siRNA沉默CXCR4基因对食管鳞癌细胞EC9706体外侵袭能力的影响

目的:探讨siRNA沉默CXCR4基因对食管鳞癌EC9706细胞系体外侵袭能力的影响.方法:化学合成两对针对CXCR4基因的干扰序列siRNA1和siRNA2和一对荧光标记的阴性对照siRNA,转染人食管鳞癌EC9706细胞.荧光显微镜下观察转染效率,于转染后48 h采用半定量RT-PCR和Western Blot法检测各组细胞CXCR4 mRNA和蛋白表达水平的变化,Boyden侵袭小室检测各组细胞体外侵袭能力的变化.结果:与未转染组和转染阴性对照siRNA组相比,EC9706细胞转染两对CXCR4 siRNA48 h后,CXCR4 mRNA和蛋白表达水平明显下降(P<0.05),转染siRNA1组CXCR4 mRNA和蛋白下降尤为明显,未转染组和转染阴性对照siRNA组之间无明显差异(P>0.05).Boyden侵袭小室结果显示,转染CXCR4siRNA1和CXCR4 siRNA2组细胞穿膜数与未转染组和转染阴性对照siRNA组相比明显下降(P<0.05),未转染组和单纯转染脂质体转染试剂组之间无明显差异(P>0.05).结论:siRNA沉默CXCR4基因降低EC9706细胞CXCR4的表达和侵袭能力,为...     

靶向CXCR4的siRNA对人食管鳞癌EC9706细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的 探讨CXCR4 siRNA对人食管鳞癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用.方法 建立人食管鳞癌细胞株EC9706裸鼠移植瘤动物模型,瘤旁注射化学合成CXCR4 siRNA,同时以瘤旁注射阴性对照siRNA和PBS为对照.监测肿瘤生长变化,测量瘤质量.HE染色观察肿瘤病理学变化,RT-PCR、免疫组化方法检测CXCR4 mRNA和蛋白变化.结果 裸鼠体内实验结果显示,与对照组比较,CXCR4 siRNA组肿瘤生长受到明显抑制,瘤质量下降;HE染色显示对照组肿瘤体积大、异形明显;RT-PCR、免疫组化结果表明CXCR4 siRNA处理组CXCR4 mRNA和蛋白表达下调.结论 CXCR4 siRNA能抑制人食管鳞癌EC9706细胞株裸鼠皮下移植瘤的形成,且能在体内有效下调CXCR4 mRNA和蛋白的表达.     

反义NF-κBp65寡核苷酸对食管鳞癌细胞EC9706增殖及凋亡的影响

目的:探讨反义NF-κB p65寡核苷酸对食管鳞癌细胞EC9706增殖、凋亡及细胞周期的影响.方法:利用转染试剂KeyGenl介导将反义NF-κB p65寡核苷酸片段体外转染人人食管鳞癌EC9706细胞株.转染72 h后.应用RT-PCR、流式细胞术检测EC9706细胞中NF-κB p65 mRNA和蛋白的表达;MTT法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡和细胞增殖周期.以单纯转染试剂为阴性对照,未转染的EC9706细胞为空白对照.结果:转染72 h后,反义组EC9706细胞中NF-κB p65 mRNA的表达及蛋白标记率与阴性对照和空白对照组比较,下降明显.差异具有统计学意义(P<0.05);反义组EC9706细胞的增殖能力与阴性对照和空白对照组相比明显受抑,抑制率为15.0%;反义组EC9706凋亡细胞数较阴性对照、空白对照组升高,差异具有统计学意义(P<0.05);反义组G.期的EC9706细胞数较阴性对照、空白对照组升高,而S期细胞数较阴性对照、空白对照组降低,差异均具有统计学意义(P均<0.05).结论:特异性阻断NF-κB p65的转录.可以抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡,参与细胞周期调控.NF-κB p65有望成为肿瘤基因治疗的靶点.     

siRNA干扰CXCR4基因对T24细胞侵袭力的影响

目的:研究RNA干扰下调CXCR4基因对膀胱移行细胞癌T24细胞体外侵袭力的影响。方法:根据CX-CR4基因特点,设计合成CXCR4特异性小干扰RNA(siRNA),并转染T24细胞,同时设置空白对照(转染时只加脂质体)和阴性对照(采用无关序列RNA转染)组。通过RT-PCR方法检测CXCR4mRNA的表达,采用Westernblot方法检测CXCR4蛋白的表达,用Boyden小室体外细胞侵袭模型检测细胞体外侵袭能力。结果:各组T24细胞的CXCR4mRNA、蛋白水平和穿膜细胞数比较,差异有统计学意义(F=140.822、473.079和133.247,P<0.001)。siRNA转染组T24细胞的CXCR4mRNA、蛋白表达下调,体外侵袭力减弱(P<0.05)。结论:CXCR4特异性siRNA可降低膀胱移行细胞癌T24细胞体外侵袭力。     

RNAi干扰食管癌EC9706细胞MTA1基因表达对侵袭和迁移的影响

目的 采用RNAi抑制食管癌EC9706细胞株MTA1基因的表达,观察对食管癌细胞侵袭和迁移的影响.方法 用脂质体包裹转染沉默MTA1表达的siRNA表达载体人食管癌细胞EC9706.定量RT-PCR和免疫印迹分别检测MTAl mRNA和蛋白表达情况;划痕损伤实验和细胞体外侵袭实验分别测定迁移和侵袭的影响.结果 定量RT-PCR检测显示,MTA1基因的表达水平明显降低;转染沉默MTA1的siRNA表达载体组的食管癌细胞划痕未愈合,穿透Matrigel的细胞数量明显减少,与未转染组、转染空载体组和转染无关序列siRNA载体组比较差异有显著性(P<0.05).结论 RNA干扰介导的MTA1基因表达沉寂可有效降低食管癌细胞侵袭和迁移;MTA1基因可能成为肿瘤治疗上有前途的分子靶点.     

Cyclin E RNA干扰载体的构建及其对EC9706细胞Cyclin E表达的影响

目的:构建CyclinE基因干扰载体,转染食管癌EC9706细胞,观察其对CyclinE基因表达的影响。方法:设计、合成靶向CyclinE基因siRNA,退火成双链后与pRNAT-CMV3.1/Neo载体连接。转染EC9706细胞后,倒置荧光显微镜下观察细胞转染效果,RT-PCR、Western-blot分别检测CyclinE基因mRNA和蛋白表达水平。结果:构建的2个CyclinE基因siRNA载体插入序列与所设计序列均一致;转染EC9706细胞后,干扰1组、干扰2组与无关siRNA对照组均产生绿色荧光,空白对照组无荧光产生。干扰1组、干扰2组与空白对照组和无关siRNA对照组CyclinEmRNA相对表达量比较,差异有统计学意义(F=15.381,P=0.002),且干扰1组、干扰2组与空白对照组和无关siRNA对照组比较,CyclinEmRNA相对表达量均降低(P均<0.05)。结论:构建的靶向CyclinE基因RNA干扰载体能有效抑制转染细胞CyclinE基因的表达。     

Rab3D对食管鳞状细胞癌细胞系增殖及细胞周期素D1表达的影响

目的探讨Rab3D对人食管鳞状细胞癌细胞系增殖及细胞周期素D1(Cyclin D1)表达的影响。方法采用Western blot法从8株人食管鳞状细胞癌细胞系KYSE410、KYSE450、TE-1、TE-7、KYSE510、KYSE150、EC9706、EC109中筛选出Rab3D表达较低的2株食管鳞状细胞癌细胞株KYSE410、KYSE450及Rab3D表达较高的2株食管鳞状细胞癌细胞株EC109、EC9706,将KYSE410、KYSE450细胞株分别分为转染Rab3D质粒的Rab3D组和转染空载体的对照组,将EC109、EC9706细胞株分别分为转染Rab3D小干扰RNA(siRNA)的Rab3D siRNA组和转染阴性对照的阴性对照组,MTT法检测Rab3D对食管鳞状细胞癌细胞的增殖及Cyclin D1表达的影响,Western blot检测Cyclin D1蛋白的表达。结果 KYSE410、KYSE450食管鳞状细胞癌细胞株转染Rab3D组细胞的吸光度与本细胞株对照组比较,在转染后12 h差异无统计学意义(P>0.05),转染后24、48、72 h均高于本细胞株对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。EC109、EC9706食管鳞状细胞癌细胞株转染siRNA组细胞的吸光度在转染后12、24 h与本细胞株阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),转染后48、72 h均低于本细胞株阴性对照组(P<0.05)。KYSE410、KYSE450细胞转染Rab3D组Cyclin D1蛋白表达水平较本细胞株对照组增高(P<0.05);EC109、EC9706细胞转染siRNA组的Cyclin D1蛋白表达水平较本细胞株阴性对照组降低(P<0.05)。结论 Rab3D促进食管鳞状细胞癌细胞的增殖,机制可能与促进Cyclin D1的表达有关。     

RNA干扰沉默桩蛋白对食管鳞癌EC9706细胞体外侵袭能力的影响

目的:探讨RNA干扰(RNAi)沉默桩蛋白(Paxillin)基因表达对人食管鳞癌EC9706细胞系体外侵袭能力的影响.方法:将食管鳞癌EC9706细胞分为正常对照组、转染siRNA对照组以及Paxillin siRNA组,通过RTPCR和Western Blotting方法检测转染48 h后3组细胞Pariilin、FAK和MMP-2 mRNA和蛋白的表达;通过侵袭小室实验观察3组细胞体外侵袭能力的变化.结果:3组细胞中Palillin、FAK和MMP02 mRNA及蛋白的表达水平相比,差异具有统计学意义(mRNA:F＝7 021、388、20 147.737和5 992.522,P<0.001;蛋白:F=4 454.293,10 003.335和3 802.389,P〈0.001),正常对照组及转染siRNA对照组细胞Paxilliu、FAK和MMP-2 mRNA及蛋白的表达均高于Paxillin siRNA组(P<0.05);3组穿膜细胞数比较,差异具有统计学意义(F=288.741,P(0.001),正常对照组及转染siRNA对照组的穿膜细胞致高于Paxillin siRNA组(P<0.05).结论:RNAi沉默Ptaiilin基因表达可以使EC9706细胞的体外侵袭能力降低.     

乏氧对EC9706细胞多药耐药相关蛋白表达的影响

目的:研究乏氧对人食管鳞状细胞癌EC9706细胞株的多药耐药相关蛋白(MRP)表达的影响,探讨乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)在乏氧引起肿瘤细胞多药耐药中的作用.方法:采用化学性低氧诱导剂氯化钴(CoCl2)体外培养人食管鳞状细胞癌EC9706细胞株,用RNAi沉默HIF-1α基因表达,应用半定量RT-PCR检测HIF-1α基因沉默效果.应用RT-PCR、免疫细胞化学技术检测RNA干扰前后乏氧条件下MRP1蛋白及RNA水平表达的变化.结果:乏氧后EC9706细胞中MRP1 mRNA和蛋白的表达均增加(P<0.05).针对HIF-1α基因的siRNA干扰技术,能有效沉默HIF-1α基因的表达.同样乏氧条件,转染HIF-1α siRNA后EC9706细胞较未转染及转染Control siRNA组细胞相比,MRP1 mRNA和蛋白的表达均减少(P<0.05).结论:HIF-1α上调食管鳞状细胞癌细胞中MRP1的表达可能是乏氧条件下化疗耐药的机制之一;HIF-1α可望成为新的食管鳞状细胞癌治疗的靶点.     

siRNA阻断NF-κB信号通路对食管鳞癌细胞增殖、耐药的影响

目的:通过RNA干扰(RNAi)阻断食管鳞癌细胞中NF-κB信号通路,研究其与肿瘤细胞增殖、耐药的关系.方法:使用NF-κB p65 siRNA分别转染人食管鳞癌Eca109和EC9706细胞72 h,以未转染的Eca109和EC9706细胞为对照,采用Western blot检测p65蛋白的表达;MTT法检测转染NF-κB p65 siRNA 24 h、48 h、72 h后Eca109和EC9706细胞的增殖情况及转染同时联合应用不同质量浓度5-Fu(0 mg/L,16.35 mg/L,32.7 mg/L,327 mg/L,3 270mg/L,6 540 mg/L)对Eca109和EC9706细胞增殖的影响.结果:①NF-κB亚单位p65在Eca109和EC9706细胞质中高表达,p65 siRNA可有效阻断p65蛋白表达.②MTT实验表明,转染组细胞存活率较未转染组明显下降(P＜0.05);与化疗药5-Fu联用,转染组和未转染组细胞的增殖活性随着5-Fu浓度的增加有下降趋势,但在同一浓度,转染p65siRNA的细胞与未转染组相比,细胞增殖活性明显下降(P＜0.05).结论:应用RNAi技术可有效干扰p65的表达,抑制食管鳞癌细胞的增殖,增强对化疗药5-Fu的敏感性.因此,可将阻断NF-κB信号通路作为基因治疗的靶点.     

靶向EGFR基因RNA干扰对胃癌细胞BGC823细胞增殖和凋亡的影响

目的利用R NA干扰技术下调表皮生长因子受体(EGFR)基因的表达,观察其对胃癌BGC823细胞增殖和凋亡的影响。方法将细胞分为3组,空白对照组、空载体组和实验组(转染EGFRshRNA组)。构建针对EGFR基因的s和R NA真核表达载体,转染入胃癌BGC823细胞中,运用R T-PCR和Western blot检测EGFR在mRNA和蛋白水平的变化;WST-1法检测细胞增殖的影响:Hoechst33258染色观察细胞核形态学变化。实验重复3次。结果成功构建表达质粒pGenSil-EGFR并转染BGC823细胞,shRNA下调EGFR的表达后,与空白对照组相比EGFR在mR NA和蛋白水平的表达均下降,抑制率分别为58.6%和75.2%。shR NA转染24、48、72 h,WST-1法检测胃癌细胞BGC823的增殖情况,与空白对照组相比,24 h后三组差异不明显(F=0.326,P>0.05),48 h及72 h后,细胞增殖明显下降(F=68.25及274.45,P<0.001),有统计学意义。EGFR shR NA作用BGC823细胞72 h后,经Hoechst33258染色发现,实验组细胞核染色质边集,出现凋亡小体。结论靶向EGFR基因RNA干扰能够阻抑胃癌细胞BGC823细胞的EGFR表达,诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,EGFR基因有望成为胃癌基因治疗靶点。     

ZNF580过表达对内皮细胞血管内皮生长因子的表达及增殖能力的影响

【目的】研究人锌指蛋白新基因ZNF580过表达对人脐静脉内皮细胞株EA.hy926血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达及增殖能力的变化,为探讨ZNF580基因功能提供科学依据。【方法】重组质粒pEGFP-ZNF580经LipofectamineTM2000脂质体转染法转染EA.hy926细胞,48h后荧光显微镜下观察ZNF580-EGFP在内皮细胞中的表达情况;应用半定量RT-PCR、Western blotting及ELISE法检测转染前后内皮细胞ZNF580和VEGFmRNA、蛋白表达的变化;运用MTT实验检测转染前后内皮细胞增殖能力的改变。【结果】荧光显微镜下示融合蛋白ZNF580-EGFP在EA.hy926细胞核中表达;ZNF580基因过表达后,内皮细胞VEGFmRNA及蛋白的表达均上调(P<0.05),且其增殖能力显著升高(P<0.01)。【结论】ZNF580可以调控EA.hy926细胞VEGF的表达,且ZNF580在内皮细胞增殖过程中具有重要的调节作用。     

IRAK-4基因沉默对人成骨样细胞凋亡的影响

【目的】研究siRNA沉默白细胞介素-1受体相关激酶-4(IRAK-4)基因对人成骨样细胞株MG63凋亡及凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响。【方法】 以Lipofectamine 2000为载体将IRAK-4-siRNA转染入MG63细胞(CON组:不加入任何转染试剂;SC组:以scrambled siRNA序列进行转染;KD组:以特异性IRAK-4-siRNA序列进行转染),应用流式细胞术及TUNEL法检测细胞凋亡水平,western blotting检测Bcl-2、Bax基因的表达。【结果】 与对照组相比,靶基因沉默组(KD组)细胞的IRAK-4 mRNA及蛋白表达水平显著降低;转染48h后,KD组细胞增殖变缓,凋亡增加,Bcl-2蛋白的表达明显下调且Bcl-2/BaxSC>Bcl-2/BaxKD; Spearman等级相关分析显示MG63细胞凋亡比例与Bcl-2/Bax的比值间有显著的相关性。 【结论】 siRNA沉默IRAK-4基因能够诱导人成骨样细胞株MG63凋亡,且靶细胞凋亡水平与Bcl-2、Bax基因表达水平的比值相关.     

siRNA干扰Pokemon基因影响A549细胞增殖的实验研究

目的 研究siRNA干扰Pokemon基因对肺腺癌A549细胞增殖抑制效应的变化.方法 专业设计合成3条针对Pokemon的siRNA,分别转染A549细胞后,RT-PCR检测转录水平Pokemon mRNA表达的变化,筛选出其中最高效的1条siRNA;用MTT法检测该siRNA干扰Pokemon对A549细胞增殖的抑制作用;流式细胞技术检测该siRNA干扰Pokemon对A549细胞凋亡的影响.结果 3条siRNA均成功转染A549细胞,倒置荧光显微镜下观察细胞呈圆绿色.RT-PCR结果显示有2条siRNA使细胞中Pokemon的mRNA表达降低(P＜0.05).MTT法结果显示siRNA干扰Pokemon后对A549细胞增殖有抑制作用(P＜0.05),其中48 h抑制效率达(24.14±1.39)％.流式细胞技术检测结果显示该siRNA干扰Pokemon可增加A549细胞的凋亡,凋亡率为14.05％.结论 应用RNA干扰Pokemon基因能够抑制A549细胞的增殖,促进A549细胞的凋亡.Pokemon基因有可能成为肺癌治疗中的一个新靶点.     

CXCR4基因158沉默对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡及迁移能力的影响

目的 探讨CXCR4基因沉默后对人膀胱癌T24细胞增殖、凋亡、迁移能力的影响。 方法 将T24细胞分为3组,即干扰组、阴性对照组和空白对照组。采用阳离子脂质体转染试剂Lipofectamine 2000将靶向沉默CXCR4基因的小干扰RNA(siRNA)序列转染至膀胱癌T24细胞株中,Western-blot检测转染后T24细胞中CXCR4蛋白的表达水平,MTT比色法检测细胞凋亡,Transwell迁移试验观察T24细胞迁移能力。 结果 转染siRNA后,CXCR4蛋白表达量明显下调(P<0.05),与空白对照组及阴性对照组的T24细胞比较,沉默CXCR4基因后,显著抑制膀胱癌T24细胞的增殖活性(均为P<0.05),促进T24细胞凋亡(均为P<0.05); Transwell实验结果提示,RNAi干扰CXCR4表达后能显著抑制膀胱癌T24细胞的迁移能力(P<0.05)。 结论 RNAi干扰CXCR4表达水平能够抑制T24细胞增殖、促进细胞凋亡及降低细胞的迁移能力,推测CXCR4基因可能是膀胱肿瘤细胞增殖及迁移的重要调控因子之一。     

RNA干扰沉默乏氧诱导因子1α对乏氧条件下食管鳞癌细胞化疗敏感性的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默乏氧诱导因子（HIF）-1α对食管鳞癌EC9706细胞乏氧条件下化疗敏感性的影响及其机制。方法应用化学乏氧法[氯化钴（CoCl2）加入培养液的终浓度为75μmol／L]体外模拟肿瘤乏氧微环境。采用MTS比色法检测常氧培养组和乏氧培养组EC9706细胞在顺铂／紫杉醇作用下细胞的抑制率,以及RNA干扰后乏氧培养细胞在顺铂／紫杉醇作用下细胞的抑制率。应用Western印迹方法检测HIF-1α基因沉默后乏氧诱导HIF-1α蛋白表达变化。用流式细胞仪检测RNA干扰前后乏氧条件下EC9706细胞的细胞周期。结果针对HIF-1α基因的siRNA干扰技术,有效抑制乏氧诱导的HIF-1α蛋白表达。同一药物浓度常氧培养组细胞抑制率均明显高于乏氧培养组（均P〈0．05）。相同药物浓度及相同的乏氧条件下RNA干扰组抑制率均明显高于未转染组及转染control siRNA组（均P〈0.05）。相同的乏氧条件下转染HIF-1α siRNA与未转染组／转染无关对照siRNA组相比,S期显著增加（P〈0．05）、G1期细胞减少（P〈0．05）。结论乏氧条件下HIF-1α诱导EC9706细胞周期停止,可能是乏氧条件下细胞耐药的机制之一。RNA干扰可逆转食管癌细胞EC9706乏氧环境中化疗耐药。     

肝素酶反义寡核苷酸转染的人食管癌EC9706细胞中肝素酶mRNA的表达

目的:探讨肝素酶反义寡核苷营酸对肝毒酶mRNA表达的影响。方法:食管癌EC9706细胞分6组培养,5组分别用设计合成的4条封闭肝素酶不同基因位点的反义寡核苷酸(ASODN1、ASODN2、ASODN3、ASODN4)及1条无关寡核苷酸(N-ODN)转染,另1组不转染。采用完整细胞原位杂交技术观察各组EC9706细胞中肝素酶mR-NA表达情况。结果:4条肝素酶反义寡核苷酸转染的EC9706细胞中肝素酶mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05),但均显著低于无关寡核苷酸组(P<0.05)。结论:肝素酶反义寡核苷酸序列可抑制食管癌EC9706细胞中肝素酶mRNA表达。     

HIF-1α对间充质干细胞SDF-1/CXCR4的调控作用研究

[目的]探讨缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）对间充质干细胞基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1,SDF-1）/CXC趋化因子受体4（chemokine receptor 4,CXCR4）的调控作用。[方法]贴壁法培养ICR小鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）;采用RNA干扰技术用SuperFectinTMⅡ转染HIF-1αsiRNA于MSCs;实验分为五组：常氧组、缺氧组、转染Control siRNA组、转染HIF-1αsiRNA常氧培养组、转染HIF-1αsiRNA缺氧培养组;RT-PCR检测HIF-1α、SDF-1α、CXCR4 mRNA表达水平;Western blotting检测HIF-1α、SDF-1α、CXCR4蛋白表达水平。[结果]同常氧组比较,缺氧组HIF-1α、SDF-1α、CXCR4 mRNA及蛋白表达水平提高（P〈0.05）;同转染Control siRNA组比较,转染HIF-1αsiRNA常氧培养组HIF-1α、SDF-1α、CXCR4 mRNA及蛋白表达水平降低（P〈0.05）;同缺氧组比较,转染HIF-1αsiRNA缺氧培养组HIF-1α、SDF-1α、CXCR4 mRNA及蛋白表达水平降低（P〈0.05）。[结论]缺氧可使MSCs的HIF-1α、SDF-1α、CXCR4的表达提高,常氧与缺氧条件下抑制HIF-1α的表达可使SDF-1α、CXCR4的表达降低,HIF-1α在间充质干细胞中对SDF-1/CXCR4有调控作用。