神经中间丝蛋白Nestin在胎肝中的表达

目的 采用免疫组织化学方法标记不同发育时期人胚胎肝干细胞中巢蛋白(Nestin)的表达，探讨肝干细胞新的表面标志蛋白。方法 取材不同发育时期胎儿肝脏，固定并制成石蜡切片，ABC法标记神经前体细胞的特异性表面标记Nestin在胎肝干细胞中的表达。结果 汇管区周边界板处卵圆样干细胞表达Nestin阳性，Nestin阳性细胞呈单层紧密排列成管，呈鞘样包绕着早期汇管区，部分包绕着初级汇管区，随着次级汇管区的成熟，Nestin阳性卵圆样干细胞逐渐局限于赫令管周围；此外胚胎发育不同时期可见Nestin阳性单个核样细胞散布在肝实质内。结论 肝脏内有Nestin表达阳性的干细胞存在，其功能、来源需要进一步深入研究。     

化学致癌剂3''''-甲基-4-DAB影响巢蛋白Nestin在SD大鼠肝卵圆细胞中的表达

目的：采用免疫组化方法标记大鼠肝卵圆细胞中巢蛋白Nesin的表达，探讨肝卵圆细胞新的表面标记蛋白。方法：用化学致癌剂3’-甲基4-二甲基氨偶氮苯(3’-Methy-4-dimethylaminoazobenzen，3’-me-DAB)喂养SD大鼠4周，取大鼠肝脏，用免疫组化法标记神经前体细胞的特异性表面标记物巢蛋白Nestin在大鼠肝卵圆细胞中的表达。结果：汇管区靠近界板处卵圆细胞表达Nestin阳性，Nestin阳性细胞成簇状分布或呈双层排列成管状，主要集中在赫令氏管周围并见Nestin阳性细胞向肝小叶内迁移，散在分布于肝细胞索。结论：大鼠肝内存在Nestin表达阳性的卵圆细胞，Nestin可能是肝卵圆细胞新的标记蛋白。     

化学致癌剂3'-甲基-4-DAB影响SD大鼠肝干细胞的增殖与迁移

目的 采用免疫组织化学技术标记SD大鼠肝干细胞中OV6、CD34的表达,探讨肝干细胞与造血干细胞之间的关系.方法 用化学致癌剂3'-甲基-4-二甲基氨偶氮苯(3'-methy-4-dimethylaminoazobenzen, 3'-me-DAB)喂养SD大鼠4周,取大鼠肝脏,用免疫组化法标记卵圆细胞的特异性标记物OV6与造血干细胞标记物CD34在大鼠肝干细胞中的表达.结果 汇管区靠近界板处卵圆细胞同时表达OV6与CD34,阳性细胞成簇状分布,主要集中在赫令氏管周围,并见OV6和CD34阳性细胞向肝小叶内迁移,散在分布于肝细胞索;在肝实质内还分布着大量的表达OV6与CD34阳性的单核样干细胞;在肝实质内还可见多个CD34阳性小集落,集落内或周围也可见少许单核样干细胞.结论 3'-me-DAB刺激大鼠肝内卵圆细胞大量增生的同时,还可刺激骨髓造血干细胞增生并向肝内迁移与分化.     

成年大鼠纹状体神经干细胞的体外培养及分化

目的 探讨成年大鼠纹状体神经干细胞多向分化的可能性。方法 分离成年大鼠纹状体神经干细胞,单克隆连续传代培养并诱导分化,将分化产物进行免疫细胞化学染色及RT-PCR检测分析。结果 无血清单克隆培养时期可见大量的细胞团出现,以血清诱导分化后出现多种细胞类型,免疫细胞染色发现分化细胞中有Nestin阳性、NSE阳性、GFAP阳性细胞,RT-PCR法分析mRNA水平有脑因子-1、γ-氨基丁酸α-受体γ-亚单位、酪氨酸羟化酶及色氨酸羟化酶等基因的表达。结论 成年大鼠纹状体内分离出的干细胞样细胞具有自我增殖和多向分化潜能。     

人脐血单个核细胞诱导分化为神经元样细胞

目的 探讨人脐血单个核细胞体外向神经元样细胞定向诱导分化的条件。方法 无菌条件下采集正常人脐血,分离单个核细胞。用DMEM/F12培养基进行纯化和扩增培养。取扩增5代的间充质干细胞(MSC),分别用β-巯基乙醇(β-ME)、二甲基亚砜(DMSO)、神经条件培养液诱导脐血MSC向神经元样细胞分化。免疫组化法检测脐血MSC的Nestin表达和神经元样细胞特异性标志。结果 脐血原代和2、5代MSC的Nestin表达阳性率分别为6.7%、12.4%和20.8%。神经条件培养液诱导神经元样细胞阳性率最高达36%,β-ME、DMSO分别为33%和25%。结论 脐血MSC具有神经干/祖细胞的特性,在一定条件下能向神经元样细胞分化。     

肝脾γδT细胞淋巴瘤的临床病理学观察

目的 探讨肝脾γδT细胞淋巴瘤的临床病理学特征和免疫表型。方法 应用常规病理、免疫组化观察1例肝脾γδT细胞淋巴瘤并对相关文献进行调研。结果 患者肝脾明显增大,镜下显示瘤细胞弥漫浸润脾脏红髓血窦,瘤细胞中等大,胞浆淡染,核染色质较细腻,核仁不明显。肝脏血窦内瘤细胞呈佛珠状或线样浸润,免疫表型:瘤细胞表达CD45RO、CD3和TIA-1,而CD57、CD20和CD79a等标记阴性。结论 肝脾γδT细胞淋巴瘤是较为罕见的外周T细胞淋巴瘤,预后较差,应注意与其他淋巴瘤和白血病的鉴别。     

人胎肺发育不同阶段端粒酶逆转录酶的表达及意义

目的 检测端粒酶逆转录酶(hTERT)在人胎肺发育不同阶段的表达特征,探讨其在胎肺上皮干细胞发育、分化过程中的作用及意义。方法 对孕妇自愿捐献的胎龄为10~34周的引产胎儿肺组织,用免疫组织化学技术检测hTERT的表达。结果 胎龄10周的肺组织即检测到hTERT的表达,主要表达于正在分支的支气管原始上皮细胞浆内。随着胎肺发育,阳性表达的细胞逐渐向远端呼吸道迁移。到发育晚期,呼吸道上皮hTERT表达较前逐渐减弱,强阳性表达的细胞仅集中在细支气管的基底膜和少数新生肺泡内,在形态上类似基底细胞和Ⅱ型肺泡细胞。结论 在人胎肺发育中hTERT的表达可能是肺上皮干细胞或祖细胞维系其未分化状态和自我更新能力的重要标志;对保证支气管上皮和肺泡上皮细胞持续正常分化和再生,维持上皮组织的完整性起着重要的作用。     

间介中胚层样细胞在肾脏再生中的应用

目的 体外诱导脂肪干细胞分化为间介中胚层样细胞,对肾脏脱细胞支架进行再细胞化,经共培养构建有部分肾脏结构的组织工程肾脏。方法 手术获取Wistar大鼠腹股沟脂肪垫,从中分离、培养原代脂肪干细胞后对其进行干细胞特性鉴定。经过在不同阶段添加糖原合成酶激酶3抑制剂(CHIR99021)和成纤维生长因子9(FGF9),诱导脂肪干细胞分化为间介中胚层样细胞,并于诱导7 d后进行间介中胚层相关蛋白鉴定。将诱导成功的间介中胚层样细胞结合制备好的肾脏脱细胞支架进行共培养,10 d后获取再细胞化的组织工程肾脏,并对其进行肾脏分化的鉴定。结果 获取的脂肪干细胞具有成骨成脂及成软骨分化的能力,能表达脂肪干细胞表面标志物。体外诱导7 d后得到的间介中胚层样细胞经过免疫荧光鉴定可以观察到锌指蛋白转录因子和配对盒基因-2的阳性表达,Western blot验证可得到同样的阳性结果。结合肾脏脱细胞支架后培养10 d,通过免疫荧光鉴定可以观察到Wilms肿瘤基因1、GATA连接蛋白-3和E-钙黏素的阳性表达。结论 脂肪干细胞可被诱导分化为间介中胚层样细胞,诱导后的间介中胚层样细胞结合肾脏脱细胞支架可以观察到肾系分化的现象。     

同种异体骨髓间质干细胞移植在大鼠肝内定居能力初步研究

目的 探索绿色荧光蛋白标记的大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)经不同途径移植到同种异体大鼠后其定居于肝脏的能力。方法 从大鼠骨髓中分离培养获取MSCs,以绿色荧光蛋白进行标记,体外扩增后,分别从大鼠尾静脉和门静脉注入同种异体正常和肝脏损伤大鼠体内,于移植后的第3、7天通过荧光定量PCR检测移植的MSCs在大鼠肝内的表达情况。结果 所有大鼠移植同源异体MSCs后全部存活,无意外死亡。从门静脉、尾静脉注入MSCs,在大鼠肝脏受损时其定居量大于非肝脏受损大鼠(P<0.05)。在肝细胞受损大鼠,从门静脉注入MSCs与从尾静脉注入比较肝脏定居量差异不显著(P>0.05)。非肝脏受损大鼠,从门静脉注入MSCs与从尾静脉注入比较细胞定居于肝脏量差异显著(P<0.05),并与移植后时间有关。结论 干细胞定居于肝脏的时间与细胞数量可能与肝脏是否受损伤关系密切,与移植途径关系不密切;在正常动物干细胞可定居于肝脏,定植的细胞量与移植途径和移植后时间有关。     

脑源性神经营养因子体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的 探讨脑源性神经营养因子(BDNF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞的作用及其对诱导后的神经元样细胞保护作用,为治疗神经系统疾病提供更优良的细胞。方法 体外培养MSCs至第5代后,分别用BDNF、β-巯基乙醇(β-ME)诱导MSCs,诱导后的第1、3和6小时计算两组神经元样细胞数,对各时间点两组神经元样细胞阳性率进行了比较;诱导后行神经细胞标记抗体的免疫细胞化学、RT-PCR及蛋白质印迹鉴定。结果 两组诱导剂诱导后的细胞均呈神经元样细胞的形态;BDNF组诱导分化后细胞的存活时间远较β-ME组长;BDNF组在诱导后6h近于诱导高峰,而β-ME在诱导2h即达高峰,但随后神经元样细胞渐死亡。免疫细胞化学结果显示在两组诱导后细胞的巢蛋白(Nestin)、神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、神经丝蛋白(NF)表达均呈阳性,而胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达呈阴性;RT-PCR显示NSE、NFL,MAP-2的mRNA表达阳性,GFAP有较弱的表达;蛋白质印迹可见两组诱导剂诱导的细胞均表达神经元的特异性标记抗体NSE。结论 BDNF能单独诱导MSCs分化形成神经元样细胞,而且分化后细胞的存活时间长,有望用于治疗脑缺血、神经变性等疾病。     

胎鼠肝nestin阳性细胞的分离培养和诱导分化研究

目的建立胎鼠肝nestin阳性细胞的体外分离、培养和诱导分化的方法。方法采用机械分离法结合悬滴培养法获得胎肝干细胞,原代培养2d后改变培养基,添加含20%胎牛血清的DMEM(含25ml/L葡萄糖,100U/ml青链霉素,pH值7.6),添加烟酰胺10mmol/L,胰岛素1mg/L,N2添加剂,碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、干细胞因子、白血病抑制因子各20μg/L诱导分化为nestin阳性细胞。结果和结论大鼠胎肝内存在nestin阳性细胞,在体外扩增后加入诱导剂可定向分化为胰岛β细胞。     

Adipose tissue-derived stromal cells express neuronal phenotypes

Background Adipose tissue-derived stromal cell (ADSCs) can be greatly expanded in vitro, and induced to differentiate into multiple mesenchymal cell types, including osteogenic, chondrogenic, myogenic, and adipogenic cells. This study was designed to investigate the possibility of ADSCs differentiating into neurons. Methods Adipose tissue from rats was digested with collagenase, and adherent stromal cells were cultured. A medium containing a low concentration of fetal bovine serum was adopted to induce the cells to differentiate. ADSCs were identified by immunocytochemistry, and semi-quantitative RT-PCR was applied to detect mRNA expression of neurofilament 1 (NF1), nestin, and neuron-specific enolase (NSE). Results Nestin-positive cells were found occasionally among ADSCs. ADSCs were found to express NSE mRNA and nestin mRNA, but not NF1 mRNA. ADSCs could differentiate into neuron-like cells in a medium composed of a low concentration of fetal bovine serum, and these differentiated cells displayed complicated neuron-like morphologies. Conclusions The data support the hypothesis that adipose tissue contains stem cells capable of differentiating into neurons. These stem cells can overcome their mesenchymal commitment, and may represent an alternative autologous stem cell source for CNS cell transplantation.     

胶质瘤U251细胞中CD133表达及干细胞特性分析

目的： 探讨CD133⁺细胞的生物学特性,分析CD133作为胶质瘤干细胞标记的可行性。方法： 利用免疫荧光染色检测U251细胞中CD133、巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶( NSE )、神经胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)等蛋白表达,分析CD133⁺细胞与CD133^－细胞中巢蛋白、NSE、GFAP阳性细胞存在的差异。结果： U251中CD133⁺细胞比例为0.060±0.003,在CD133⁺细胞中,巢蛋白阳性细胞,NSE和GFAP阴性细胞比CD133^－中明显增多;在CD133^－细胞中,也存在巢蛋白阳性细胞,数目较CD133⁺中明显减少,相反巢蛋白阴性细胞,NSE和GFAP阳性细胞明显增多。结论： 胶质瘤U251细胞存在CD133⁺细胞,在CD133阳性和阴性细胞中,均存在干细胞样细胞,但是在CD133⁺细胞中此类细胞更多。     

大鼠成体肝卵圆细胞分离培养及诱导分化的初步研究

目的 通过成体大鼠肝卵圆细胞分离培养获取纯净的干细胞并观察诱导分化前后从肝卵圆细胞到肝细胞的形态变化.方法 采用AAF/PH肝干细胞刺激模型,胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞的方法,用地塞米松、DMSO和EGF、HGF、SCF、LIF等生长因子联合应用诱导肝卵圆细胞增殖和分化为肝实质细胞.观察肝卵圆细胞到肝细胞形态变化过程,用免疫荧光技术,Western blotting分析检测了干细胞标志c-kit和RT-PCR分析法检测肝干细胞白蛋白和CK19 mRNA表达鉴定卵圆细胞.结果 分离得到的肝卵圆细胞活度达到90%,细胞形态包括大小和颜色呈不均质,卵圆细胞直径是肝细胞直径的1/4～1/6.诱导后出现大而圆的肝细胞,可见卵圆细胞到肝细胞的中间变化过程,新分离的肝卵圆细胞在生长因子诱导下有向肝细胞分化的特性.经c-kit免疫荧光染色显黄绿色荧光,Western blotting检测肝卵圆细胞有c-kit蛋白条带,而大鼠肝细胞及胆管细胞则未出现条带.PCR分析显示卵圆细胞有CK19和白蛋白mRNA表达.结论 新分离的肝卵圆细胞同时表达c-kit,CK19和白蛋白3种抗原,诱导分化出现一系列从卵圆细胞到肝细胞的形态学变化,这种现象证明分离的肝卵圆细胞就是肝干细胞,经诱导分化可以产生成熟的肝细胞,成为进一步研究肝干细胞生物学特性的基础.     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.     

大鼠肝卵圆细胞增殖模型建立及其纯化鉴定

为建立大鼠卵圆细胞增殖模型，分离纯化卵圆细胞并对其特性进行研究，SD大鼠喂饲2-乙酰氨基芴(2-acetyailamif1uorene，2-AAF)，剂量分别为5、10、15、20mg／kg，连续给药6d，于第7天行三分之二部分肝切除，术后继续给药1周，每隔3d取肝组织行常规组织学观察，作细胞增殖试验及免疫组化染色。通过免疫磁珠标记C-kit阳性细胞以纯化卵圆细胞(Magnetic activated cell sorting，MACS)，用免疫细胞化学及RT-PCR对纯化细胞进行鉴定。结果：10、15、20mg／kg三种剂量2-AAF均可成功建立卵圆细胞增殖模型，卵圆细胞增殖于第8天较明显，至第11天达高峰，第14天有所减少。卵圆细胞胞核Brdu染色阳性，其除表达卵圆细胞特异性抗原OV6外，尚表达肝细胞标记白蛋白及胆管细胞标记CKl9。胚胎期肝细胞抗原AFP、连接蛋白43在卵圆细胞中亦有高表达，同时还表达造血干细胞标记C-kit。以MACS纯化的C-kit阳性卵圆细胞，90％以上为OV6阳性，并有AFP、白蛋白、CK19 mRNA转录。结论：2-AAF剂量为10～20mg／kg时可获得满意的大鼠卵圆细胞增殖模型，增生的卵圆细胞为具有双向分化潜能的肝干细胞／前体细胞，利用C-kit标记通过MACS可纯化这种肝干细胞／前体细胞。     

微管相关蛋白2和巢蛋白在人胚胎胃组织中的表达

摘要：目的探讨微管相关蛋白2 (MAP-2)和巢蛋白(Nestin) 与人胚胎胃组织的发育关系。方法应用免疫组织化学PV法检测第
2、3、4三个月龄段,人胚胎胃壁、贲门和幽门组织内MAP-2和Nestin的表达规律。结果第2、3、4三个月龄段,MAP-2和Nestin阳
性表达主要集中于人胚胎胃壁、贲门和幽门组织黏膜下神经丛和肌间神经丛,随胎龄的增大,MAP-2和Nestin蛋白在肌间神经
丛内阳性表达细胞数量和强度均呈增高趋势。而MAP-2和Nestin蛋白在胃壁、贲门和幽门组织的黏膜上皮和腺体处均呈阴性
表达。结论MAP-2和Nestin参与调节人胚胎胃组织的生长发育过程。
     

ISLET FORMATION AND REGENERATION

INSULIN DEPENDENTdiabetesmellitus(ID DM)occurredinhumanwhenamajorityofβcellsaredestroyed.Itisreportedthatpancreaticstemcellsofpancreaticductintheadultareabletodiffer entiatetoisletcellsafterlong termculture.Pancreaticstem cells,agroupofpluripotentcells,h…     

大鼠肝脏卵圆细胞干细胞特性的研究

目的探讨大鼠肝脏卵圆细胞体外培养扩增及其干细胞特征。方法采用2-乙酰氨基芴/四氯化碳方法建模,胶原酶灌流和流式细胞术分选纯化卵圆细胞,进行培养和扩增。透射电子显微镜观察肝脏卵圆细胞的超微结构,免疫细胞化学法检测干细胞标志物OV-6、c-kit和Thy-1.1的表达;RT-PCR法检测卵圆细胞内c-kit、肝细胞标志物(HNF-4α、AFP)和胆管细胞标志物(CK-7、CK-19)的基因表达;Western blotting法检测OV-6和AFP蛋白的表达。结果大鼠肝脏组织可见明显的卵圆细胞增生,成簇分布,逐渐向肝实质内延伸。细胞体外培养可达40 d以上,细胞体积较小,多呈圆形和卵圆形。透射电子显微镜下可见细胞直径5～10μm,细胞核大,胞质少,核/质比例大,细胞器少,仅见少量线粒体和内质网。免疫细胞化学检测显示,细胞表面OV-6、c-kit和Thy-1.1染色阳性;RT-PCR检测显示,卵圆细胞内有c-kit、HNF-4α、AFP、CK-7和CK-19基因表达;Western blotting检测显示,OV-6蛋白持续表达,AFP蛋白表达逐渐增强。结论大鼠肝脏卵圆细胞体外可大量扩增并且保留其干细胞和双向分化潜...