白藜芦醇对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞增殖、 迁移及管腔形成的影响

目的 观察白藜芦醇(RSV)对高糖培养条件下人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移和管腔形成的影响.方法 将体外培养的HUVEC细胞随机分为空白对照组、甘露醇对照组(30 mmol/L甘露醇)、模型组(30 mmol/L D-葡萄糖)和白藜芦醇低、中、高剂量组.30 mmol/L高糖诱导,并用不同浓度的白藜芦醇(20、40、60μmol/L)干预内皮细胞24 h,分别设置为白藜芦醇低、中、高剂量组.采用CCK-8法检测细胞增殖,Transwell小室及划痕实验检测细胞迁移,基质胶(Matrigel)法检测细胞管腔形成能力.结果 模型组的细胞增殖率、迁移数、划痕愈合率及管腔形成分支点数均明显高于空白对照组及甘露醇对照组(P<0.05).与模型组相比,白藜芦醇干预后,高糖诱导的HU-VEC细胞成管作用减弱,白藜芦醇低、中、高剂量组细胞增殖率、迁移数、划痕愈合率及管腔形成分支点数均明显低于模型组(P<0.05),且与白藜芦醇浓度呈剂量依赖性,当白藜芦醇浓度为60μmol/L时,HUVEC细胞的增殖率、迁移数、划痕愈合率及管腔形成分支点数不仅低于模型组,且低于空白对照组和甘露醇对照组,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 白藜芦醇可以抑制高糖条件下HUVEC细胞增殖、迁移和管腔形成,提示白藜芦醇对高糖诱导的HUVEC细胞损伤具有一定的保护作用,可抑制病理刺激条件下血管生成.     

雷帕霉素抑制人脐静脉内皮细胞增殖与迁移

目的探讨雷帕霉素(Rapamycin)对脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、迁移的抑制作用。方法应用噻唑蓝(MTT)实验、流式细胞仪、迁移实验研究不同浓度雷帕霉素对血管内皮细胞生长因子(VEGF)诱导的HUVECs增殖、迁移的影响。结果雷帕霉素浓度大于10ng/ml、作用48h以上可以明显抑制VEGF诱导的HUVECs的增殖(P<0.05),呈时间、剂量依赖性;流式细胞仪检测细胞被阻滞在G0/G1期,并诱发了细胞凋亡;利用Transwell装置证实雷帕霉素浓度大于10ng/ml时抑制了HUVECs的迁移。结论雷帕霉素可通过抑制血管内皮细胞的增殖与迁移抑制血管生成。     

米非司酮对人脐静脉内皮细胞增殖与凋亡的作用

目的 :研究米非司酮 (MIF)对人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)增殖与凋亡的作用。方法 :应用MTT比色法观察MIF对HUVEC细胞生长的影响 ;采用形态学观察、流式细胞术、免疫组织化学、DNA缺口原位末端标记法 (TUNEL)观察MIF作用前后HUVEC细胞增殖与凋亡变化。结果 :不同浓度MIF均能抑制HUVEC细胞生长。MIF≤ 2 0 μmol L对细胞生长的抑制作用在第 2 4h达高峰 ,此后呈下降趋势。MIF >2 0 μmol L对细胞生长产生剂量依赖性抑制作用。用 4 0 μmol L的MIF处理 72h后 ,HUVEC细胞的增殖降低、凋亡率增加 ,P<0 .0 0 0 1;且伴随ER PR、VEGF表达的下降。结论 :MIF具有抑制HUVEC细胞增殖、诱导HUVEC细胞凋亡的作用。     

TM4SF1对人脐静脉内皮细胞管腔形成的影响

目的研究TM4SF1对内皮细胞体外管腔形成的影响。方法应用qRT-PCR方法检测人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中TM4SF1的mRNA表达量;应用siRNA方法瞬时转染HUVECs,采用qRT-PCR方法检测转染48h与72h后TM4SF1的沉默效果,选择最佳的转染时间,应用In Vitro Angiogenesis Assay Kit观察siControl与siTM4SF1转染后HUVECs体外管腔形成情况。结果qRT-PCR实验结果显示,HUVECs中表达TM4SF1的RQ值为（0．71±0．11）,已知高表达TM4SF1胰腺癌细胞株MPanc96表达TM4SF1的RQ值为（0．56±0．13）,两种细胞中TM4SFl表达量差异无统计学意义（P〉0．05）;siRNA瞬时转染HUVE Cs48h与72E后,TM4SF1表达分别下降了47．06％与93．14％,HUVECs瞬时转染72h后进行体外管腔形成实验,通过对管腔形成情况进行评级,siControl转染后HUVECs管腔形成情况为5级（多个闭合管状结构相连形成筛状）,siTM4SF1转染后为2级（细胞排列形成夹角）。结论TM4SF1在HUVECs中高表达,沉默TM4SF1后可以明显抑制HUVECs的体外管腔形成,提示TM4SF1与肿瘤血管形成相关。     

抵抗素诱导脐静脉内皮细胞功能异常

【目的】研究抵抗素（resistin）对脐静脉内皮细胞功能的影响，以探讨抵抗素在粥样硬化性疾病中的作用及其机制。【方法】原代培养人脐静脉内皮细胞，不同浓度人抵抗素（0、50、100ng／mL）培养24h。流式细胞检测抵抗素对内皮细胞间黏附分子（ICAM-1）、血管细胞间黏附分子（VCAM-1）与活性氧簇（ROS）表达的影响；RT-PCR检测抵抗素对内皮素（ET-1）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表达的影响。【结果】人脐静脉内皮细胞经人抵抗素（50ng／mL、100ng／mL）处理24h后ICAM-1和ET-1mRNA表达显著增高，而各组间VCAM-1表达、ROS生成，以及eNOS和iNOS mRNA表达无明显差别。【结论】抵抗素可通过增加ICAM-1表达，上调ET-1表达直接促进内皮细胞激活，提示脂肪细胞与内皮细胞的相互作用可能是动脉粥样硬化性疾病的发病因素之一。     

人脐静脉内皮细胞的研究和应用

血管内皮细胞在人体多种生理和病理过程中发挥重要作用,一直以来都是研究的热点。其中使用最广泛的当属人脐静脉内皮细胞,然而就其各种亚系细胞有何特点和优劣,国内尚未见报道。现通过总结原代人脐静脉内皮细胞、延长寿命的脐静脉内皮细胞系、永生化的脐静脉内皮细胞系等在医学研究领域的应用和进展,对不同种类之间优势和局限性进行比较,从而更好地指导实际运用。     

人脐静脉内皮细胞的培养与鉴定

目的研究人脐静脉内皮细胞的体外培养方法,并进行细胞鉴定。方法胰蛋白酶灌流消化法收集人脐静脉内皮细胞,加入DMEM/F12混合培养基,37℃5%CO2培养箱中培养,观察细胞形态及生长状况,近融合时消化传代培养。采用形态学观察和CD34免疫组化法进行细胞鉴定。结果原代培养的人脐静脉内皮细胞约于24h完全贴壁,4~5d后融合成单层铺路石样结构。CD34染色证实培养的细胞是人脐静脉内皮细胞。结论胰蛋白酶灌流消化法可获得大量连续传代扩增的人脐静脉内皮细胞。     

尼古丁对人脐静脉内皮细胞凋亡及坏死的影响

目的不同浓度尼古丁对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡及坏死的影响。方法用CD34以免疫组织化学法鉴定HUVECs。通过3种不同浓度的尼古丁(3、30、300 ng/ml)刺激HUVECs 24 h后,用流式细胞仪检测其凋亡及坏死率。结果低浓度尼古丁促进细胞凋亡最强,而随着尼古丁浓度的增加,细胞凋亡率反而逐渐降低,各组差异具有统计学意义(P<0.05);此外,随着尼古丁浓度增加,细胞坏死率也日益增多,各组差异具有统计学意义(P<0.05)。细胞坏死率与尼古丁浓度呈正相关(r=0.675)。结论尼古丁对HUVECs凋亡的影响具有浓度依赖性,细胞坏死率与尼古丁浓度呈正相关。     

干扰人乳腺癌MDA-MB-231细胞 EPCR表达对内皮细胞增殖､迁移及脉管形成的影响

目的 :通过观察干扰乳腺癌MDA-MB-231细胞内皮蛋白C受体(endothelial protein C receptor,EPCR)表达对内皮细胞的增殖、迁移、脉管形成能力的变化,分析EPCR在肿瘤血管形成中的作用。方法:采用si RNA方法降低人乳腺癌MDA-MB-231细胞EPCR的表达,通过RT-PCR及Western blot技术检测EPCR干扰效果,实验分为EPCR干扰组、无关序列组及未处理组。制备肿瘤条件培养基模拟肿瘤微环境培养HUVECs细胞,通过CCK-8法检测各组内皮细胞增殖能力,Transwell小室检测内皮细胞迁移能力,Matrigel检测内皮细胞脉管形成能力。结果:与未处理组及无关列序组相比,EPCR干扰组细胞的增殖、迁移及脉管形成能力均明显降低(P<0.05)。结论:干扰乳腺癌MDA-MB-231细胞EPCR的表达能够抑制内皮细胞增殖、迁移及脉管形成能力,提示EPCR可能在肿瘤血管形成中起重要作用。     

金丝桃素光动力通过抑制HUVECs细胞增殖、迁移和管腔形成抑制血管生成

目的 探讨金丝桃素光动力(hypericin-photodynamic therapy,HY-PDT)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖、迁移及管腔形成的影响,研究抑制血管生成的作用机制.方法 以血卟啉为阳性药,用金丝桃素及血卟啉分别与HUVECs避光孵育24 h后,给予585 nm黄光照射(1.0 J/cm2),24 h后采用MTT法检测不同浓度HY对HUVECs细胞增殖的影响,细胞划痕实验观察HUVECs迁移情况,Matrigel实验观察对HUVECs细胞管腔形成的作用,qRT-PCR检测Smad2基因mRNA的表达,Western blot检测ERK1/2、p-ERK1/2、Smad2表达变化.结果 HY-PDT能够抑制HUVECs细胞增殖、迁移及管腔形成;HY-PDT使HUVECs中ERK1/2磷酸化比率(p-ERK1/2/ERK1/2)显著降低(P＜0.01),并显著下调Smad2mRNA及蛋白表达(P＜0.01).结论 HY-PDT通过抑制ERK1/2蛋白磷酸化活化、降低Smad2 mRNA表达及蛋白水平,使HUVECs细胞增殖、迁移管腔形成受到抑制,抑制血管的生成.     

人脐静脉内皮细胞的原代培养

目的建立一种能大量分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)且操作方便的体外培养方法。方法采用不同浓度的Ⅱ型胶原酶(0.05%,0.1%和0.2%)对HUVEC进行灌注,并分别孵育不同的时间(10min,13min,15min和18min)进行消化,观察细胞的形态、数量以及生长融合情况。结果采用0.1%的胶原酶消化10-13min为最佳条件,经光学显微镜观察培养的细胞数量较多,生长、繁殖状态良好,培养3d左右细胞可达到融合状态。结论本实验建立的胶原酶法消化HUVEC培养方法简便,细胞获得量较多且生长状态良好。     

人脐静脉内皮细胞体外培养方法的改进

目的 建立一种能大量分离人脐静脉内皮细胞(HUVECS)的体外培养方法,为血管内皮细胞的大规模体外实验研究奠定基础.方法 比较0.25%胰酶、0.1%Ⅰ型胶原酶、0.25%胰酶与0.1%Ⅰ型胶原酶(1∶1)3种消化方法分离HUVECs的细胞数量和活细胞率的差异.观察血管内皮细胞生长因子(VEGF)对细胞生长的影响.细胞鉴定采用形态学观察和免疫荧光法检测.结果 0.1%Ⅰ型胶原酶单独或混合0.25%胰酶消化分离细胞数量较多、活细胞率较高(P＜0.05).VEGF能明显促进细胞增殖能力,延长细胞自然生长时间.细胞呈单层"铺路石"样排列,免疫荧光细胞化学法染色,激光买聚焦检测可见胞质中绿色荧光颗粒.结论 Ⅰ型胶原酶与胰酶混合消化HUVECs是获取血管内皮细胞的一种经济且效果较好的方法,添加VEGF能明显促进细胞增殖,可用于构建体外研究血管内皮细胞的模型.     

能量可控陡脉冲对人脐静脉血管内皮细胞的体外作用

目的研究不同剂量的能量可控陡脉冲对体外培养的人脐静脉血管内皮细胞生物学性状的影响.方法对人脐静脉血管内皮细胞施以不同剂量的陡脉冲,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法及细胞增殖曲线观察细胞的损伤效应,流式细胞技术分析作用前后细胞周期的情况.结果①MTT试验证明能量可控陡脉冲对人脐静脉内皮细胞的作用存在剂量-效应关系,其杀伤率随剂量的增加而增加,揭示高剂量的能量可控陡脉冲可导致血管内皮细胞急性损伤效应;②细胞增殖曲线表明随能量可控陡脉冲剂量的增加,对细胞增殖能力抑制越明显;③流式细胞分析结果表明,能量可控陡脉冲处理前后,细胞周期变化不明显.结论能量可控陡脉冲对血管内皮细胞有明显的杀伤和抑制作用.     

hVEGF121基因转染对人脐静脉内皮细胞生长的作用

目的:构建人血管内皮生长因子(hVEGF)-121的真核细胞复制表达质粒,将hVEGF121基因转染进人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),通过旁分泌作用来加快其生长速度.方法:采用RT-PCR方法,从人胚胎成纤维细胞中克隆hVEGF121前体蛋白全长cDNA,构建重组真核表达质粒pcDNA3-hVEGF121,用FuGENE 6介导转染入HUVEC.收集转染的HUVEC培养上清,用ELISA法定量检测hVEGF蛋白的表达情况;绘制细胞生长曲线,检测hVEGF121促进HUVEC增殖的生物学活性.设转染pcDNA3空质粒载体和不转染任何DNA的HUVEC做对照.结果:(1)成功构建了pcDNA3-hVEGF121真核表达质粒,经测序证明基因序列与GenBank中核酸序列一致,且插入方向正确;(2)转染细胞瞬时表达hVEGF蛋白,于转染1d后每104个细胞每天可分泌hVEGF蛋白59.95 Pg,约为对照组的100倍;之后表达水平先快后慢下降,于转染7d后仍较对照组高近1倍;(3)转染细胞生长速度明显加快,在转染3 d后细胞数与对照组相比即有显著性差异(P＜0.01),细胞倍增时间从对照组的7d以上缩短为3d左右.结论:成功构建了pcDNA3-hVEGF121真核表达质粒;该质粒能在HUVEC中表达有生物活性的hVEGF121蛋白,通过旁分泌作用明显促进HUVEC的分裂增殖.     

不同培养基对人脐静脉内皮细胞体外培养效果的影响

目的研究不同培养基对人脐静脉内皮细胞体外培养生长的影响,探讨内皮细胞的最佳体外扩增培养条件。方法取健康产妇分娩后脐带,用胶原酶Ⅰ消化后得脐静脉内皮细胞,进行原代培养,并用免疫荧光染色的方法对细胞进行鉴定,传代培养时则分别采用RPMI-1640培养基和EGM-2培养基,倒置显微镜观察两种培养条件下细胞的生长状态,同时利用流式细胞仪检测其生长周期,对比培养效果。结果 EGM-2组内皮细胞生长良好,2d后贴壁生长的细胞可达90%。EGM-2组S期细胞比例为(29.07±1.48)%,RPMI-1640培养基组S期细胞为(17.58±3.49)%,二者比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 EGM-2培养基更适合人脐静脉内皮细胞的体外传代扩增培养。     

非诺贝特对LPC诱导的人脐静脉内皮细胞增生、凋亡、NO生成及XIAP mRNA表达的影响

目的:探讨非诺贝特对LPC诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增生、凋亡、NO生成及X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)mRNA表达的影响.方法:体外培养HUVECs株CRL-1730,分为正常对照组、LPC组、低浓度非诺贝特组(10 μmol/L)、中浓度非诺贝特组(50 μmol/L)、高浓度非诺贝特组(100 μmol/L).分别观测内皮细胞增生、凋亡、NO生成及XIAP mRNA表达的变化.结果:与正常对照组比较,LPC抑制CRL-1730细胞增生,促进凋亡,降低NO浓度,减弱XIAP mRNA的表达.非诺贝特干预后,CRL-1730细胞增生增强,凋亡减少,NO浓度升高,XIAP mRNA表达增强,且其作用呈时间-效应、浓度-效应依赖关系.结论:非诺贝特可通过促进XIAP表达,干预LPC对HUVECs的影响,使内皮细胞增生增强,凋亡减少,NO浓度升高,从而起到抗动脉硬化作用.     

人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定

目的探讨人脐静脉内皮细胞的原代培养方法,提高体外分离培养血管内皮细胞的成功率。建立血管内皮细胞培养模型,为体外研究血管内皮细胞提供实验基础。方法取2根脐带(至少20 cm)冲净淤血,采用加工穿刺针固定脐静脉灌注消化液,一根用0.2%胶原酶Ⅱ,另一根用0.1%胶原酶Ⅰ和0.25%胰酶等比混合消化液,比较两种酶的消化效果。收集细胞并用含有10 ng/mL的VEGF的培养基中培养,观察细胞的生长及传代。并在倒置显微镜下观察细胞的形态学特点,同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。用流式细胞术观察细胞周期。结果两种消化酶方法均获得了相当数量的人脐静脉内皮细胞,胶原酶Ⅱ的消化效果稍优于混合消化酶,且比较理想的消化时间均为13 min,细胞接种后4～5 h开始贴壁生长,1周左右可生长成单层,光镜下呈多角形,"铺路石"样排列,免疫组织化学法可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。细胞周期显示约有50.6%的细胞处于G0/G1期。结论胶原酶Ⅱ和胶原酶Ⅰ与胰酶等比混合消化液灌注法是获得脐静脉内皮细胞的一种可取方法,而胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液,成功率高,可靠性大,可成功构建体外研究血管内皮细胞的模型。     

人脐静脉内皮细胞体外培养方法

目的探索人脐静脉内皮细胞体外培养方法和注意事项。方法采用0.1%I型胶原酶分离脐静脉内皮细胞,于RPMI-1640和20?S内培养,待细胞80%融合后,以0.25%胰蛋白酶和0.02?TA消化传代,并以倒置光显微镜观察内皮细胞生长情况,以免疫组化方法对内皮细胞进行鉴定。结果原代培养细胞在接种4 h后开始贴壁生长,5~7 d后融合成单层,倒置光显微镜下观察细胞呈鹅卵石状排列,有接触抑制现象,免疫组化显示细胞胞浆内Ⅷ因子相关抗原阳性。结论用胶原酶灌注消化脐静脉是获得内皮细胞的一种较可靠的方法,成活率较高,培养的多个环节均需关注。