29细胞,从DADS处理组及对照组HT-29细胞中提取poly A+RNA,应用高效、灵敏的抑制性消减杂交(SSH)技术构建DADS诱导人结肠癌细胞差异表达cDNA消减文库,再转染大肠杆菌进行文库扩增。结果:成功构建具有高消减效率的DADS诱导人结肠癌细胞差异表达cDNA文库,文库扩增得到了500个克隆,随机挑取100个制备质粒,酶切分析均得到150~1 300 bp大小插入片段,这些片段可能就是载有高度特异性的目的片段。结论:建立了DADS诱导人结肠癌细胞差异表达cDNA文库,为进一步寻找、克隆DADS特异性作用靶点基因奠定了基础。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

醋柳黄酮缓释片的药动学初步研究

目的:研究醋柳黄酮缓释片在家犬体内的药动学过程,测定其药动学参数,计算缓释片相对于普通片的生物利用度。方法:将实验动物分为两组,分别用醋柳黄酮缓释片和普通片进行口服给药,用高效液相色谱法测定血浆药物浓度,应用3P97软件求算药动学参数。结果:醋柳黄酮缓释片及普通片的tm ax分别为4.87 h和2.87 h,Cm ax分别为每小时0.46μg.L-1和每小时0.56μg.L-1,缓释片的相对生物利用度为111.7%。结论:醋柳黄酮缓释片与普通片均符合一室模型,缓释片与普通片具有生物等效性,且醋柳黄酮缓释片有明显的缓释效果。     

主动脉窦瘤破裂的外科治疗

报告２０例主动脉窦瘤破裂修复术的结果。１７例男性，３例女性。年龄７～５６岁。痊愈１９例，另一例因急性肾功能衰竭一周后死亡。作者就发病机理，诊断和合并畸形的处理进行了讨论。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

颅咽管瘤切除术后并发症的处理

目的　讨论颅咽管瘤切除术后并发症的处理原则。方法　分析 36例颅咽管瘤切除术后并发症的临床资料。结果　术后并发尿崩症者 14例、高热 11例、电解质紊乱 8例、消化道出血 3例、癫痫 5例 ,死亡2例。结论　颅咽管瘤术后并发症较多 ,加强早期监测和处理 ,可进一步提高该病的治愈率     

上颌骨牙源性囊肿刮除手术的疗效观察

目的探讨对上颌骨牙源性囊肿患者进行囊肿彻底刮除手术的临床疗效。方法对我科在2010年1月～2017年9月收治的73例上颌骨牙源性囊肿患者行囊肿彻底刮除手术治疗,对患者术区肿胀消退、术后伤口感染、伤口愈合、牙龈再附着、术后复发、骨质改建、骨质修复等情况随访观察。结果 73例患者术后肿胀消退时间为1～4 d。73例患者术后均未发生伤口感染,伤口均一期愈合。所有患者牙龈再附着情况好,术后均未见复发。术后未见并发症。骨质改建效果好,骨质修复的效果因影像学资料过少,缺乏客观依据,暂不下有效结论。结论对上颌骨牙源性囊肿患者进行囊肿彻底刮除手术,术后患者的恢复情况良好,值得在临床治疗上进行推广。     

阴道炎1236例病原检查分析

对１２３６例阴道炎患者的阴道分泌物作直接镜检和病原菌分离培养检查；结果，细菌感染９００例，念珠菌２３４例，滴虫１０２例。９００例细菌经鉴定；葡萄球菌３００例，阴道加特纳菌２７６例，淋病奈瑟菌１７０例，其它细菌１２４例。结果表明，葡萄球菌，阴道加特纳菌，淋病奈瑟菌是细菌性阴道炎最常见的致病菌。     

碱量法测定壳多糖脱乙酰度的方法探讨

目的：评价壳多糖脱乙酰度测定的减量法的影响因素。方法：通过实验评价碱量法的精准度及样本含潮量等因素对测定结果的影响,并对汪氏推荐计算公式和本文作者提出的改良公式作出评价。结果：碱量法测定壳多糖脱乙酰度受样本性状、含潮率、反应体系中酸量的影响。改良公式更能反映样本实际脱乙酰度。结论：碱量法简便易行,评价指标在可接受范围,可用于壳多糖研制中的质量评价。     

喉癌主癌灶手术切缘的临床特点分析

目的探讨研究喉癌主癌灶手术的安全切缘在临床上的特点。方法回顾性分析2007年6月—2011年3月已经确诊喉癌的患者100例,随机分成A、B两组,A组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取镜下观察分析;B组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取肉眼观察分析,将结果进行临床特点分析比较。结果早期的喉癌患者和晚期的喉癌患者的阳性切缘例数,差异无统计学意义（P〉0.05）;晚期的阳性切缘发生次数高于早期的阳性切缘发生次数,差异有统计学意义（P〈0.05）。声门上区[SG]2、3和5、10mm;跨声门型[TG]2、3mm和5、10mm的切缘对比,差异有统计学意义（P〈0.05）。SG、G、TG、IG的2mm和3mm,5mm和10mm对,差异无统计学意义（P〉0.05）。肉眼阳性切缘观察39个,镜下阳性切缘观察43,两者差异无统计学意义（P〉0.05）。结论依据原发不同部位、不同分期和不同范围选取适合的切线,就可以有效地减少阳性切缘的发生。