TGF-β1诱导人Tenon囊成纤维细胞增殖及其机制

目的:观察TGF-β1是否促进人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)增殖并且探讨其作用机制?方法:用TGF-β1(0?0.5?1.0?2.0?5.0?10.0 ng/ml)作用于体外培养的3~6代HTFs 24 h,CCK-8 法?EdU染色法检测其增殖;采用Western blot法检测HTFs中RhoE的表达及其下游细胞增殖相关蛋白cyclinD1和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,用慢病毒建立RhoE敲降细胞系?结果:TGF-β1可以剂量依赖性促进HTFs增殖,以5 ng/ml TGF-β1处理后有统计学差异,EdU掺入法检测发现,5 ng/ml TGF-β1组EdU标记率明显高于对照组?5 ng/ml TGF-β1组 HTFs中RhoE蛋白的表达平均灰度值明显低于对照组,细胞增殖相关蛋白cyclinD1?PCNA的表达平均灰度值高于对照组?细胞中RhoE沉默后,CCK-8法检测细胞活力较对照组上升,流式细胞术发现S期也升高,cyclinD1?PCNA灰度值也上升?结论:TGF-β1可以通过降低RhoE引起下游周期蛋白cyclinD1的表达升高,诱导人Tenon囊成纤维细胞增殖?     

TGF-β1对鼠肌成纤维细胞增殖和分泌1型胶原的影响

目的:检测不同浓度TGF-β1对鼠肌成纤维细胞增殖和分泌细胞外基质1型胶原的影响,探讨TGF-β1对肌成纤维细胞作用的机制。方法:鼠肌成纤维细胞株C2C12细胞培养,用不同浓度(0、1、5、10ng/mL)TGF-β1干预24 h,用MTT法和3H-Thymidine法检测细胞增殖,用ELISA检测Ⅰ型胶原的分泌,用RTPCR检测其基因表达;统计分析采用F方差分析。结果:0、1、5、10(ng/mL)TGF-β1干预细胞24 h,促进细胞增殖和Ⅰ型胶原分泌。其MTT(OD值)分别是0.096±0.015,0.177±0.014,0.240±0.028,0.312±0.012,[3H](cpm/min)值分别是630±17,907±19,1493±25,1808±24;Ⅰ型胶原ELISA法(CICP,ng/mL)检测结果分别为616±16,713±19,783±23,853±17,RT-PCR法(Ⅰ型胶原/β-actin光密度比值)分别为0.93±0.08,1.83±0.17,2.50±0.29,2.94±0.14。各组比较有统计学差异。结论:TGF-β1促进鼠肌成纤维细胞增殖和分泌细胞外基质、并呈剂量依赖性。     

Smad3基因siRNA对TGF-β1双向调节成纤维细胞增殖的影响

目的 构建大鼠Smad3基因特异性siRNA沉默质粒,并探讨其在TGF-β1双向调节成纤维细胞增殖中的作用.方法 构建大鼠Smad3基因沉默质粒,荧光纤维镜观察转染效率,定量PCR、免疫组化法检测Smad3基因和蛋白的变化,BrdU ELISA法和EMSA法分别检测转染siRNA及联合大小剂量TGF-β1刺激后细胞增殖和Smad3结合活性变化.结果 沉默质粒转染效率为41.2%,瞬时转染后具有促增殖作用且与转染剂量成正比,并使其mRNA表达下调50%、蛋白表达明显降低,还可降低大小剂量TGF-β1双向调节细胞增殖和Smad3结合活性的变化程度.结论 pSUPERSmad3沉默质粒构建成功,TGF-β1可通过调节Smad3来达到双向调节成纤维细胞增殖作用.     

紫杉醇对TGF-β1促人Tenon's囊成纤维细胞增殖的影响

目的:研究转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)促人Tenon's囊成纤维细胞(human Tenon's capsulefibroblasts,HTFs)的增殖作用及紫杉醇对该增殖作用的影响.方法:用TGF-β1(0～50 ng/ml)作用于体外培养的HTFs,...     

SIRT6通过TGF-β1/Smad信号通路调控瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、侵袭和胶原合成

目的 探讨沉默信息调节因子6(silent information regulator 6, SIRT6)对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、侵袭和胶原合成的调控作用和分子机制。方法 收集瘢痕疙瘩和正常皮肤样本,采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测SIRT6 mRNA表达水平,采用Western blot检测SIRT6蛋白表达水平。采取组织块贴壁法从瘢痕疙瘩组织中分离养成纤维细胞。构建SIRT6重组腺病毒(adenovirus, Ad),感染瘢痕疙瘩成纤维细胞实现SIRT6过表达。将瘢痕疙瘩成纤维细胞分为空白对照组、Ad-NC组和Ad-SIRT6组。采用RT-qPCR检测SIRT6 mRNA表达水平。采用Western blot检测SIRT6、Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,ColⅠ)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和SMAD家族成员2/3(SMAD family member 2/3,Smad2/3)蛋白的表达水平。采用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(5-ethynyl...     

转化生长因子-β1对人眼眶成纤维细胞增殖的影响

目的：观察转化生长因子β1(TGF—β1)对人眼眶成纤维细胞(orbital fibroblasts．OFs)增殖的影响．探讨增殖性玻璃体视网膜病变(proljferative vitreoretinopathy．PVR)的发病机制。方法：OFs体外培养，用不同浓度TGF—β1(0.1、1.0、5．0、10．0、100．0μg／L)对细胞进行处理。计算细胞的数量，绘制细胞生长曲线；椎虫蓝染色计算活细胞比例、MTT比色法测定吸光度(A)值：流式细胞仪(FCM)检测细胞周期分布。结果：0．1、1．0、5、0、10、0μLg／L的TGF-β1作用后OFs生长曲线上移，活细胞数增加，A值上升，处于增殖期(S G2)的细胞比例增多。100.0μg／L的TGF-β1对OFs作用相反。结论：TGF-β1对人眼眶成纤维细胞增殖有双相调节性．其不同作用的发挥依赖TGF—β1的浓度，TGF—β1的促成纤维细胞的增殖作用可能诱发PVR。     

TGF-β1对IL-1β诱导人牙周膜成纤维细胞分泌HGF影响的研究

目的研究转化生长因子-β1（TGF-β1）、白细胞介素-1β（IL-1β）干预人牙周膜成纤维细胞后HGF的基因表达的水平变化,为HGF网络调控人牙周膜成纤维细胞功能的研究提供新资料。方法分别采用IL-1β梯度浓度、IL-1β最佳干预浓度和TGF-β1梯度浓度干预第5代人牙周膜成纤维细胞,并运用RT-PCR法检测人牙周膜成纤维细胞中HGF的基因表达。结果经IL-1β单独作用,人牙周膜成纤维细胞中HGF的基因表达水平上调,并优选出IL-1β的最佳干预浓度为10ng/ml（P〈0.05）;当一定浓度的TGF-β1和10ng/ml的IL-1β共同作用于人牙周膜成纤维细胞后,该细胞中HGF的基因表达水平比单独IL-1β作用组低（P〈0.05）。结论 TGF-β1能够抑制IL-1β所诱导的人牙周膜成纤维细胞中HGF的基因表达。     

转化生长因子-β1对大鼠肌成纤维细胞增殖及胞内Smad蛋白磷酸化的影响

目的 探讨转化生长因子-β1（TGF-β1）对大鼠肌成纤维细胞（MFB）增殖及胞内Smad蛋白磷酸化的影响。方法 TGF-β1（0．33～81pmol／L）在不同作用时间（5～120min）的条件下诱导MFB细胞活化,采用免疫吸附和Westernblot方法观察TGF-β1对MFB细胞内pSmad2C、pSmad2L、pSmad3L及Smad2／3蛋白表达的影响;采用M1Tr方法观察TGF-β1对MFB细胞增殖的影响。结果 在0．33—9pmol／L浓度范围内,TGF-β1均呈浓度依赖性刺激MFB细胞内Smad2C、Smad2L、Smad3L磷酸化,以9pmol／L最明显,TGF-β1在27、81pmol／L浓度时,Smad2C、Smad2L、Smad3L磷酸化仍处于高水平状态,而各组Smad2／3蛋白表达无明显变化。在TGF-β1为9pmol／L浓度条件下,30—60min孵育时间对MFB细胞增殖无明显影响,但可呈时间依赖性刺激MFB细胞内Smad2C、Smad2L、Smad3L磷酸化,以30min最明显,TGF-β1在60、120min时间时,Smad2C、Smad2L、Smad3L磷酸化仍处于高水平状态,而各组Smad2／3蛋白表达量无明显变化。结论 TGF-β1诱导MFB细胞内Smads磷酸化先于刺激细胞增殖。     

恒稳磁场对离体增生性瘢痕成纤维细胞TGF-β1表达的影响

目的 观察不同强度的恒稳磁场对增生性瘢痕离体的成纤维细胞在TGF-β1表达强度的影响;探讨恒稳磁场的抗增生性瘢痕作用机理. 方法 取体外分离培养的皮肤增生性瘢痕成纤维细胞,离体培养后,分为4个实验组即0 T磁场组、0.1 T磁场组、0.2 T磁场组、0.3 T磁场组,各组先在无处理因素下培养12 h,再分别加上强度为0 T 、0.1T、0.2T、0.3T的恒稳磁场,0 T磁场组不加磁场,在4个时间点上采用Western blot检测各组TGF-β1表达对数总灰度值. 结果 处理组表达强度较对照组明显减弱(P<0.05);在处理组之间,随着磁场强度的增强,TGF-β1(转化生长因子β1)表达强度逐渐减弱. 结论 恒稳磁场可抑制增生期瘢痕成纤维细胞TGF-β1的表达强度.     

肝X受体激动剂T0901317对TGF-β1诱导人正常肺成纤维细胞纤维连接蛋白表达的影响

目的 探讨肝X受体激动剂T0901317对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人正常肺成纤维细胞纤维连接蛋白(fibronectin,FN)表达的影响.方法 组织块贴壁法培养人正常肺成纤维细胞,波形蛋白和角蛋白免疫组织化学鉴定.T0901317及 TGF-β1刺激人正常肺成纤维细胞后,分别应用Western blot 和激光共聚焦显微镜观察FN的表达.结果 成纤维细胞表达波形蛋白,不表达角蛋白.Western blot和免疫荧光结果均显示正常肺成纤维细胞基态下表达较多的FN,TGF-β1可以诱导FN表达的进一步上调,而T0901317在5 μg/mL时即可抑制这种表达的上调.结论 肝X受体激动剂T0901317可以抑制TGF-β1诱导的体外人正常肺成纤维细胞FN表达的上调,可能具有潜在抗纤维化治疗作用.     

TGF-β1联合IGF-1诱导hAMSC向韧带成纤维细胞分化的效应研究

目的 探讨TGF-β1联合IGF-1诱导人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cell,hAMSC)向韧带成纤维细胞分化的效应和相关分子表达水平。方法 分离培养第3代hAMSC,过表达TGF-β1(Ad-TGF-β1)和IGF-1(Ad-IGF-1)腺病毒转染细胞后,将细胞分为空白对照组、IGF-1组、TGF-β1组和TGF-β1+IGF-1组,使用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测韧带成纤维细胞相关基因表达情况,使用细胞免疫荧光观察TGF-β1联合IGF-1对hAMSC向韧带成纤维细胞分化的特异性标志因子包括Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ),Ⅲ型胶原(COL-Ⅲ),腱调蛋白(tenofovir,TNMD)及纤维连接蛋白(fibronectin,FN)在基因和蛋白表达水平改变。结果 培养至第3代,hAMSC贴壁生长,呈长梭状、漩涡形态;TGF-β1和IGF-1过表达腺病毒转染第3代hAMSC 24h后;PCR结果显示,使用TGF-β1+Ad-IGF-1诱导第3代hAMSC后第7天时,韧带成纤维细胞相关基因包括COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、FN、TNMD的mRNA表达水平显著高于其他各组(P<0.05);细胞免疫荧光染色结果显示Ad-TGF-β1转染细胞联合IGF-1诱导第3代hAMSC后,第7天与第3天比较,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达水平显著高于其他各组。结论 体外通过使用腺病毒,高表达TGF-β1与IGF-1,可显著增强诱导hAMSC向韧带成纤维细胞分化,并且韧带成纤维细胞相关基因和蛋白水平表达明显增强。     

特异性stealth siRNA抑制小鼠肺成纤维细胞TGF-β1表达的实验研究

目的设计特异性stealth siRNA并检测其对TGF-β1的抑制作用。方法针对BALB/c小鼠TGF-β1基因组,选择不同位点设计3套siRNA基因序列,并经化学修饰合成3种stealth siRNA,转染体外培养的小鼠肺成纤维细胞,免疫组化法检测其对TGF-β1表达的影响。结果3种stealth siRNA对TGF-β1表达在不同时间有不同程度的抑制作用,以stealth_166效果更为明显;抑制效果与转染时间长短相关,48h后就可检测出明显抑制,72h达到最高峰,96h后开始减弱。结论合成的特异性stealth siRNA可以抑制TGF-β1在小鼠肺成纤维细胞的表达,有望成为防治肺间质纤维化的一种手段。     

黄芪对人肾间质成纤维细胞增殖和转化生长因子-β1表达的影响

目的：探讨黄芪对肾间质纤维化改善的作用机制。方法：体外培养人肾间质成纤维细胞（KFB），传至3代后分为3组：对照组（常规培养），血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）培养组（在培养液中分别加入10^-8mol／L、10^-7mol／L和10^-6mol／L的AngⅡ），黄芪注射液干预组（分别于培养液中加入10^-6mol／L的AngⅡ和10mg／L、20mg／L和40mg／L黄芪注射液）。作用48h后，各组用MTT比色法测定细胞增殖情况，用ELISA法测定细胞培养上清液中TGF-β1的水平。结果：AngⅡ可促进KFB增殖，刺激TGF-β1的分泌，且呈剂量依赖性（r分别为0.612和0.723，P〈0.05）；黄芪注射液可抑制AngⅡ的上述作用，且呈剂量依赖性（r分别为-0．561和-0．689，P〈0．05）。结论：黄芪可以通过抑制成纤维细胞增殖和TGF-β1的分泌，延缓肾间质纤维化进展。     

TGF-β1通过上调Shh 信号诱导大鼠脑膜成纤维细胞向肌成纤维细胞转化

目的 探讨TGF-β1在诱导脑膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞中对Shh信号的影响。方法 新生24 h SD大鼠脑膜原代成纤维细胞经Ⅳ型胶原酶提取纯化。原代脑膜成纤维细胞随机分为3个组：分别为空白对照组、10 ng/mL TGF-β1处理组（TGF-β1组）、10 ng/mL TGF-β1联合20 μmol/L TGF-β1受体抑制剂SB-431542组(TGF-β1+SB组)。各组细胞在药物处理前均用无血清培养基培养24 h后换用加入了药物的DMEM/F12完全培养基处理72 h。采用CCK-8法检测各实验组成纤维细胞的增殖能力;细胞划痕实验检测各实验组成纤维细胞的迁移能力;免疫荧光法检测各实验组纤维连接蛋白（Fn）的表达;Western blotting检测各实验组Fn、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Shh蛋白的表达;q-PCR检测各实验组细胞Shh mRNA的表达。结果 TGF-β1可促进原代脑膜成纤维细胞的增殖（P<0.05）;TGF-β1可促进原代脑膜成纤维细胞的迁移（P<0.05）。TGF-β1可促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化并增加Fn的分泌（P<0.05）。TGF-β1处理后可上调Shh蛋白和mRNA的表达（P<0.05）,TGF-β1受体抑制剂SB-431542则可抑制TGF-β1引起的原代脑膜成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化并减少纤维连接蛋白的分泌（P<0.05）。结论 TGF-β1可通过上调Sonic Hedgehog信号通路中Shh蛋白的表达,诱导脑膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞。     

Smad3在TGF-β1诱导肌成纤维细胞增殖中的作用

目的 探讨TGF-β1及其信号转导分子Smad3在肌成纤维细胞(C2C12)增殖中的作用.方法 TGF-β1作用C2C12细胞,对Smad3基因进行RNA干扰,用[3H]测定法检测TGF-β1诱导的C2C12细胞增殖.结果 0、1、5和10 ng/mL TGF-β1作用C2C12细胞后,其[3H]值(cpm/min)分别是(630±17),(907±19),(1 493±25),(1 808±24),F=3080.499,P=0.000.经200 pmol/L siKNA-Smad3转染24 h,再用5 ng/mL TGF-β1作用24h,测定细胞增殖,其[PH]值(cpm/min)分别是(464±30)(空白对照组),(1062±50)(内对照组),(428±38)(实验组),F=412.186,P=0.000.结论 TGF-β1通过Smad3信号转导促进C2C12细胞增殖并呈剂量依赖性,siRNA-Smad3可以有效地阻断其信号转导而降低C2C12细胞增殖.     

抗转化生长因子β_1(anti-TGF-β_1)对瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

目的　探讨抗转化生长因子β1(anti-TGF - β1)对瘢痕成纤维细胞增殖及胶原合成的影响及意义。方法　用电镜观察anti-TGF - β1作用后瘢痕成纤维细胞的形态学变化 ,以及用MTT法和3 H -脯氨酸掺入等方法检测anti-TGF - β1对体外培养的瘢痕成纤维细胞的增殖及胶原蛋白合成的影响。结果　anti -TGF - β1能明显影响成纤维细胞的超微结构 (细胞核、线粒体、粗面内质网等 )。anti -TGF - β1能抑制成纤维细胞的增殖和胶原蛋白的合成 (P <0 .0 1) ,在一定范围内 (10 μg/ml)呈剂量 -效应关系。抑制作用在 10 μg/ml时最大 ,抑制率达 72 %。结论　anti-TGF - β1能中和TGF - β1,促进成纤维细胞增殖和胶原合成的作用 ;提示anti-TGF - β1的应用可能为临床瘢痕的治疗提供新的途径。     

血管紧张素-（1-7）对TGF-β1诱导大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

目的：观察血管紧张素-（1-7）对TGF-β1诱导幼年大鼠心肌成纤维细胞增殖（CF）和胶原合成的影响,并探讨其是否通过cAMP/PKA通路进行介导抗纤维化作用。方法：①细胞分离培养与鉴定：用酶消化法分离细胞,差速贴壁法纯化获得心室肌成纤维细胞为材料,用光学显微镜和免疫细胞化学的方法鉴定细胞。②检测方法：WST-1比色法测定细胞增殖情况,放射免疫法测定Ⅲ型胶原前胶原末端肽（PCⅢ）的含量。结果：①与空白组比较,Ang-（1-7）组呈浓度依耐性抑制基础状态下CF和PCⅢ分泌（P〈0.05）;②在TGF-β1诱导状态下,与TGF-β1组比较,Ang-（1-7）＋TGF-β1组呈浓度依耐性抑制FBC增殖和PCⅢ分泌（P〈0.05）;③与Ang-（1-7）比较,Ang-（1-7）＋H-89组基础状态下抑制CF增殖和PCⅢ分泌能力减弱（P〈0.05）;④在TGF-β1诱导状态下,H-89（PKA抑制剂）能阻断Ang-（1-7）对CF的增殖和胶原合成的抑制作用。结论：1.Ang-（1-7）对基础状态下或TGF-β1诱导下CF增殖和胶原合成均具有明显抑制作用,且呈浓度依赖性。②Ang-（1-7）是通过PKA介导抑制TGF-β1诱导CF增殖及胶原合成。     

TGF-β1对口腔鳞癌相关成纤维细胞FAP表达的影响

目的 探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)对癌相关成纤维细胞(CAFs)中成纤维细胞活化蛋白(FAP)表达的影响.方法 应用10 ng/ml的TGF-β1作用于CAFs细胞,设置正常成纤维细胞(NFs)和未经处理的CAFs细胞作为对照组,采用RT-PCR和Western blot法检测细胞中FAP的蛋白和mRNA表达情况.结果 FAP在NFs中几乎不表达,而在CAFs中FAP的mRNA和蛋白表达均增加.与NFs组和CAFs组相比,10 ng/ml的TGF-β1能够明显促进CAFs细胞分泌FAP,作用12、24 h后FAP mRNA和蛋白的相对表达量差异有统计学意义(P＜0.05).且随着作用时间的延长,FAP的表达持续升高,24 h较12 h表达增加,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TGF-β1能够促进CAFs中FAP的表达,在肿瘤上皮-间质交互作用中扮演着重要角色.     

二苯乙烯苷对TGF-β1诱导新生大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响及其机制

探讨二苯乙烯苷(2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡糖苷,TSG)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的新生大鼠心肌成纤维细胞(CFB)增殖和胶原合成的影响,并研究其相关机制。用消化法培养新生SD大鼠CFB,建立TGF-β1诱导新生大鼠CFB纤维化模型。采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入法检测CFB增殖情况;乳酸脱氢酶(LDH)法检测药物对细胞毒性作用;羟脯氨酸测定检测CFB胶原含量;流式细胞仪测定细胞周期;Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、增殖细胞核抗原(PCNA)、Ⅰ型胶原(COLⅠ)、Ⅲ型胶原(COL Ⅲ)、p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3、p-ERK、ERK、p-P38、P38、p-JNK、JNK的蛋白表达。结果表明,终浓度为0.1~100 μmol/L的TSG无明显细胞毒性作用;在一定浓度范围内,TSG可明显抑制TGF-β1诱导的CFB增殖和胶原合成,抑制细胞由G₀/G₁期向S期的转变,抑制TGF-β1诱导的CFB核内PCNA的蛋白表达,降低α-SMA、COLⅠ和COL Ⅲ的过度表达,并抑制TGF-β1诱导的Smad3、ERK和P38的磷酸化。因此推测一定浓度的TSG能抑制TGF-β1诱导的CFB增殖和胶原合成,其机制可能与干预Smad3、ERK和P38信号通路有关。     

丹参对人粘连组织成纤维细胞MMP-1与TIMP-1mRNA表达的影响

目的 考察丹参及其化学成分对人粘连组织成纤维细胞（ATF）MMP-1与TIMP-1 mRNA表达的影响。方法 使用组织块培养的方法获取ATF,分别加入丹参提取物、丹参素钠、丹参酮IIA磺酸钠与地塞米松培养48 h,提取总RNA并逆转录为cDNA,采用Real-time PCR法检测各组MMP-1与TIMP-1 mRNA的表达水平。结果 与空白对照组比较,丹参提取物与丹参素钠10、40 μg？mL-1剂量组MMP-1 mRNA水平差异有统计学意义（p〈0.01）,丹参素钠40 μg？mL-1剂量组TIMP-1 mRNA水平差异有统计学意义（p〈0.01）,其余各组差异均无统计学意义（p〉0.05）。结论 上调MMP-1 mRNA水平是丹参抑制ATF胶原过度合成,防止粘连产生的作用机制之一,丹参素在其中起主要作用。