对叔丁基杯[4]芳烃酸偶合低相对分子质量聚乙烯亚胺作为非病毒转基因载体的体外研究

目的合成对叔丁基杯[4]芳烃酸偶合低相对分子质量聚乙烯亚胺聚合物作为非病毒转基因载体,并评价其毒性、压缩DNA的能力,携带报告基因转染细胞的能力。方法采用新方法合成对叔丁基杯[4]芳烃酸偶合聚乙烯亚胺聚合物,通过核磁共振方法表征。将合成的新聚合物与DNA混合,得到新聚合物/DNA复合物,用琼脂糖电泳试验测定不同N/P比值形成复合物时对质粒DNA电泳的阻滞情况,评价其压缩DNA能力。透射电镜法检测复合物的大小,MTT法检测其对细胞的毒性作用,使用新聚合物携带报告基因转染细胞,并与PEI25000比较转染率。结果新聚合物压缩质粒DNA的能力随N/P比值增大而增强,在N/P比为6时可以完全阻滞质粒DNA的电泳,在N/P比为60时,复合物粒径约291 nm,复合物的表面电荷约14.6 m V。细胞毒性试验表明新聚合物与PEI25000相比毒性明显下降,携带报告基因转染MCF-7细胞转染效率与PEI25000相近。结论对叔丁基杯[4]芳烃酸聚乙烯亚胺新聚合物具有较强压缩质粒DNA能力,对细胞毒性低,转染效率高,是一种可应用于基因治疗的新型非病毒载体。     

双嵌段磷酸胆碱基聚合物作为c-myc AS-ODN基因运输载体研究

目的 探讨双嵌段磷酸胆碱基聚合物MPC30-DEA70 作为反义寡核苷酸（AS-ODN）运输载体的安全性和有效性.方法 将载体MPC30-DEA70（N）与c-myc AS-ODN（P）在不同N/P比值的条件下复合,应用DNA凝胶电泳法、荧光显微镜、流式细胞术和四甲基偶氮唑盐（MTT）法对复合物溶液进行检测,观察复合物在HeLa细胞中的转染情况.结果 c-myc AS-ODN能与载体MPC30-DEA70电性中和,N/P比值越大复合物正电性越强;MPC30-DEA70/AS-ODN复合物能够进入细胞,转染效率随着N/P比值增大而增大;同时随着N/P比值增大复合物对细胞的增殖抑制作用显著增强.结论 MPC30-DEA70可以有效负载和运输c-myc AS-ODN,抑制HeLa细胞增殖,是一种新型的、安全有效的非病毒类转基因载体.     

HSV-TK/GCV系统对鼠膀胱癌远距离旁观者效应的实验研究

目的探讨单纯疱疹病毒胸腺激酶(HSV-TK）基因联合羟基无环鸟苷(GCV)对体内膀胱癌的远距离旁观者效应的效果。方法将转染HSV-TK基因的膀胱癌细胞和未转染HSV—TK的膀胱癌细胞分别种植于小鼠双侧背部;给予GCV治疗,观察肿瘤的大小变化,小鼠存活天数改变,及膀胱癌细胞病理学改变。结果在HSV—TK/GCV系统作用下,转染HSV-TK的TK 肿瘤大小明显小于对照组,肿瘤生长受到抑制;但对侧未转染HSV-TK基因的TK-肿瘤产生远距离旁观者效应不明显。结论HSV—TK／GCV系统对体内其他部位未转染HSV-TK基因膀胱癌细胞产生远距离旁观者效应不明显。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶丙氧鸟苷自杀基因系统对宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用的研究

目的：观察单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统对人宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用及其旁观效应。方法：采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317。取病毒上清液感染Hela细胞,得到带有HSV-TK基因的Hela／TK细胞,并将其用于体外实验。结果：载体HSV-TK导入了PA317细胞。体外实验结果显示,当Hela／TK细胞数占混合细胞10％时,低浓度(10mg／L)的GCV就可将50％左右的肿瘤细胞杀死。GCV作用后的实验组Hela／TK细胞基因组经琼脂糖凝胶电泳后可观察到典型的DNA梯状条带。结论：逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌Hela细胞并获稳定表达,HSV-TK／GCV自杀基因系统在体外对宫颈癌细胞有杀伤作用,且存在明显的旁观效应。     

聚乙烯亚胺/DNA复合物处方工艺优化及体外转染效率

目的:考察聚乙烯亚胺(PEI)相对分子质量、氮磷比(N/P比)、溶剂、离子强度等对PEI/DNA复合物形成、表面性质以及细胞转染效率的影响。方法:制备不同相对分子质量PEI/DNA复合物,通过凝胶电泳和紫外吸收检测确定PEI与DNA的复合能力(N/P比),测定不同溶剂、离子强度下的粒径和Zeta电位,考察复合物在HepG2细胞中的转染情况。结果:PEI与DNA的复合能力与PEI的相对分子质量呈正相关,不同溶剂、离子强度会影响复合物的表面性质,以磷酸盐缓冲液(PBS)为溶剂、PEI(25kD)为载体、N/P比为12～15时,PEI/DNA复合物细胞转染效率明显优于质粒DNA,仅略低于阳性对照组。结论:经优化的PEI/DNA复合物可显著提高DNA在细胞中的转染效率。     

HSV-tk/GCV系统对人宫颈癌细胞株ME180旁观者效应的研究

目的：研究以逆转录病毒载体介导的HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞株的旁观者效应。方法：应用脂质体及ploybrene转染技术，将重组逆转录病毒载体PLXSN－HSV－tk，导入PA317包装细胞，以其分泌的逆转录病毒感染宫颈癌ME180细胞（ME），建立ME／TK转化细胞株。观察GCV对ME、ME／TK细胞的存活率及旁观者效应。结果：从病毒滴度、电镜及PCR检查，证实tk基因随病毒的感染已成功地导入PA317及ME180细胞。ME／TK细胞对GCV的敏感性显著高于亲代ME细胞。ME／TK及ME＋ME／TK混合细胞还随GCV浓度的增加受到明显的抑制。ME＋ME／TK混合细胞的存活率，随ME／TK细胞比例的增加而降低，说明TK／GCV系统不但能杀伤tk^ 细胞，也能杀伤未导入tk的细胞，存在明显的旁观者效应。结论：HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞具有明显的杀伤及旁观者效应。     

新型纳米载体SuperfectTM最适转染条件的研究

目的:对新型纳米转染载体SuperfectTM的转染效率和细胞毒性进行初步研究,以探讨其最适的转染条件。方法:以50%融汇率的小鼠黑色素瘤细胞为靶细胞,在不同条件下将,报告基因质粒pEGFP-C1与载体Super-fectTM混合为复合物进行转染。各实验组:不同的质粒剂量(0.25μg,0.50μg)、不同的N/P(N:载体分子表面胺基的数量,P:DNA中磷酸基团的数量)比(2∶1,5∶1,10∶1)及复合物与细胞的孵育时间(3 h,6 h)。各对照组:裸质粒转染组、载体转染组,非转染组为对照。转染72 h后,流式细胞仪检测转染效率,MTT法检测细胞毒性。结果:在不同条件下,SuperfectTM的转染效率有显著性差异(P<0.05),其细胞毒性与载体剂量和孵育时间相关。当质粒剂量为0.5μg,N/P比为5∶1,复合物与细胞孵育3 h时,SuperfectTM不仅具有较高的转染效率,而且表现出较低的细胞毒性。结论:SuperfectTM是一种高效低毒的转染载体,其最适转染条件主要与N/P比及复合物与细胞的孵育时间相关。SuperfectTM在基因治疗领域将具有良好的应用前景。     

氮磷比对PEI介导BMP-7基因转染骨髓间充质干细胞的影响

目的:研究氮磷比(N/P值)对非病毒基因载体聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)介导骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)基因转染骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,MSC)的影响,优化PEI/DNA复合物制备参数,为其应用于骨组织工程提供实验基础.方法:制备不同N/P值的含BMP-7基因的PEI/DNA复合物,测定复合物的粒径、Zeta电位以及PEI保护DNA抵御DNA酶消化的能力,检测复合物对MSC细胞的毒性以及转染表达BMP-7蛋白量.结果:当N/P值在3-30范围时,形成微粒粒径稳定在100 ～ 150 nm;当N/P值在5～ 30范围时,Zeta电位稳定在30 ～ 40 mV.当N/P值＞3时,随着PEI的增加,PEI对DNA的保护功能增强.当N/P值为7～10时,可以获得最高的基因转染效率.当N/P值大于10时,细胞毒性明显增加.结论:N/P值为7～ 10时,含BMP-7基因的PEI/DNA复合物细胞毒性小,转染效率高.     

腺病毒介导的HSV—tk／GCV自杀基因系统靶向性治疗前列腺癌的实验研究

目的：观察腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,丙氧鸟苷（HSV—tk／GCV）自杀基因系统在人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控下对人前列腺癌细胞的靶向性体外杀伤效应。方法：利用不同感染复数（MOI）的重组腺病毒携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因感染前列腺癌细胞LNCaP和人成纤维细胞MRC-5,荧光显微镜下观察其感染效率：利用携带不同启动子的重组腺病毒Ad—hTERT-HSV／TK以及Ad—CMV—HSV／TK感染LNCaP和MRC-5细胞,加入不同浓度GCV,MTY法观察受转染细胞的存活率。结果：重组腺病毒Ad—hTERT—EGFP能特异地转染LNCaP,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高（P〈0．01）,MOI为1时转染率为8．3％,MOI为1000时转染率达100％;应用GCV处理后,Ad—CMV—HSV／TK对LNCaP和MRC-5细胞均有杀伤作用,而Ad—hTERTp—HSV／TK只杀伤LNCaP（P〈0．001）,随着MOI和GCV浓度的增加,LNCaP细胞存活率明显降低（P〈0．01）,MOI为1和GCV浓度为1μmol/L时存活率为95．4％。MOI为100和GCV浓度为1000μmol／L时存活率仅为6．1％,并有旁观者效应。结论：重组腺病毒携带EGFP报告基因可准确、简便地确定转染效率;hTERT启动子调控的重组腺病毒介导的HSV—tk／GCV自杀基因系统对人前列腺癌细胞有靶向杀伤作用。     

可生物降解多肽基因载体的构建与体外评价

目的 制备一种应用于基因递送系统的硫辛酸修饰的聚精氨酸多肽纳米复合物,并考察其对人胚肾细胞系HEK293细胞的转染效率及细胞毒性.方法 以不同量的半胱氨酸作为交联剂,合成4种不同交联度的还原性硫辛酸修饰的交联聚精氨酸组氨酸(LHRss),利用1H NMR和凝胶色谱鉴定合成的LHRss.取质粒DNA (pDNA)和LHRss以不同氮磷比(N/P)自组装形成纳米复合物,用粒度测定仪测定复合物的粒径和zeta电位,凝胶阻滞电泳测定载体LHRss对pDNA的包裹能力.用LHRss/pDNA纳米复合物与HEK293细胞共同培养,考察不同交联度复合物的细胞摄取情况及相关基因转染情况,并测定不同纳米复合物对HEK293细胞的细胞毒性.结果 通过结构鉴定确定LHRss多肽合成成功.组装形成的纳米复合物粒径分布均匀,N/P≥40时LHRss3/pDNA及LHRss4/pDNA复合物的zeta电位均大于30 mV.凝胶阻滞电泳结果显示N/P值为5时,LHRss3可完全包裹pDNA.当N/P值为40时,HEK293细胞对LHRss3/pDNA的摄取及转染效率高于其他3种复合物及单体硫辛酸修饰的聚精氨酸组氨酸(LHR);其中LHRss3/pGL3复合物的平均荧光强度约为LHR/pGL3复合物的3.98倍,差异具有统计学意义(P＜0.05).细胞毒性实验显示LHR/pGL3及不同交联度LHRss/pGL3转染HEK293细胞24 h后,细胞存活率均在80％以上,其毒性作用均低于bPEI-25K(20 μg/mL bPEI-25K转染细胞24 h后细胞存活率为25％左右,P＜0.05).结论 制备的硫辛酸修饰的聚精氨酸多肽纳米复合物有望成为一种高效的基因载体.     

新型纳米非病毒基因输送体系PCL-PEG-chitosan的构建与特性

目的 优化新型纳米非病毒载体聚己内酯（PCL）-聚乙二醇（PEG）-壳聚糖（chitosan）（PCL-PEG-chitosan）在体外与质粒的复合条件,并进行转染活性测定。方法 在体外利用凝胶电泳方法确定非病毒载体与携带绿色荧光蛋白基因的质粒（pEGFP）复合的最小氮磷比。利用动态光散射粒径测量仪确定复合物在不同氮磷比、不同缓冲溶液体系下粒径的变化情况。将pEGFP与PCL-PEG-chitosan进行复合后转染293T细胞,荧光显微镜观察转染效率。结果 凝胶电泳结果显示,非病毒载体PCL-PEG-chitosan与pEGFP复合的最小氮磷比为4∶1,PCL-chitosan与pEGFP复合的最小氮磷比也为4∶1,chitosan与pEGFP复合的最小氮磷比为1∶1。动态光散射实验结果显示：非病毒载体PCL-PEG-chitosan与pEGFP复合而成的复合物的粒径随着氮磷比的增大而减小;在醋酸盐缓冲体系与DMEM缓冲体系中,复合物的粒径基本一致,相对稳定。荧光显微镜观察发现,经过接枝改性的纳米载体PCL-PEG-chitosan的转染效率有所提高。结论 PCL修饰可减弱chitosan对pEGFP的复合能力,提高最低复合氮磷比。经PCL和PEG修饰的纳米载体PCL-PEG-chitosan的细胞转染活性有所提高,但尚需进一步改进。     

原代树突细胞基因递送系统的构建与应用

目前，安全有效的基因递送系统应用于原代树突细胞（dendritic cell，DC）转染尚未见报道，本研究针对原代DC构建基于脂质体的基因递送系统，优化了制备方法以提高原代DC的转染效率。通过共孵育法、乙醇注入法、鱼精蛋白复合法分别制备含不同阳离子脂质的脂质体/siRNA复合物，并以粒径、电位、对基因药物siRNA的包载能力、安全性、稳定性、DC的摄取效率和基因沉默效率为考察指标，评价并筛选出具有高转染效率的基因递送系统。与市售制剂Lipo2000相比，利用共孵育法制备的赖氨酸谷氨酸双油醇酯（OA2）递送系统的DC摄取效率提高约35%，基因沉默效率提高约10倍，且细胞存活率比Lipo2000提高20%，具有良好的DC基因转染效率和体外安全性。本研究为原代DC提供了一种安全有效、制备简单的基因递送载体平台，具有良好的应用前景。     

基因载体葡聚糖-精胺/DNA复合物的制备及物理性能的研究

目的:研究非病毒基因载体葡聚糖-精胺阳离子聚合物(DSP)的合成及其与DNA所形成复合物的物理性能.方法:葡聚糖氧化后,通过还原胺法与精胺反应制得DSP,与质粒pEGFP在室温孵育后形成复合物;激光粒度仪测定复合物粒径和Zeta电位;透射电镜观察复合物形态;琼脂糖凝胶电泳观察DSP对DNA的阻滞能力.结果:DSP与DNA在质量比大于4:1时,能形成稳定的复合物;复合物平均粒径为173.6nm,平均电位为23.2 mV;所形成的复合物呈圆球状;DSP能阻滞DNA不受电场的影响而迁移.结论:葡聚糖-精胺阳离子聚合物是一种制备工艺简单、有应用前景的非病毒基因载体.     

腺病毒介导的HSV-TK/GCV系统对PVNS滑膜细胞的杀伤作用

目的〓〖HTK〗探讨腺病毒介导HSV-TK/GCV系统对色素沉着绒毛结节滑膜炎(PVNS)滑膜细胞的体外杀伤作用。〖HTW〗方法〓〖HTK〗将含LacZ基因的重组腺病毒载体Ad-LacZ转染PVNS滑膜细胞, X-gal染色法确定腺病毒对该细胞的转染效率，PCR检测转染细胞中HSV-TK基因的表达，MTT法检测TK阳性细胞对GCV的体外敏感性及旁观者效应，流式细胞仪检测HSV-TK/GCV系统作用后细胞的凋亡及坏死。〖HTW〗结果〓〖HTK〗感染复数为120时，近100％的细胞可被转染。HSV-TK/GCV系统对PVNS滑膜细胞的杀伤作用十分明显，且存在明显的旁观者效应。HSV-TK/GCV系统作用后细胞出现明显的凋亡及坏死。〖HTW〗结论〓〖HTK〗HSV-TK/GCV系统可明显杀伤PVNS中过度增殖滑膜细胞，可望用于PVNS的治疗。     

HSV-tk基因表达载体的构建及其对A549细胞的杀伤作用

目的构建自杀基因HSV-tk表达质粒,研究自杀基因疗法对人肺癌细胞的杀伤作用,探讨其治疗肺癌的可行性。方法PCR扩增tk基因带EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位点,然后构成建到pcDNA3.0载体中成pcDNA3.0-tk;将pcDNA3.0-tk转染A549肺癌细胞,应用细胞生长曲线和MTT法测定前药GCV对A549细胞的杀伤作用。结果成功获得pcDNA3.0-tk克隆,RT-PCR、Western印迹法证明A549细胞转染pcDNA3.0-tk后可表达自杀基因,GCV能特异性地杀伤A549/tk细胞。结论HSV-tk基因表达质粒构建成功;HSV-tK/GCV系统对肺癌A549细胞有一定的杀伤作用。     

基因载体MPEG-PLL共聚物与DNA形成复合物的体外研究

目的 研究非病毒基因载体聚乙二醇单甲醚(MPEG)-聚-L-赖氨酸(PLL)共聚物的组成在体外介导基因传递的影响.方法 将含有不同量MPEG的MPEG-PLL共聚物,与DNA形成复合物.测定MPEG-PLL/DNA复合物的粒径、Zeta电位,并进行凝胶阻滞分析,观察其对Hela细胞的毒性和转染率.结果 MPEG侧链并未...     

多聚乙烯亚胺介导基因转染的试验研究

目的确定多聚乙烯亚胺最佳的转染条件，评价PEI替代其它转染试剂的可能性。方法以MTT法检测PEI的细胞毒性。以PEI为载体，在不同的N／P比值的条件下，将绿色荧光蛋白基因和荧光素酶基因分别导入小鼠骨肉瘤细胞，以荧光显微镜酶检测系统检测其转染效率。结果PEI的细胞毒性较低。当N／P比值为8时，PEI的转染效率最高。结论PEI是一种价格低廉、低毒性、高效率的基因转染载体，可以广泛应用于体内外基因治疗。     

聚乙二醇修饰的聚精氨酸基因载体的构建及其体外评价

目的 利用聚乙二醇（PEG）修饰非病毒基因载体聚精氨酸（PLR）,考察PEG修饰对PLR的细胞毒性和PLR介导的RNA干扰效率的影响。 方法 利用1H-NMR鉴定合成的PLR-PEG的结构,确定PEG的修饰度,利用凝胶电泳表征载体对siRNA的包裹能力,在前列腺癌干细胞模型细胞（RC-92a/hTERT）上考察PLR-PEG的细胞毒性,考察PLR-PEG/siRNA复合物的细胞摄取及相关基因的干扰效率。 结果 通过结构鉴定确定PLR-PEG合成成功;细胞毒性实验表明PEG修饰可以降低PLR的毒性;PEG修饰会降低PLR/siRNA复合物的细胞摄取,高N/P时对细胞摄取的影响不大;PEG修饰也会降低PLR介导的RNA干扰效率,但PEG修饰度在一定范围内对干扰效率的影响比较小。 结论 PEG修饰的PLR作为基因载体在前列腺癌干细胞的基因治疗中有一定的应用前景。