重组Persephin腺病毒对6-OHDA损伤神经干细胞的保护作用

[目的]探讨Persephin对6-羟基多巴(6-OHDA)损伤神经干细胞的保护作用.[方法]用RT-PCR法从人胚胎脑获得Persephin cDNA,构建重组Persephin腺病毒.用Western blot方法分析Persephin基因的表达,Hoechst染色和流式细胞术测定6-羟基多巴对神经干细胞凋亡的诱导作用.[结果]从人胎脑成功克隆了人Persephin cDNA,构建了其腺病毒载体.Western blot证实重组Persephin腺病毒在神经干细胞中的表达,表达的Persephin可抑制6-羟基多巴诱导的神经干细胞凋亡.[结论]Persephin对6-羟基多巴损伤神经干细胞具有保护作用.     

6-羟基多巴对C17．2神经干细胞毒性及NURR1基因对其保护作用

[目的]初步鉴定C17．2神经干细胞的特性并研究不同浓度6-羟基多巴对C17．2神经干细胞毒性及NURR1基因对C17．2神经干细胞的保护作用。[方法]免疫组化检测神经干细胞特异性抗原nestin，X—gal染色检测LacZ基因的表达，流式细胞仪检测剂量为0．02、0．04、0．06g／L6-羟基多巴在添加含有NURR1基因的重组复制缺陷性病毒前后诱发神经干细胞的坏死和凋亡。[结果]C17．2神经干细胞nestin抗原染色阳性，绝大部分细胞呈X-gal染色阳性，0.02g／L时6-羟基多巴以诱导神经干细胞凋亡为主，随着剂量增加，细胞坏死增多，0．06g／L时则以神经干细胞的坏死为主，NURR1基因过表达能明显减少神经干细胞的坏死和凋亡。[结论]C17．2神经干细胞具有明显的特性，6-羟基多巴诱发的C17．2神经干细胞凋亡或坏死与其剂量有关，NURR1基因对神经干细胞有保护作用。     

6-羟基多巴对C17.2神经干细胞毒性及 NURR1基因对其保护作用

[目的]初步鉴定C17.2神经干细胞的特性并研究不同浓度6-羟基多巴对C17.2神经干细胞毒性及NURR1基因对C17.2神经干细胞的保护作用.[方法]免疫组化检测神经干细胞特异性抗原nestin,X-gal染色检测LacZ基因的表达,流式细胞仪检测剂量为0.02、0.04、0.06 g/L 6-羟基多巴在添加含有NURR1基因的重组复制缺陷性病毒前后诱发神经干细胞的坏死和凋亡.[结果]C17.2神经干细胞nestin抗原染色阳性,绝大部分细胞呈X-gal染色阳性,0.02 g/L时6-羟基多巴以诱导神经干细胞凋亡为主,随着剂量增加,细胞坏死增多,0.06g/L时则以神经干细胞的坏死为主,NURR1基因过表达能明显减少神经干细胞的坏死和凋亡.[结论]C17.2神经干细胞具有明显的特性,6-羟基多巴诱发的C17.2神经干细胞凋亡或坏死与其剂量有关,NURR1基因对神经干细胞有保护作用.     

人神经营养素-3受体基因的扩增及其重组腺病毒载体的构建

【目的】构建人神经营养素-3（neurotrophin-3，NT-3）受体（即酪氨酸蛋白激酶受体C，tyrosine protein kinase C，TrkC）基因重组的腺病毒表达载体。【方法】从人脑组织mRNA中扩增Trkc基因全长cDNA，定向克隆于穿梭质粒pShuttle中，获得一个带有CMV启动子的表达盒。再将表达盒与腺病毒骨架DNA（Adeno-X viral DNA）体外连接，形成重组腺病毒质粒（pAd-TrkC）。用pAd-TrkC转染人胚肾293细胞后包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒（Adeno-Trkc）。【结果】TrkC基因RT-PCR扩增产物为2478bp。Adeno-TrkC经PCR鉴定为正确重组子。【结论】应用体外连接法已构建了人TrkC重组腺病毒表达载体，这为进一步应用NT-3进行基因治疗中枢神经损伤奠定了基础。     

大鼠BDNF基因复制缺陷型重组腺病毒的构建与鉴定

【目的】构建携带大鼠脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）目的基因的复制缺陷型重组腺病毒，并初步检测其体外表达目的基因的能力。【方法】提取大鼠脑组织总RNA，使用RT—PCR方法扩增BDNF目的基因并将其克隆入pMD18-T Simple载体测序，将测序完全正确的BDNF目的基因克隆入pShuttle2中，然后利用体外连接法将BDNF目的基因克隆入Adeno—X^TM腺病毒骨架中。Lipofectamine^TM 2000法转染HEK293细胞包装携带BDNF目的基因的重组腺病毒，少量提取重组腺病毒DNA检测证实为复制缺陷型BDNF基因重组腺病毒后大量扩增。蛋白电泳及Western blot法初步检测BDNF目的基因在HEK293细胞中的表达。【结果】成功构建了携带大鼠BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒。并证实其在HEK293细胞中可高水平表达BDNF目的基因。【结论】利用体外连接法可方便、快捷地构建携带BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒，并可在体外高水平表达表达其所携带的目的基因。     

大鼠BDNF基因复制缺陷型重组腺病毒的构建与鉴定

 【目的】构建携带大鼠脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）目的基因的复制缺陷型重组腺病毒，并初步检测其体外表达目的基因的能力。【方法】提取大鼠脑组织总RNA，使用RT—PCR方法扩增BDNF目的基因并将其克隆入pMD18-T Simple载体测序，将测序完全正确的BDNF目的基因克隆入pShuttle2中，然后利用体外连接法将BDNF目的基因克隆入Adeno—X^TM腺病毒骨架中。Lipofectamine^TM 2000法转染HEK293细胞包装携带BDNF目的基因的重组腺病毒，少量提取重组腺病毒DNA检测证实为复制缺陷型BDNF基因重组腺病毒后大量扩增。蛋白电泳及Western blot法初步检测BDNF目的基因在HEK293细胞中的表达。【结果】成功构建了携带大鼠BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒。并证实其在HEK293细胞中可高水平表达BDNF目的基因。【结论】利用体外连接法可方便、快捷地构建携带BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒，并可在体外高水平表达表达其所携带的目的基因。     

肾癌G250/MN/CAIX 抗原基因在酿酒酵母中的 诱导表达及意义

 【目的】 观察G250 抗原基因编码区cDNA 全长基因片段在酿酒酵母中诱导表达情况,并初步探讨其作为肿瘤治疗中的意义。【方法】 应用基因重组技术将人G250 cDNA序列克隆入酿酒酵母穿梭诱导表达载体pYES2/NT C,构建重组酵母真核表达质粒pYES2/NT C-G250并转化酿酒酵母菌株INVSc1,筛选阳性克隆转化子,经半乳糖诱导表达后进行菌体全蛋白的Western blot检测。【结果】 成功构建pYES2/NT C-G250 重组酿酒酵母诱导表达质粒,证实其能够在酿酒酵母中诱导表达,表达量随诱导时间而变化,8 ~ 12 h 达高峰。【结论】 人G250基因片段能够在酿酒酵母中表达,为进一步探讨基因重组酿酒酵母G250 疫苗抗肿瘤效应及其安全性打下基础.     

腺病毒介导的NEP基因对Aβ25-35诱导的SK-N-SH细胞凋亡的抑制作用

目的    研究脑中性内肽酶(NEP)基因外源表达对神经毒性物质β-淀粉样肽(Aβ25-35)诱导损伤的SK-N-SH细胞凋亡的抑制作用。方法    用脂质体法将含NEP的腺病毒载体转染高代次293细胞,制备高滴度病毒载体,感染Aβ25-35处理的外源损伤的人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞),采用MTT法检测细胞存活率,采用流式细胞术分析细胞凋亡状态和细胞内活性氧水平,采用RT-PCR和Western blot法检测凋亡相关基因bcl-2及bax的表达情况。结果    细胞存活率及流式细胞术检测结果显示,NEP高表达可明显减轻Aβ25-35诱导的细胞凋亡及减低细胞内活性氧水平,RT-PCR和Western blot结果显示,NEP对Aβ25-35诱导的细胞凋亡的抑制作用可能是通过减少促凋亡基因bax的表达以及降低细胞内活性氧水平来实现的。结论    NEP对Aβ25-35诱导的神经细胞损伤具有一定保护作用,其作用机制可能与凋亡相关基因有关。     

腺病毒载体介导的大鼠DNA多聚酶β重组体的构建及其在PC12细胞中的表达

【目的】为探讨DNA多聚酶β在神经细胞损伤中的作用与机制，构建其重组腺病毒载体，并在PC12细胞中表达。【方法】RT—PCR获取大鼠DNA多聚酶β（POLβ）的编码序列，TA克隆测序，酶切POLβ基因并连人穿梭质粒pAdTrack—CMV，电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183。重组腺病毒质粒（pAd—polp）和Lipofectamine2000转染293细胞，用重组腺病毒感染PC12细胞。【结果】10个TA克隆中有3个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLβ cDNA序列完全一致，同源重组检测时30个克隆中有8个含目标条带。DNA序列正确的POLβ重组腺病毒质粒转染293细胞后，感染Ad—polβ的293及PC12细胞荧光显微镜下可见绿色荧光，重组腺病毒Ad—polβPCR鉴定含目标条带，Ad—polβ感染PC12细胞Western Blot检测到POLβ蛋白表达。【结论】成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体并在PC12细胞中表达     

沉默核仁素可诱导大鼠神经干细胞的分化

目的 探讨核仁素(nucleolin)对原代神经干细胞(NSCs)分化的影响及其相关机制.方法 构建核仁素siRNA腺病毒表达载体,将经鉴定正确的重组腺病毒质粒转染HEK293A细胞,包装得到具有感染能力的nucleolin-siRNA重组腺病毒.病毒体外感染原代NSCs,采用Western blot检测nucleolin蛋白的表达情况,Nucleolin-siRNA对神经干细胞Nestin、Wnt3、β-catenin蛋白表达的影响;采用免疫细胞化学检测nucleolin-siRNA对神经干细胞分化的影响.结果 经酶切和测序鉴定均证实nucleolin-siRNA重组腺病毒载体构建成功,其插入序列正确无误.Western blot检测结果显示,转染nucleolin-siRNA2的细胞nucleolin表达明显受到抑制.siRNA+组NSCs分化为NSE阳性细胞和GFAP阳性细胞的分化率明显比CON组、siRNA-组增加,且差异具有统计学意义(P<0.01).与阴性对照组相比,siRNA+组Nestin的表达明显减少,Wnt3表达明显增多,β-catenin入核明显增多,其差异具有统计学意义(P<0.05).结论 本研究成功地构建了针对nucleolin基因的siRNA重组腺病毒载体,沉默nucleolin可诱导神经干细胞的分化,其机制可能与Wnt信号转导通路的激活有关.     

人血管内皮生长因子165基因腺病毒载体的构建及其在C17.2神经干细胞的表达

[目的]构建含有人血管内皮生长因子165(VEGF165)基因的重组腺病毒载体并观察其在C17.2神经干细胞的表达,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供基础.[方法]将VEGF165基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV,获得重组质粒pAdTrack VEGF165,经酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠杆菌BJ5183同源重组获得重组腺病毒质粒,将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒pAdCMV VEGF165,转化体外培养的C17.2神经干细胞.通过RT-PCR、原位杂交、免疫组化、Western blot法检测其在C17.2神经干细胞中的表达.[结果]重组腺病毒AdCMV VEGF165在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×1011efu/mL.病毒上清液经ELISA检测VEGF165表达的量为(1135±138)ng/L.重组腺病毒转染神经干细胞后有稳定表达.[结论]成功构建pAd VEGF165重组腺病毒,获得了稳定表达VEGF165的神经干细胞克隆,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供了基础.     

脑溢安对新生大鼠海马神经干细胞缺氧损伤及p38MAPK活性的影响

目的探讨中药脑溢安颗粒(简称脑溢安)对神经干细胞缺氧损伤的影响及其保护作用机制.方法体外培养神经干细胞来自新生3～5 d SD大鼠海马组织,造缺氧损伤模型,用原位末端标记法(TUNEL)进行细胞凋亡检测,应用免疫共沉淀、激酶反应及Western blot技术研究脑溢安对缺氧损伤神经干细胞内p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 Mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)活性的影响.结果培养神经干细胞缺氧损伤后发生凋亡,脑溢安能促进缺氧损伤神经干细胞存活及减少神经干细胞凋亡;缺氧损伤后神经干细胞内p38MAPK活性增强,脑溢安血清组p38MAPK活性显著低于模型组和正常血清组(P＜0.01).结论脑溢安能保护缺氧损伤神经干细胞,抑制缺氧损伤激活的p38MAPK信号转导通路可能为其保护作用机制之一.     

人血管内皮生长因子（VEGF165）在大肠杆菌中的表达及鉴定

【目的】克隆人VEGF165基因，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达、纯化重组VEGF165(rVEGF165)蛋白。【方法】用PCR技术，从人心脏cDNA库中扩增VEGF165 cDNA，并定向克隆入原核表达载体pET-28a中。用IPTG诱导VEGF165在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。用HisTrap亲合层析柱纯化重组rVEGF165 Western—blot鉴定。根据人VEGF165的促血管内皮细胞增殖的特性，用MTT法检测重组VEGF165的生物学活性。【结果】从人心脏cDNA库中扩增出VEGF165 cDNA片段。克隆的VEGF165 cDNA长576bp，编码191个氨基酸残基，序列与献报道一致。SDS-PAGE电泳显示，经IPTG诱导，高效表达出25ku的rVEGF165，主要存在于包涵体中，约占菌体总蛋白的20％。MTT检测显示，复性后的rVEGF165能呈剂量依赖性地促进脐静脉血管内皮细胞增殖。【结论】克隆、测定了人VEGF165基因，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出rVEGF165。     

EGFR反义cDNA联合p16β干预喉癌细胞信号转导的实验研究

目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)反义cDNA联合野生型p16β在体外对人喉癌Hep-2细胞信号转导的干预作用.方法 将已纯化的EGFR反义cDNA重组腺病毒和p16β在体外转染Hep-2喉癌细胞,采用MTT实验、流式细胞术(FCM)、免疫组化、Western blot等方法检测Hep-2细胞增殖抑制作用;进行细胞周期、DNA含量、细胞凋亡率的定量分析;检测重组腺病毒对Hep-2细胞EGFR蛋白表达的抑制和p16β蛋白过表达.结果 反义EGFR mRNA表达重组腺病毒能有效抑制Hep-2细胞的增殖活性;超过77.7%以上的被转染Hep-2细胞被阻滞在G0/G1期;转染细胞的凋亡率升高;同时出现EGFR蛋白表达的抑制和p16β蛋白的过表达.当p16β重组腺病毒和EGFR反义cDNA重组腺病毒联合转染Hep-2细胞后其抑制Hep-2细胞增殖活性、细胞周期阻滞、抑制细胞调亡作用明细增强.结论 p16β和EGFR反义cDNA能有效地干预人喉癌Hep-2细胞的信号转导机制,从而达到抑制Hep-2细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用.     

重组人p53腺病毒联合5-氟尿嘧啶对胃癌细胞的作用

目的 研究重组人p53腺病毒增加胃癌细胞对5-氟尿嘧啶（5-Fu）敏感性的作用。方法 重组人p53腺病毒感染胃癌细胞BGC-823，Western blot法检测p53蛋白在胃癌细胞中的表达；MTT法测定重组人p53腺病毒单独及联合5-Fu用药的不同浓度处理细胞的生长抑制率，流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡。结果 重组人p53腺病毒感染BGC-82348h，p53蛋白在BGC-823中高表达，并产生G2／M期阻滞和细胞凋亡。重组人p53腺病毒联合5-Fu用药增加5-Fu的敏感性，有剂量时间的依赖性。结论 腺病毒介导p53基因感染BGC-823细胞诱导凋亡并增加胃癌细胞对5-Fu的敏感性。本实验为p53基因治疗与胃癌化疗临床结合提供了可靠的实验依据。     

BDNF基因逆转录表达载体的构建和在淋巴细胞中的表达

【目的】构建含脑源性神经营养因子基因(brain-derived neurotrophic factor，，BDNF gene)逆转录表达载体并了解其在淋巴细胞中的表达，探讨治疗基因的非损伤性脑内转移的新途径。【方法】用RT-PCR方法从大鼠海马组织总RNA中扩增(cDNA)BDNF片段，应用基因重组技术将大鼠(cDNA)BDNF克隆到逆转录病毒载体pLXSN中，用限制性内切酶酶切分析和DNA测序对重组质粒进行鉴定，采用Lipofect AMINE将重组大鼠(cDNA)BDNF导入PA317细胞，获取高滴度的病毒上清转染大鼠淋巴细胞，应用流式细胞仪(FCM)检测大鼠淋巴细胞：BDNF的表达，噻唑蓝(MTT)法检测淋巴细胞培养上清对PCI2细胞增殖的影响。【结果】扩增出大鼠(cDNA)BDNF片段，限制性内切酶酶切和DNA测序证实获得正确的重组质粒pLXSN．BDNF，BDNF基因修饰的大鼠淋巴细胞能高表达：BDNF蛋白，其培养上清能促进PCI2细胞增殖。【结论】成功构建了BDNF’基因逆转录表达载体，BDNF基因修饰的大鼠淋巴细胞能高表达和分泌具有生物活性的BDNF蛋白，为治疗基因的非损伤性脑内转移奠定了一定基础。     

携带SARS-CoV刺突蛋白N端片段重组腺病毒的构建

[目的]构建携带SARS冠状病毒刺突蛋白N端基因片段的重组腺病毒.[方法]从SARS病毒cDNA扩增刺突蛋白N端基因片段(-45～1469nt,截短的S1区,SN),插入腺病毒穿梭质粒pShuttle,通过体外连接法构建重组腺病毒Ad-SN.用Ad-SN感染Vero-E6细胞,通过RT-PCR和Western blot法检测SN的表达.[结果]克隆的SN基因序列与文献报道基本一致;Ad-SN基因组结构与预期一致.在Ad-SN感染的Vero-E6细胞中存在SN基因的转录和分泌型SN蛋白的表达.[结论]体外连接法是一种简便易行的重组腺病毒载体构建方法;重组腺病毒Ad-SN能正确表达分泌型SN蛋白,可用于诱导抗SARS免疫的动物实验研究.     

人DeltaNp73α基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的利用Adeasy腺病毒载体系统构建含人DehaNp73α cDNA的重组腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒。方法从pcDNA3-DeltaNp73α—HA中酶切出DehaNp73α基因，并插入pAdTrack—CMV中构建成腺病毒穿梭质粒；pAdTrack-CMV—DehaNp73α线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的E.coli．BJ5183菌株内同源重组。筛选正确的重组质粒，PacⅠ线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒；并在293T细胞中反复扩增；增强离心法转染树突状细胞，Western blot检测目的蛋白的表达。结果经限制性内切酶酶切鉴定、PCR筛选、基因测序和GFP表达证实成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒；Western blot检测出预期相对分子质量为67×10^3的特异条带。结论成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组病毒。     

肾癌G250/MN/CAIX抗原基因在酿酒酵母中的诱导表达及意义

【目的】观察G250抗原基因编码区cDNA全长基因片段在酿酒酵母中诱导表达情况,并初步探讨其作为肿瘤治疗中的意义。【方法】应用基因重组技术将人G250cDNA序列克隆入酿酒酵母穿梭诱导表达载体pYES2/NTC,构建重组酵母真核表达质粒pYES2/NTC-G250并转化酿酒酵母菌株INVSc1,筛选阳性克隆转化子,经半乳糖诱导表达后进行菌体全蛋白的Westernblot检测。【结果】成功构建pYES2/NTC-G250重组酿酒酵母诱导表达质粒,证实其能够在酿酒酵母中诱导表达,表达量随诱导时间而变化,8～12h达高峰。【结论】人G250基因片段能够在酿酒酵母中表达,为进一步探讨基因重组酿酒酵母G250疫苗抗肿瘤效应及其安全性打下基础。     

人DeltaNp73α基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的 利用Adeasy腺病毒载体系统构建含人DeltaNp73α cDNA的重组腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒.方法 从pcDNA3-DeltaNp73α-HA中酶切出DeltaNp73α基因,并插入pAdTrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒;pAdTrack-CMV-DeltaNp73α线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的E.coli.BJ5183菌株内同源重组.筛选正确的重组质粒,PacⅠ线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒;并在293T细胞中反复扩增;增强离心法转染树突状细胞,Western blot检测目的蛋白的表达.结果 经限制性内切酶酶切鉴定、PCR筛选、基因测序和GFP表达证实成功构建了携带DeltaNp73α cDNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒;Western blot检测出预期相对分子质量为67×103的特异条带.结论 成功构建了携带DeltaNp73α cDNA的重组病毒.