脱细胞软骨支架材料修复兔关节软骨缺损

目的 观察异种异体脱细胞软骨支架材料(ACM)复合同种异体兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)修复兔股骨内髁关节软骨缺损的效果.方法 (1)密度梯度离心和差速贴壁法获得原代兔BMSCs,选择第3代BMSCs作为种子细胞;(2)利用冷冻干燥、胰酶消化和化学去垢剂等方法制备脱细胞软骨支架材料;(3)3个月龄新西兰兔股骨内髁制备直径4 mm,深3 mm砌关节软骨缺损模型,24只新西兰兔以2个时间段随机分为3组,Ⅰ ACM-BMSCs组:第3代BMSCs 1×106个/ml与ACM于37℃5%CO2饱和湿度复合48 h;Ⅱ ACM组;Ⅲ空白对照组.(4)移植6、12周后大体及组织学观察,免疫组织化学染色观察修复组织Ⅱ型胶原,Wakitani评分评估修复效果.结果 (1)大体观察及组织学观察:6和12周Ⅰ组再生组织与正常关节软骨面平齐,修复部位表面较平整,界限模糊,接近正常软骨.Ⅱ组修复组织表面不平整并有明显下陷,修复组织全层可见成纤维样细胞,深层可见极少数透明软骨样细胞.Ⅲ组未见明显修复,肉芽组织形成伴成纤维样细胞增生;(2)Wakitani组织学评分可见在不同的时间段I组和Ⅱ组均低于Ⅲ组,差异有统计学意义(P<0.05),Ⅰ组和Ⅱ组间组织学评分差异无统计学意义(P>0.05).(3)免疫组织化学:ACM-BMSCs组修复组织的细胞为软骨样细胞,可见柱状排列,周围软骨基质Ⅱ型胶原染色阳性.结论 以ACM为支架材料,同种异体BMSCs为种子细胞制备的组织工程化软骨对兔股骨内髁关节软骨缺损有修复作用,形成的新生软骨为透明软骨样组织.     

组织工程方法修复关节软骨缺损

骨性关节炎或外伤等造成软骨丢失而引起的关节疼痛是中老人残疾的重要原因.关节软骨自身修复能力十分有限,因此,关节软骨损伤通常会导致更严重的关节软骨退变[1,2].骨科医生们采用软骨下骨钻孔、微骨折、软骨移植、自体软骨细胞移植等方法来修复和重建关节软骨,许多技术已被广泛应用于临床,并且取得了良好的短期随访结果.组织工程学科的兴起为关节软骨修复提供了新的选择,其基本原理为体外培养扩增的细胞结合基质材料构建出新的软骨组组织以供移植.本文就关节软骨修复的现状,尤其是组织工程方法重建软骨的方法做一综述.     

同种异体组织工程化软骨修复关节软骨缺损

目的：探讨应用同种异体组织工程化软骨修复软骨缺损的可行性。方法：取新西兰大白兔双膝关节软骨细胞，经体外培养扩增，与PlruonicF127混合，植入人为造成的异体兔膝关节软骨缺损。结果：空白对照组和材料对照组只见少许纤维组织修复，缺损凹陷。实验组8周后关节软骨缺损区由部分白色透明样软骨组织充填，Masson三色染色见胶原分布较均匀，软骨陷窝多见，未见明显炎症现象，16周后缺损完全修复，缺损表面较光滑，部分颜色呈淡兰色，软骨陷窝清晰，细胞与基质分布均匀，未见炎症和退变现象，结论：同种异体组织工程化软骨可用于修复关节软骨缺损。     

自体骨软骨镶嵌移植术修复关节软骨缺损

目的：回顾性分析关节镜下自体骨软骨镶嵌式移植术治疗负重面关节软骨损伤的可行性。方法：采用Smith Nephew镶嵌式骨软骨移植器，在关节镜下挖取膝关节非负重关节面骨软骨条，并将之移检修复膝关节负重面的局灶性软骨缺损。结果：手术15例，术后随访7—12个月，平均9个月，均达到优良效果。结论：自体关节骨软骨镶嵌移植术对关节负重面局灶性软骨缺损有较好、确实的治疗效果。     

组织工程软骨修复兔关节软骨缺损的初步研究

目的 探讨运用组织工程软骨植入修复兔胫骨平台外侧髁全关节软骨浅层缺损的可行性。方法 取2周龄乳兔软骨细胞体外培养传代至第3代后，与人胎盘I型胶原蛋白海绵复合后植入成年兔的胫骨体平台外侧髁浅层完全软骨缺损区，并设立空白对照组，分别于术后4、12和24周取材，观察修复效果。结果 实验组术后4周缺损表面未见明显的新生软骨形成；12周，缺损表面有少量的新生软骨形成，组织学切片上可见软骨细胞呈边缘不规则的，小蜂窝状结构，软骨细胞周围有软骨陷窝形成；24周，缺损表面的新生软骨较4、12周的新生软骨明显，表面光滑，且与周围组织结合紧密，但仍存在部分缺损尚未修复。组织学切片上可见软骨陷窝形成，并分泌甲苯胺蓝异染的软骨基质。面对照组则均未见明显的修复。结论 制成的组织工程软骨对兔胫骨平台软骨浅层完全缺损有修复作用，但不能完全修复缺损。     

骨髓间充质干细胞复合消旋聚乳酸/明胶修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的 研究骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）复合消旋聚乳酸（poly-L-lacticacid，PLLA）／明胶修复兔膝关节全层软骨缺损的效果。方法 4～6月龄青紫兰兔36只，体重2．5～3．5kg，雌雄不拘。体外分离培养MSCs，取第2代MSCs种植于PLLA／明胶支架体外复合培养。将36只青紫兰兔制备双侧膝关节全层软骨缺损模型，根据修复方法不同随机分为A、B、C3组（n=12）。A组，将MSCs与PLLA／明胶支架材料复合物植入兔双膝缺损处；B组，将单纯PLLA／明胶支架材料植入兔双膝缺损处；C组，缺损处不作任何处理，作为对照。A、B组在植入时均加入25μg／L转化生长因子β（transforming growth factorp1，TGF-β1）0．4ml。分别于术后4、8和12周，取材行大体、组织学及免疫组织化学染色观察，并将12周大体及组织学标本按照O’driscoll等评分标准进行评分。结果大体观察：术后12周，A组修复组织与正常软骨结合处完整，表面光滑，界限模糊；B、C组缺损处修复组织呈纤维组织或无修复，表面不平整或呈虫蚀样改变。组织学观察：A组术后4周，细胞数较多，呈梭形、圆形或椭圆形；8周修复组织与周围软骨大部分结合，细胞呈圆形，以透明软骨样细胞为主，有软骨陷窝，表层有梭形纤维样细胞；12周修复组织细胞为透明软骨样细胞，柱状排列，与周围软骨及软骨下骨整合良好；B组，术后4～8周细胞数较少，细胞层次排列差；12周修复组织菲薄，呈纤维软骨样，基质染色接近正常；C组，术后4～8周缺损组织由薄层纤维组织覆盖；12周缺损区纤维组织进一步增厚，与周围软骨未结合。免疫组织化学染色显示，A组修复组织Ⅱ型胶原染色呈阳性，B组呈弱阳性，C组无表达。术后12周大体观察总评分，A、B及C组分别为2．75±0．89、4．88±1．25和7．38±1．18，A组优于B、C组，B组优于C组，且差异均有统计学意义（P〈0．05）；组织学观察总评分，A、B及C组分别为3．88±1．36、8．38±1．06和13．13±1．96，A组与B、C组以及B组与C组差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论 应用软骨组织工程原理，以PLLA／明胶为支架材料复合自体MSCs移植是一种修复软骨缺损行之有效的方法。     

组织工程骨修复节段性骨缺损的实验研究

目的 探讨用多孔β-磷酸三钙生物陶瓷（β-tricalcium phosphate,β-TCP）与自体骨髓问充质干细胞（autologous bone marrow mesenchymal stem cells,MSC）构建组织工程骨修复节段性骨缺损的效果。方法 在羊左跖骨中段形成21mm长的骨缺损,实验组植入组织工程骨;对照组单纯植入β-TCP;空白组骨缺损不作处理。术后1、3、6个月分批处死动物,缺损区行放射学、组织学、生物力学和扫描电镜等检测。空白对照组6个月取材。结果 实验组,骨缺损部位新生类骨样组织、编织骨和板状骨出现的时间都较对照组早,并且不经软骨介导即能直接成骨,而对照组以“爬行替代”方式修复骨缺损。放射学和生物力学检测显示术后6个月实验组骨缺损几乎完全修复,对照组部分修复,而空白组未愈合。结论 组织工程骨能加速骨缺损愈合的速度,其修复过程可超越“爬行替代”阶段;组织工程骨是治疗节段性骨缺损的一种较好选择方式。     

同种异体骨软骨移植修复关节软骨缺损研究现状

关节软骨缺损常因软骨再生能力低而难以自行修复.新鲜的同种异体骨软骨移植修复关节软骨缺损的疗效稳定,成功率逐渐提高.冷冻保存的同种异体骨软骨移植修复关节软骨缺损的成功率可与新鲜的同种异体骨软骨移植媲美,梯度降温法是目前保存软骨细胞存活率最好的冷冻方法.该文就同种异体骨软骨移植的实验和临床研究、免疫排斥问题及其相关研究动态作一综述.     

应力环境下三维诱导组织工程种植细胞修复关节软骨缺损

目的:三维立体诱导非软骨来源种植细胞修复关节软骨损伤.方法:分离培养骨髓间充质干细胞,分组诱导,进行周期性应力刺激,设立对照.2周后,观测大体、组织学形态、生化指标,筛选最佳诱导方法修复关节软骨缺损模型,分别于12、24周取材,进行组织学观察及评分,验证长期修复效果.结果:与二维培养各组相反,立体培养各组出现明显软骨分化,并以凝胶微球悬浮细胞进行应力刺激培养组效果最佳.术后动物肢体功能优良,12周后软骨缺损被完整修复,表面光滑,质地坚硬,为透明软骨结构,与周围软骨结合紧密;24周后仍然保持透明软骨结构,组织学评分无变化.对照各组软骨缺损均未被修复.结论:立体软骨诱导优于平面诱导,应力环境提高诱导质量,获得的种植细胞可取得稳定的长期修复效果.     

应力环境下三维诱导组织工程种植细胞修复关节软骨缺损

目的：三维立体诱导非软骨来源种植细胞修复关节软骨损伤。方法：分离培养骨髓间充质干细胞，分组诱导，进行周期性应力刺激，设立对照。2周后，观测大体、组织学形态、生化指标，筛选最佳诱导方法修复关节软骨缺损模型，分别于12、24周取材，进行组织学观察及评分，验证长期修复效果。结果：与二维培养各组相反，立体培养各组出现明显软骨分化，并以凝胶微球悬浮细胞进行应力刺激培养组效果最佳。术后动物肢体功能优良，12周后软骨缺损被完整修复，表面光滑，质地坚硬，为透明软骨结构，与周围软骨结合紧密；24周后仍然保持透明软骨结构，组织学评分无变化。对照各组软骨缺损均未被修复。结论：立体软骨诱导优于平面诱导，应力环境提高诱导质量，获得的种植细胞可取得稳定的长期修复效果。     

骨髓间质干细胞复合生物陶瓷构建组织工程化人工软骨

目的 探索以多孔β-磷酸三钙(β-TCP)生物陶瓷材料为支架，经体外诱导的骨髓间质干细胞(MSCs)为种子细胞，构建组织工程化软骨修复羊关节软骨缺损的可行性。方法将28只中国美利奴绵羊分为三组。实验组(n＝12)：分离培养羊自体第7代MSCs，经转化生长因子-β诱导后接种到顶制的β-TCP多孔生物陶瓷材料上，细胞—材料复合体经体外孵育后，无菌条件下植入预制的羊单例肋骨近端关节面缺损处；单纯材料组(n＝12)：采用单纯β-TCP材料修复羊关节软骨缺损；空白对照组(n＝4)：制备的羊关节软骨缺损区未做任何修复。术后12周和24周分别取材，进行组织学、组织化学和免疫组织化学分折。结果 实验组术后12周羊关节软骨缺损处肉眼可见透明软骨祥组织形成，组织学检查发现，材料降解明显，未降解吸收的材料孔洞内广泛分布着新生软骨组织，软骨细胞外基质丰富，Ⅱ型胶原染色阳性；术后24周，支架材料几乎完全降解，缺损区被新生软骨组织所取代。单纯材料组术后12周，缺损区边缘有新生软骨组织向支架材料内长入，支架材料吸收明显；术后24周，见从缺损区边缘长入到支架材料内的新生软骨组织逐渐增多，但材料的中心部位未发现新生软骨形成。空白对照组至术后24周，仅见少量软骨组织从缺损区边缘向缺损区内长入，缺损中央大部分区域仍未得到修复。结论 以β-TCP多孔生物陶瓷作为支架材料，以自体MSCs作为种子细胞构建组织工程化软骨修复关节软骨缺损是可行的。     

不同应力环境对兔骨髓间充质干细胞修复关节软骨缺损的影响

目的探讨不同应力环境对骨髓间充质干细胞(MSCs)修复关节软骨缺损的影响. 方法将日本大耳白兔15只制成髌骨外侧脱位动物模型,平均分成3组,每组5只:即单纯载体脱位组(对照组)、移植物正常应力组及移植物脱位组.对兔MSCs进行分离、培养,以兔MSCs为种子细胞构建自体组织工程移植物修复关节软骨缺损.6周后处死动物,观察修复组织的成分和结构. 结果术后6周,移植物正常应力组修复组织浅层为软骨组织,甲苯胺蓝染色接近正常关节软骨;深层为软骨下骨,与正常关节软骨结构相似.移植物脱位组为骨组织所修复,缺损周围的正常关节软骨变薄,软骨下血管侵入正常关节软骨内,遗留在股骨髁滑车槽内的移植物在滑车槽正常关节软骨表面形成新生类透明软骨组织.单纯载体脱位组为纤维组织修复. 结论 MSCs修复关节软骨缺损,只有在正常应力状态下修复效果最佳;提示维持负重关节正常的应力刺激,对组织工程软骨修复组织的形成和维持必不可少.     

骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白封闭剂体内构建可注射性组织工程软骨

目的 探讨利用人骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）与可注射性纤维蛋白封闭剂（fibrinsealant，FS）复合，在裸鼠体内构建组织工程软骨的可行性。方法 体外分离扩增健康人MSCs，以含有转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF—β1）、地塞米松、维生素C的培养基进行成软骨诱导，诱导第7、14天分别检测软骨细胞特异的生物学特性。将诱导7d的MSCs与FS复合，接种于裸鼠背部皮下作为实验组，同时设单纯只注射FS或MSCs的支架对照组和细胞对照组。分别于接种后6、12周取材进行大体观察，行HE、阿尔新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色评价其成软骨能力。结果 MSCs以特定的培养基诱导后由纺锤形变为多角形，并表达软骨细胞分泌的基质。复合物接种6和12周后，实验组均可形成软骨样组织块，6周时形成的组织块较小而质地柔韧，陷窝清楚，可检测到阳性阿尔新蓝及Ⅱ型胶原表达；12周形成的组织块较大，质地较硬，表面光滑，软骨细胞位于成熟的陷窝中，阿尔新蓝及Ⅱ型胶原免疫组化阳性染色较6周增强。两个对照组均无软骨样组织块形成。结论 MSCs复合FS可以作为一种较优良的可注射性组织工程软骨的构建方法。     

骨髓基质细胞源性软骨细胞修复兔全层关节软骨缺损

目的观察体外诱导骨髓基质细胞(MSCs)源性软骨细胞在兔股骨滑车关节面全层软骨缺损修复中的作用. 方法高密度传代培养第3代诱导MSCs分化为软骨细胞,以酸溶性Ⅰ型胶原为载体,两者混合后形成凝胶样植入物(细胞浓度为5×106/ml).于36只新西兰大耳白兔一侧股骨滑车关节面造成3 mm×5 mm全层关节软骨缺损,凝胶样植入为实验侧;另一侧分别为单纯胶原植入组(18个膝关节)和空白对照组(18个膝关节).术后4、8、12、24、32和48周取材观察缺损修复情况及新生组织的类型.参照Pineda标准对新生组织评分. 结果实验侧术后4周,植入细胞类似软骨细胞,周围有异染基质,形成透明软骨样组织;8周,深层有软骨下骨形成,软骨细胞层较正常关节软骨厚;12周,新生软骨厚度减小,与正常软骨相近,细胞呈柱状排列,结构与正常关节软骨相似,软骨下骨形成,潮线恢复;24周,新生软骨厚度较正常薄,约占55%,表面平整,潮线附近仍有肥大的软骨细胞;32周,潮线附近无肥大软骨细胞;48周,组织结构与32周时基本相同,为类透明软骨.Pineda评分24、32和48周间无差异,与4周比较有统计学意义(P＜0.05).实验组2～48周期间关节功能良好.单纯胶原组与空白对照组缺损无修复,48周时软骨下骨外露,关节退变;关节功能逐渐减退,动度受限. 结论 MSCs源性软骨细胞移植体内可形成透明样软骨组织,24周后新生软骨特性稳定,48周时为透明样软骨,能维持良好的关节功能.     

猕猴组织工程骨异体植入后白细胞介素2及其受体的表达

目的　检测猕猴组织工程骨异体植入桥接节段骨缺损后体内白细胞介素 2 (interleukin 2 ,IL - 2 )及白细胞介素 2受体 (interleukin 2 receptor,IL - 2 R)的表达 ,从免疫学方面探讨同种异体细胞作为种子细胞构建组织工程骨的可行性。　方法　用猕猴骨髓基质干细胞 (marrow stromal stem cells,MSCs)体外诱导分化为成骨细胞 ,与人源生物衍生骨材料复合培养 ,构建组织工程骨 ,植入 15只免疫功能健全的异体猕猴体内桥接桡骨节段骨缺损作为实验组 ;用单纯生物衍生骨材料桥接对侧同样大小骨缺损作为对照组 ;分别于术后 1、2、3、6和 12周抽取静脉血 ,并行双侧局部组织取材 ,组织块作低温匀浆 ,用双抗体夹心 IL ISA法检测 IL - 2及 IL - 2 R的表达。　结果　实验组和对照组术后各时间点IL - 2及 IL - 2 R水平无统计学差异 (P>0 .0 5 ) ,IL - 2及 IL - 2 R水平在术后第 2周开始增高 ,第 2～ 6周维持高水平 ,6周后随时间的延长而下降。　结论　猕猴 MSCs和生物衍生骨材料复合构建组织工程骨 ,植入异体猕猴体内引发微弱的免疫反应 ,同种异体 MSCs可选择作为构建骨组织工程的种子细胞。     

小鼠骨髓基质干细胞与人耳脱细胞软骨复合培养的研究

目的探讨以小鼠骨髓基质干细胞(MSCs)作为组织工程软骨的种子细胞,在人耳脱细胞软骨支架上生长的可行性.方法将人耳软骨经脱细胞处理,得到脱细胞软骨支架.抽取鼠的骨髓,经离心得到单个核细胞,进行体外分离培养得到MSCs.将鼠的第2代MSCs种植于脱细胞软骨支架上,体外立体培养10天,在光镜及电镜下观察细胞生长及胶原纤维排列情况.结果 MSCs在人耳脱细胞软骨支架上能立体培养成活,细胞分布不均,靠近培养液的一面细胞分布较多,其中大部分细胞进入已脱细胞的软骨陷窝内,每个陷窝内的细胞数为1～2个.结论以鼠MSCs为种子细胞,可在人耳脱细胞软骨支架上良好生长,构建组织工程软骨.     

骨髓间质干细胞复合多孔磷酸钙陶瓷修复兔颅骨缺损的研究

目的探讨以骨髓间质干细胞(MSCs)作为种子细胞、β-磷酸三钙(β-TCP)多孔生物陶瓷作为支架材料构建组织工程化人工骨，修复兔实验性颅骨标准缺损的可行性。方法选择5月龄新西兰大白兔34只，制作颅骨标准缺损后分成3组。A组(n=20)：分离培养兔同胎异体MSCs。体外扩增后接种到预制的β-TCP多孔生物陶瓷材料上，细胞-材料复合体经体外孵育后，无菌条件下植入颅骨缺损；B组(n=10)：采用单纯β-TCP材料修复兔颅骨缺损；C组(n=4)：兔实验性颅骨标准缺损区未做骨修复。术后6周和12周分别处死动物、取材，进行缺损区大体、组织学、组织化学和免疫组织化学分析。结果颅骨缺损处A组术后6周表面肉眼可见骨样组织形成，组织学提示材料部分降解，未降解吸收的材料孔洞内广泛分布着新生骨组织，成骨细胞外基质丰富，I型胶原染色阳性；术后12周，支架材料几乎完全降解，缺损区被新生骨组织所取代。B组术后6周，可见从缺损区边缘有新生骨组织向支架材料内长入，支架材料部分吸收；术后12周，可见从缺损区边缘长入到支架材料内的新生骨组织逐渐增多，但材料的中心部位未发现新生骨形成。C组术后12周，仅见少量骨组织从缺损区边缘向缺损区内长入，缺损中央大部分区域未得到修复。结论体外培养扩增的兔MSCs在不添加外源性生长因子的情况下，与pTCP复合植入后可以在体内诱导、分化为成骨细胞，并能够对标准的颅骨缺损进行有效的修复，可进一步推广应用。     

人骨髓间质干细胞库的初步建立

目的 探讨建立生物学性状稳定的人骨髓间质干细胞(human marrow mesenchymal stem cells，hMSCs)库的可行性，为组织工程种子细胞的来源作初步探索。方法对分离得到的hMSCs采用液氮低温冻存，并在一定时间复苏培养，以流式细胞仪检测其表面抗原，在诱导培养基中对其行成骨和成软骨诱导培养，光镜：电镜观察细胞的形态，采用组织化学、免疫组织化学及分子生物学的方法检测成骨和成软骨诱导的特异标志物：碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原及骨钙素，研究其生物学性状。结果从骨髓中分离得到了纯度达96％以上的hMSCs，复苏后的hMSCs形态和表面抗原保持不变，可继续扩增10代以上，倍增时间40h。复苏后第2、6、10代hMSCs均保持较强的向软骨细胞、成骨细胞的分化能力。结论初步建立了hMSCs库，可为骨及软骨组织工程提供较好的种子细胞。     

同种骨基质明胶加石膏修复骨缺损的实验研究

目的研究骨基质明胶加石膏复合物在骨缺损修复过程中的作用。方法新西兰兔１６只,桡骨干缺损为植骨区,实验组植入骨基质明胶加石膏复合物（１６侧）,对照组分别植入骨基质明胶（８侧）和酒精储存骨（８侧）,观察骨缺损的修复情况。结果实验组成骨活跃,１２周时骨缺损已基本修复。对照组也有成骨现象,但进展不如实验组。结论骨基质明胶加石膏复合物为一种良好的骨移植材料。