用分子杂交技术检测乙型肝炎患者血清中HBV DNA

本世纪七十年代末,Galibert等应用DNA重组技术(DNA recombinat technology)将乙型肝炎病毒(HBV)的基因克隆成功,标志着对HBV的研究进入分子生物学的新阶段。目前,对HBV分子生物学研究的一个最重要的方法就是分子杂交技术,该技术的主要原理     

生物素标记HBVDNA分子探针临床应用研究

本文报告了生物素探针(Bio-HBV)试剂盒的临床应用研究。结果表明最低可检出0.1pgHBVDNA。Bio-HBV仅与HBVDNA杂交,不与PBR_(322)、λ、CT、HSDNA杂交。80例HBsAg献血员中,64例DNA阳性(80.0％),72例HBeAg阳性中,63例DNA阳性(87.5％)。符合率检测结果,敏感性97.4％,特异性92.3％,假阳性7.7％,假阴性2.6％,符合率98.1％,阳性预测值97.4％。Southern Blot试验表明89-1消毒剂30秒钟可杀灭200ng克隆HBVDNA。结果提示Bio-HBV可代替~(32)P HBV。     

应用分子杂交对钩端螺旋体DNA同源性的研究

Homology of leptospires from different genus, different serogroups were studied with molecular hybridization. Leptospiral DNAs were extracted and purified with phenolchloroform-isoamylalcohol method. Alpha 32P-dCTP was used to label DNA from L. interrogans serogroup icterohaemorrhagiae serovar lai strain 017 as a DNA probe, and hybridized with DNAs of 2 genus, 5 serogroups of leptospires represented by 6 strains on NC filter. Four serogroups of pathogenic leptospires which caused endemic disease in Sichuan Province were also detected by the probe. The results showed that L. interrogans serogroup icterohaemorrhagiae, serogroup autumnalis and serogroup hebdomadis had a high degree of homology while there was a low degree of homology between L. interrogans and L. biflexa and Leptonema illini. Four major serogroups of pathogenic leptospires in Sichuan Province, with their high degree of homology, could be detected by a radiolabelled probe from serogroup icterohaemorrhagiae. Hybridization may be used as a tool for diagnosis of leptospirosis in human beings and animals.     

用原位分子杂交方法检测人肝癌中Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达

原位分子杂交方法具有敏感性高、定位准确、对抗原可从基因水平进行定位等优点,尤其对细胞外基质包括胶原蛋白的研究更为适合。因为这类基因的蛋白产物半衰期较长(数月至数年),免疫组化方法所检测的抗原蛋白无法区分陈旧蛋白和新合成的蛋白,而细胞外基质的mRNA则因其半衰期极短,只有数小时,且不能透过细胞膜而弥散,故其mRNA水平更能代表它们的合成状态。国外1988和1989年     

反向点杂交检测肝癌细胞DNA甲基化方法的建立

目的建立反向点杂交(RDB)检测DNA甲基化的方法,并应用于临床肝癌细胞MAGE-A3 5'端CpG位点异常甲基化的检测。方法亚硫酸氢盐修饰后聚合酶链式测序分析细胞株Hep G2和外周血白细胞DNA的甲基化模式差异,建立RDB检测DNA甲基化方法,进行方法学评价,并运用于临床肝癌病理组织标本、肝硬化组织标本和正常对照组。结果 RDB检测肝癌细胞MAGE-A3 5'端CpG位点异常甲基化的灵敏度、特异度和准确性分别是83%(25/30)、100%(60/60)和94%(85/90)。其与临床肝癌诊断金标准的检验结果一致性较好(Kappa=0.870,P<0.05)。结论建立了RDB检测肝癌细胞DNA异常甲基化的方法,并可用于肝癌的临床早期诊断。     

基因芯片检测肝炎肝硬化患者肝组织中HBVDNA

目的研究病毒性肝炎基因芯片的制备，用肝炎基因诊断芯片，免疫组织化学法和原位分子杂交法，检测99例乙型肝炎后肝硬化肝组织，比较各种方法的优缺点。方法将PCR扩增的HBVDNA探针用点样仪点于玻片介质上，并经过点样处理后制备成基因芯片；收集肝炎后肝硬化肝组织标本99份，分别用基因芯片、原位分子杂交法、免疫组织化学法检测HBVDNA和HBcAg。结果53例HBcAg、HBVDNA阳性组织中基因芯片检测阳性40例：22例HBcAg阳性组织中基因芯片检测阳性6例；32例HBcAg、HBVDNA阴性组织中基因芯片检测均阴性。结论肝炎基因诊断芯片可以检测肝组织中HBVDNA，准确率可达75％，假阳性率低。     

DNA原位分子杂交技术的实践体会

原位分子杂交技术是近几年发展起来的一项新技术 ,我们对实际工作中的一些技术问题进行了探索 ,现总结如下供大家参考。1　ＤＮＡ原位分子杂交的实验1.1　ＤＮＡ原位分子杂交技术的实验步骤多 ,周期长 ,影响因素复杂 ,实验过程中任何一个环节稍不注意就会造成失败。因此 ,了解正确的实验步骤是完成实验的基础 ,以下就是通常的实验步骤。1.2　实验步骤 :(1)切片脱蜡至 3 0 %酒精 ,去离子水。(2 ) 3 7℃孵育 5分钟(3 )蛋白酶Ｋ3 7℃ (盖上玻片可节省试剂 ) 15分钟(4)去垢剂 (ＤＷ)洗 5分钟(5 )酒精脱水 (75 %　 95 %　 10 0 % )(6) 3 7℃孵育 …     

原发型肝癌的肝内HBVDNA整合状况

应用~(32)P标记的克隆HBVDNA片段探针对30例原发型肝癌病人的肝内组织进行了DNA电泳转移Southern杂交。结果检出HBVDNA整合者21例(70％),其中癌组织整合者18例(60％),癌外组织整合者16例(53％),双份组织均整合者13例(43％)。杂交带分析发现,不同例和同例肝内不同组织的HBVDNA整合模式都不相同,提示整合具随机性并可能发生整合和/或侧翼序列的基因重排。由于探针含HBV基因组中1.4～2.8kb的DNA顺序,故结果实际反映S基因及其下游增强子的整合状况。基因重排和增强子插入整合并活化细胞原癌基因的致癌机理在本文也进行了初步探讨。     

电泳印迹和分子杂交技术在肝内HBV DNA研究中的应用

应用DNA电泳转移、生物素探针Southern杂交及不同探针重复杂交等3项新技术研究肝炎肝癌的肝内HBV DNA分子状态。经过方法学比较以电泳印迹取代毛细渗吸法对65例肝炎肝癌病人的101份肝内组织DNA进行尼龙膜快速转移和HBV DNA杂交,结果检出HBV DNA分子状态里整合型15份、游离型31份、整合型合并游离型30份。其中12例乙型肝炎标本为经生物素探针杂交检测,结果全部检出游离型HBV DNA。还有3例乙型肝炎标本和2例其它肝炎标本为经重复杂交检测,即先用~(32)P探针杂交继去探针再用生物素探针杂交,结果乙型肝炎标本两次杂交HBV DNA都阳性,其它肝炎标本两次均阴性。阳性者表现为3.2kb和2.3kb电泳位置呈现杂交带,代表HBV之松弛环状和超螺旋状结构。由于两种探针各含不同序列,故结果可对待检基因进行初步序列分析。本实验表明,上述3项技术对临床医学研究有广泛的应用价值。     

PCR检测乙肝病人肝组织和血中HBVDNA

有用聚合酶链反庆（ＰＣＲ）结合地高辛素标记的乙肝病毒ＤＮＡ探针（ＨＢＶＤＮＡ－Ｄｉｇ）杂交技术检测了４９例乙型肝炎患者的肝组织标本和４６份血清标本中的ＨＢＶＤＮＡ。结果表明：ＰＣＲ检出乙肝病人肝组织和血清中ＨＢＶＤＮＡ阳性率比为杂交高（Ｐ〈０．０５）。在２１例同时检测了肝组织和血清中ＨＢＶＤＮＡ的病人中，肝组织ＨＢＶＤＮＡ一率为５７．１％；血清阳性率为６１．３％；两者总阳性率为８０．９％，说明ＰＣ     

分子斑点杂交法检测血清HBVDNA1200例结果分析

采用先进的分子杂交技术检测1200例肝病患者的HBVDNA及用酶免法检测HBV—M,并对各组HBV—M阳性肝病患者中HBVDNA的结果进行分析,结果显示HBeAg阳性组HBVDNA检出率为72.48％,明显高于抗—HBe阳性组HBVDNA的检出率0.82％。从而证实了HBeAg阳性与HBVDNA的检出率有密切关系。还显示抗—HBe阳性有48.97％的患者血清中可检出HBVNDA,即近1/2患者血清中病毒复制,有传染性。同时也说明抗—HBe的出现并不是HBV复制的终止,而只是复制水平明显降低。此检测方法安全,无放射性危险,不需添置特殊仪器和设备,可广泛地应用于乙肝病毒携带者的普查,急性乙肝预后的判断及抗病毒药物疗效的考核。     

应用分子杂交技术检验白细胞内HBV DNA

本研究应用斑点分子杂交技术检测了157例慢性HBV感染者及80例一般人群(含20例献血员)的血清和白细胞内HBV DNA的状况。在157例慢性HBV感染者中血清HBV DNA阳性率为39%,白细胞内HBV DNA为36%,两者同时阳性者为18%。而在60例血清HBV DNA阳性者中白细胞内HBV DNA同时阳性者为48%,血清HBV DNA阴性的93例中仍有30%的病例白细胞内HBV DNA为阳性。说明在血清HBV DNA阴性的慢性HBV感染者中仍有1/3的病例的白细胞内存在HBVDNA。80例一般人群经RIA法筛选发现:单纯HBsAg阳性6例,其中3例白细胞内HBV DNA阳性。HBsAg与HBeAg同时阳性者4例,其白细胞内HBV DNA均为阳性。单纯抗-HBs阳性的24例中仅1例白细胞内存在HBV DNA。单纯抗-HBc阳性者为12例,白细胞内HBV DNA无1例阳性。值得注意的是,在血清HBV标志全阴性的34例中也发现了2例白细胞内HBV DNA阳性。由于HBV可以感染人的白细胞,而且影响白细胞的免疫功能,其在形成HBV感染的慢性化上可能起着重要的作用,因而在肝炎的转归、流行病学的意义及发病机制等问题上它的作用尚需进一步探讨。     

Bio-DNA探针斑点分子杂交检测血清中HBV-DNA的应用

近年来,国内外对乙型肝炎的临床研究已进入到病毒分子生物学水平,开展这方面的工作要建立最灵敏的病毒 DNA 分子检测方法,现今首选的是分子杂交技术。国内由北京医科大学附属人民医院肝病研究所报道了生物素(Bio)DNA 探针斑点分子杂交检测血清中 HBV-DNA 的实验方法和试剂制备,我科于1989年将该技术应用于临床。本文就血清 HBV-DNA 检测及其与 HBV 免疫学标志的相互关系和意义作一比较和分析。