丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3的研究进展

丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS3共有631个氨基酸组成，具有线氨酸蛋白酶和三磷酸核苷酶（NTPase）和螺旋酶（Helicase）的功能，在HCV多聚蛋白的成熟和病毒复制过程中发挥重要作用。非结构蛋白NS3具有较强的免疫原性和抗原性，是检测HCV感染的主要抗原之一。近年的研究发现NS3内部的裂解产物更具有致癌潜能。此外，NS53蛋白还参与NS5A的超磷酸化修饰过程等。     

HCV非结构蛋白质5A基因全长和高免疫源区的表达及免疫活性检测

目的探讨HCV非结构蛋白质5A（NS5A）基因全长和高免疫源区的表达并比较其检测灵敏度。方法以含HCV全基因组的质粒pBR^tm／HCV-3011（1b型）为模板，采用PCR方法扩增出NS5A全长基因（以下用NS5AL代替）和高免疫源区基因（以下用NS5AS代替），与pET-32a载体相连接构建重组表达载体pET-NS5AL和pET-NS5AS，分别转化E.coli Rosetta（DE3）pLysS和BL21（DE3）感受态细胞，经异丙幕-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后，蛋白质印迹法检测其表达，镍螯合（Ni2^＋-NTA）琼脂糖亲和层析柱纯化重组NS5AL和NS5AS蛋白，最后通过ELISA法检测重组蛋白的免疫活性并对其榆测灵敏度进行比较。结果SDS—PAGE鉴定与蛋白质印迹验证结果表明，重组NS5AL和NS5AS蛋白均得到很好地表达；纯化的重组NS5AL和NS5AS蛋白浓度分别为0．146和0．426mg／ml，纯度均〉96％；ELISA检测结果表明，重组NS5AL和NS5AS蛋白均具有较好的免疫活性，且重组NS5AL蛋白的检测灵敏度明显高于NS5AS。结论成功地表达出重组NS5AL和NS5AS蛋白，均具有较高的免疫活性，将有助于提高HCV临床检测的灵敏度。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的研究进展

对丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS5A的研究表明，NS5A在HCV转录，复制及细胞信号转导中有重要作用，NS5A影响干扰素（IFN）治疗丙型肝炎的疗效，但日本和欧洲对这方面的研究结果间存在差异，现就这方面的进展作一综述。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3的研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3共有631个氨基酸组成,具有丝氨酸蛋白酶和三磷酸核苷酶(NTPase)和螺旋酶(Helicase)的功能,在HCV多聚蛋白的成熟和病毒复制过程中发挥重要作用.非结构蛋白NS3具有较强的免疫原性和抗原性,是检测HCV感染的主要抗原之一.近年的研究发现NS3内部的裂解产物更具有致癌潜能.此外,NS3蛋白还参与NS5A的超磷酸化修饰过程等.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白4B研究进展

丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白4B（NS4B）是至今为止功能尚不明确的HCV非结构蛋白，近年来的研究表明其定位于内质网膜，与细胞内膜结构的功能有关，在体外实验中。它和NS4A一起可以抑制宿主细胞的翻译；在一定程度上可以减弱机体对抗病毒药物干扰素-α（INF-α）的反应，同时使病毒可以逃避宿主对病毒的免疫；在HCV病毒的致瘤性方面亦有重要作用。可以与NS3，NS4A，NS5A，NS5B等相互作用。对其它非结构蛋白的功能起协同，促进甚或是下调作用。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A抗原模拟表位的筛选和鉴定

目的：筛选丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV)非结构蛋白NS4A（HCV NS4A)特异性噬菌体模拟表位，为抗HCV的疫苗研究探索新途径。方法：以抗HCV NS4A的单克隆抗体作为固相筛选分子，对人工合成的噬菌体随机12肽库进行5轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选过程，随机挑取45个克隆，经噬菌体酶联免疫吸附法（ELISA）鉴定并进行交叉反应实验以及竞争抑制性结合实验，最后对所选克隆进行DNA序列分析，以确定HCV NS4A抗原的模拟表位。结果：经噬菌体富集后，从随机筛选的45个克隆中得到13个阳性克隆，确定氨基酸序列XXRXXMXPXXXI为HCV NS4A的模拟表位。结论：用噬菌体12肽库成功筛选得到HCV NS4A的模拟表位，为开展用HCV模拟表位探索HCV的防治研究创造了条件。     

丙肝病毒NS5A蛋白对NS5B的RdRP活性影响的研究

丙型肝炎病毒 (Hepatitis C virus,HCV )非结构蛋白 (Nonstructural,NS) 5 A在 HCV基因组复制中的作用目前尚不清楚。本文研究 His- NS5 A对 NS5 B的 RNA依赖性 RNA酶 (Rd RP)活性的影响 ,以了解 NS5 A在HCV RNA复制中的作用。采用变性 -复性方法 ,纯化大肠杆菌表达的重组组氨酸 NS5 A融合蛋白。 GST结合洗脱实验 (GST pull- down assay)研究 NS5 A和 NS5 B是否结合。以不同的摩尔浓度比 ,将纯化的 NS5 B和 NS5 A蛋白混合 ,检测 NS5 A对 NS5 B的 Rd RP活性的影响。获得高得率的纯化 His- NS5 A蛋白。重组 NS5 A蛋白可在体外与NS5 B结合并抑制后者的 Rd RP活性。本研究报道了纯化重组 His- NS5 A蛋白的变性 -复性方法 ,结果显示纯化的重组 NS5 A在体外可与 NS5 B相互结合 ,并明显抑制 NS5 B Rd RP活性。提示了 HCV NS5 A在病毒复制中的可能作用。     

HCV NS3蛋白单克隆抗体的制备及其识别区域的分析

目的 制备针对丙型肝炎病毒（HCV）非结构区NS3全长蛋白的单克隆抗体（MAb）,并分析获得的单抗识别表位所在区域,为建立以NS3蛋白为靶位的抗HCV研究提供抗体工具。方法 用原核表达的HCV非结构区NS3全长蛋白作为免疫原,采用小鼠腹股沟皮下NC膜包埋法免疫小鼠,按常规杂交瘤细胞的制备方法,经细胞融合、克隆化制备抗NS3蛋白的MAb。用间接免疫荧光法和Westem blot鉴定其特异性。分别构建NS3丝氨酸蛋白酶（NS3蛋白的N末端1／3）编码基因的真核表达质粒pcDNA3．1（-）-ns3p、NS3解旋酶（NS3蛋白的C末端2/3）编码基因的真核表达质粒pcDNA3．1（-）-ns3A,将其瞬时转染COS-7细胞后,以获得的单克隆抗体作为一抗,通过免疫荧光分析获得单抗识别表位所在的区域。结果 获得了2株抗NS3蛋白的单克隆抗体,这2株MAbs均特异识别NS3蛋白,并确定了它们的结合区域。结论 获得了针对NS3蛋白的单克隆抗体,并对其单抗识别表位所在的区域进行了分析,为下一步进行以NS3蛋白为靶位的抗HCV研究奠定了良好的基础。     

pSG5／NS5A5B△C质粒的构建及在Huh7细胞中的表达

目的:构建pSG5/NS5A5B△C质炷,并检验其在Huh7细胞中的瞬时表达.方法:使用已经构建的pTM1-△C质粒,并检验其在NS2NS5A5B△C质粒为模板,根据pTM1、HCV NS5A5B△C、pSG5序列和酶切位点特点设计引物,PCR扩增得到HCVNS5ASB△C基因片段,将目的片段插入psG5载体中,经筛选阳性克隆、Sac Ⅰ和Bg/Ⅱ分别酶切鉴定后,用FuGene 6转染试剂转染入Huh7细胞.用免疫荧光染色、Western blot检测HCV NS5A5B△C在Huh-7细胞中的表达.结果:限制性内切酶Sac Ⅰ和BglⅡ分别酶切鉴定后,琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切片段大小和插入方向均与预计一致.荧光显微镜下可见转染的Huh7细胞表达带有绿色荧光的HCV NS5A5B△C蛋白,该蛋白主要表达于细胞质,表达率达40%以上.Western blot结果也证实在转染pSG5/NS5A5B△C的Huh7细胞中出现了大小与HCV NS5A5B△C(82 ku)一致的条带.结论:成功构建了pSGS/NS5A5B△C质粒,并在Huh7细胞中成功瞬时表达,为进一步研究HCV蛋白的功能奠定了基础.     

HCV NS3/4A介导的逃逸机体固有免疫研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)为单股正链RNA病毒,归类于黄病毒科、肝炎病毒属,有6个基因型.HCV基因组含有约9600个碱基,编码一条约3010个氨基酸的多聚蛋白前体,该多聚蛋白在翻译的同时或之后被宿主和病毒的蛋白酶剪切加工成至少10种成熟蛋白,包括结构蛋白Core、E1、E2和p7,非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B.其中HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶不仅是HCV多聚蛋白前体加工成熟的关键酶,而且还通过调控干扰素调控因子(IRF)-3的表达水平,从而破坏细胞内固有免疫通路,使病毒能够逃避宿主的固有免疫反应,并形成长期的持续性感染[1].     

HCV NS5A基因在hepG2细胞中的表达以及对PI3K的影响

目的：探讨HCV—NS5A对PI3K表达的影响。方法：应用PCR技术从含有HCV全长开放阅读框的质粒中获得NS5A全长基因片段，利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3．0（-）中。通过酶切、PCR及测序鉴定，NS5A基因已正确插入到pcDNA3．0（-）中，再利用脂质体转染HepG2细胞。结果：经RT—PCR及Western blot检测，HCV的NS5A基因在HepG2细胞中获得表达，而且在表达重组NS5A的转染HepG2细胞中，检测到PI3K蛋白的表达。结论：NS5A可在体外激活PI3K及其信号通路。     

HCV非结构蛋白NS5A人源单链可变区抗体基因的筛选与鉴定

目的 筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS5A的人源单链可变区抗体（ScFv)的编码基因,为HCV NS5A蛋白质生物学功能的研究及抗HCV的基因治疗研究开辟新途径。方法 采用噬菌体表面展示技术,以重组纯化的HCV非结构蛋白NS5A为固相抗原,从噬菌体单链可变区抗体半合成库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得抗原结合活性和特异性较强的HCVNS5A人源单链可变区抗体基因片段的阳性克隆,并对其进行免疫检测及序列测定,结果 筛选得到的ScFv片段基因核苷酸序列为789nt,编码由262个氨基酸残基组成的多肽,具有典型的免疫球蛋白轻链和重链可变区的结构特点,基因编码产物具有HCV NS5A蛋白反应的免疫学活性和特异性。结论 利用噬菌体抗体库技术,成功获得了HCV NS5A人单链可变区抗本ScFv编码基因,并获得了可溶性单链抗体的表达。     

聚合酶链反应诱导丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶活性位点的突变及突变HCVNS3/4a蛋白的表达

目的 以聚合酶链反应（PCR）突变方法诱导丙型肝炎病毒（HCV）蛋白酶活性位点ser1165的突变，获得全长非结构基因3（NS3）／4a的表达与纯化。方法 分别以NS3 N端正向引物与诱变反向引物，诱变正向引物与NS4a C端反向引物获得2个PCR产物，产物纯化后在新的PCR反应体系中加入以上2个PCR产物与NS3 N端正向引物、NS4a C端反向引物。再次PCR扩增突变模板，分别与野生型模板重组入表达载体pET26-Ub，转化大肠杆菌BL21（DE3）pCG1，诱导表达后经菌体裂解、纯清化、硫酸铵沉淀、DEAE－Sepharose、NTA纯化，Western blot分析表达蛋白的特异性及PCR诱导突变使HCV蛋白酶活性位点失活的作用。结果 获得诱导突变的模板，Western blot证实该突变可完全阻断对NS3丝氨酸蛋白酶与NS3螺旋酶间的切割，部分阻断了螺旋酶与NS4a间的切割，纯化后的HCV NS3／4a蛋白在SDS－PAGE胶上显示为双带。结论 PCR突变方法简便、有效，获得丝氨酸蛋白酶失活的NS3蛋白表达，NS3蛋白与NS4a蛋白以复合物形式存在。     

丙型肝炎实验室诊断研究进展

丙型肝炎的诊断包括证实HCV感染和评价肝病变程度及研究预后和疗效的预测因素。l丙型肝炎的试验：分两类①血清学检测；②分于水平检测。至今为止，血清学的检测方法已研究出第三代抗一HCV的检测方法。且敏感性及特异性不断提高．第三代试验（EIA。和RIB．A。）包括HCV的C区，NS。，NS。，NS。区抗原。目前最敏感的HCV的P（：检查可测出每毫升血浆和血清中小于100个拷贝。定量PCR可确定HCV拷贝数量，而分支DNA（bDNA）技术是最精确的检测方法。分子水平检测已发展到区分HCV基因型，其；l＄床重要性还将有待于继续研究。抗…     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A反式激活基因的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白4A（HCV NS4A）转染细胞差异表达cDNA消减文库，克隆HCV NS4A蛋白反式激活相关基因。方法以HCV NS4A表达质粒pcDNA3．1（-）-NS4A转染Hep G2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，进行SSH分析。将富集的二次PCR产物与TIA载体连接，并转染大肠埃希菌进行文库扩增，随机挑取克隆，聚合酶链反应（PCR）扩增后进行测序及同源性分析。结果文库扩增后得到36个阳性克隆，经菌落PCR分析显示200～1000bp插入片段。对其中的25个片段测序，并进行同源性分析，显示18种已知基因编码蛋白和2种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS4A反式激活靶基因。结论成功构建了HCV NS4A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，为进一步阐明HCV NS4A反式调节的靶基因等提供了相关的平台。     

HCV NS5A-B片段的表达及在酶活性研究中的应用

目的：利用原核表达载体pBVIL1，表达丙型肝炎病毒非结构蛋白（NS3）丝氨酸蛋白酶催化底物NS5A—B小分子，为进一步研究蛋白酶活性提供方法学。方法：将PCR合成的NS5A—B（2412—2427aa）基因直接插入高效原核表达载体pBVIL1，融合表达NS5A—B片段．包涵体形式的表达产物用8mol／L脲溶解后，采用离子交换和凝胶过滤两步纯化。利用SDS—PAGE、Western blot和ELISA方法，于37℃酶催化条件下，分析NS5A—B底物的降解活性。结果：（1）构建了pBVIL1／NS5A—B重组质粒，鉴定证明NS5A—B基因片段正确地插入表达载体上：融合蛋白在转化质粒的HB101菌中得到高效表达。分离纯化重组蛋白后浓度可达0．73g／L。（2）在NS3蛋白酶作用不同时间后，用SDS—PAGE和Western blot证实，底物带可被明显降解，ELISA分析也证明，NS5A—B具有酶底物活性。结论：含有酶切位点的NS5A—B融合蛋白可被NS3丝氦酸蛋白酶有效地降解，可用作为NS3蛋白酶的底物，可替代全长NS5A—B和化学合成肽用于酶活性和酶阻断剂的研究     

p7蛋白--丙型肝炎病毒潜在抑制靶点

丙型肝炎（hepatitisc）是严重的慢性传染病之一，全世界病毒感染者约1．7～2亿。HCV为单链RNA病毒，一个开放读码框编码了3010个氨基酸的前体蛋白，在细胞和病毒蛋白酶共同作用下，前体蛋白被降解成结构蛋白和非结构蛋白两部分。结构蛋白包括核心蛋白（C）和膜蛋白（E1、E2）以及p7蛋白，非结构蛋白包括NS2、NS3、NS4A、NS4B、NSSA和NSSB。p7蛋白结构、功能仍然了解甚少。最近有研究发现p7蛋白可能是一个重要的病毒抑制靶点。     

丙型肝炎病毒NS5ab区的B细胞模拟表位的确认

目的：用噬菌体展示随机肽库研究丙型肝炎病毒(HCV)NS5ab区的B细胞表位。方法：在原核系统中表达了HCV NS5ab重组蛋白，亲和层析纯化血清中抗HCV NS5ab的特异多抗，用此多抗来筛选噬菌体递呈随机12肽库，获得HCV NS5ab区的B细胞表位。结果：成功地表达了HCV NS5ab重组蛋白，用此蛋白检验了130份HCV阳性血清，阳性率为36％。在筛选的噬菌体展示随机肽库后，挑取13个阳性克隆测序，有9个序列不同，最终通过噬菌体表位表达的方法确认了3个表位。结论：筛选噬菌体展示随机肽库研究HCV的B细胞模拟表位是可行的。     

CD81外显子6、7、8在中国人丙型肝炎病毒感染中单核苷酸多态性的研究

目的 探讨CD81在中国人丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV)感染中是否存在遗传易感性。方法 针对人和非洲绿猴的CD81有4个氨基酸位点（163、186、188、196）不同，而非洲绿猴不感染HCV，以正常人群和HCV感染阳性患者的基因组DNA为研究对象，用PCR结合DNA测序的方法对以上4个氨基酸对应的CD81基因位点进行分析。结果 在CD81外显子6、7、8没有发现单核苷酸多态性；尽管在一部分内含子6和3′端调控区发现了3个多态位点：11028G／T、11860C／T、11960G／A，但它们与HCV的感染无关（P＞0．05）。结论 未见CD81外显子6、7、8与HCV感染的易感性相关；由于CD81蛋白的其它位点在种间是高度保守的，因此在中国人群中CD81蛋白的多态性稀少或不存在。     

猴子抗病毒基因的演化起源探讨

据美国BIOCOMPARE科技新闻网（2008／3／28）报道，美国哈佛医学院的研究人员在亚州的猴子身上找到一个名为TRIM5-CypA的基因，能够对抗lentiviruses（此病毒纲的病毒也包含HIV病毒），此基因是由TRIM5以及CypA两个已存在的基因组合而来，这个组合体产出的蛋白能阻止与H1V极相关的病毒的感染。这是第二次，研究人员从猴子身上找到这个基因，第一次发现这个基因是在2004年，