人骨髓间质干细胞体外扩增和向成骨细胞分化的实验研究

骨髓间质干细胞（mesenchymal stem cell,MSCs）是一类存在于骨髓中的具有多向分化潜能的干细胞，在体外不仅可分化为间质类细胞，而且可以分化为非间质细胞。本研究探讨人骨髓间质干细胞的体外分离纯化、培养扩增和向成骨细胞诱导分化的条件。利用密度为1．073g/ml的Percoll分离骨髓的单个核细胞，以含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基培养与扩增MSCs，细胞纯度可达95％左右。取第二代和第三代的MSCs，以含有不同浓度的抗坏血酸、β－磷酸甘油、地塞米松的诱导培养基向成骨细胞诱导，诱导向的细胞呈现典型的成骨细胞样改变，免疫组化技术显示其I型胶原染色阳性，ALP染色阳性，表明MSCs在体外具有向成骨细胞分化的潜力。     

新生乳鼠视网膜细胞诱导骨髓间质干细胞向视网膜神经样细胞分化

目的：探讨体外培养的新生乳鼠视网膜细胞对骨髓间质干细胞的诱导分化作用。方法： 取成年Wistar大鼠股骨全骨髓细胞体外培养，经多次传代后获得高纯度的骨髓间质干细胞。以新生乳鼠视网膜细胞作诱导条件，采用分层共培养的方法诱导骨髓间质干细胞。倒置相差显微镜观察骨髓间质干细胞与新生乳鼠视网膜细胞共培养后形态的改变；免疫组织化学法检测诱导后的细胞巢蛋白(nestin)、神经丝蛋白(NF)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微丝微管相关蛋白-2(Map-2)、Thy 1.1、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)等特异性标记物的表达；RT-PCR进一步分析诱导后细胞表达nestin、NF、NSE、Thy 1.1及Ran等mRNA的情况。结果：新生乳鼠视网膜细胞作诱导剂，诱导48 h后可见部分细胞长出突起并向视网膜神经元特性样的细胞分化，最长可维持10 d。结论： 骨髓间质干细胞在体外培养的新生乳鼠视网膜细胞的诱导作用下可以向视网膜神经元样细胞分化。     

骨髓间质干细胞定向分化的实验研究

为了探讨体外定向诱导人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的机制,本研究将分离的人MSC进行体外扩增培养,并观察脑心舒定向诱导MSC分化为类神经元样细胞的效应。在光镜下观察细胞形态,用免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志。结果显示人MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。脑心舒诱导120min后大部分MSC转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、nestin呈阳性和GFAP阴性。上述结果提示人骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

人骨髓间质干细胞体外扩增和向内皮细胞定向诱导分化的研究

目的：体外分离、扩增成人骨髓间质干细胞（MSCs）和向内皮细胞（ECs）定向诱导分化，开辟心血管组织工程种子细胞的新来源。 方法： 采用Percoll(1 073 g/L)从正常成人骨髓中分离出MSCs，纯化和扩增后流式细胞仪鉴定其纯度；用血管内皮生长因子(VEGF)诱导MSCs向ECs分化，Ⅷ因子(vWF)免疫组化和透射电镜(TEM)鉴定细胞性质。 结果： 5.0×105个MSCs在体外扩增15代后，获得8.0×1012个MSCs，扩增了约1.6×107倍；MSCs在加入VEGF诱导培养大约14-21 d，80%-90%的诱导细胞对Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应；TEM可观察到胞浆内有Weible-palade小体，证实为ECs。 结论： 成人骨髓MSCs在体外具有定向诱导分化为ECs的潜能，这为心脏组织工程瓣体外构建, 尤其是在小儿先天性心脏病组织工程研究中种子细胞的来源提供了可能性。     

骨髓间质干细胞下调免疫反应的实验研究

目的：研究骨髓间质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）下调免疫反应的作用及其机制.方法：采用流式细胞分析（FCM）鉴定MSCs的纯度,用^3H-TdR掺入法测定MSCs对ConA刺激的淋巴细胞增殖的影响,利用RT-PCR和Real-time PCR检测TGF-β1、IL-8、IL-10的基因表达,同时进行皮肤移植模型研究.结果：MSCs对ConA刺激的淋巴细胞增殖的影响与MSCs和淋巴细胞的比值有关.RT-PCR结果显示MSCs对淋巴细胞分泌TGF-β1无显著性影响,而Real-time PCR的结果显示MSCs促进淋巴细胞分泌IL-10,减少淋巴细胞分泌IL-8.皮肤移植实验显示MSCs能延长异种移植皮肤的存活时间.结论：MSCs能下调免疫反应和抑制皮肤移植排斥反应,其可能的机制是通过促进淋巴细胞分泌IL-10以及减少淋巴细胞分泌IL-8来发挥作用.     

体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的实验研究

目的:采用5-氮胞苷(5-aza)诱导骨髓间充质干细胞(M SCs)为心肌样细胞,对比分析诱导细胞与正常心肌细胞表型的差异,从而分析5-aza的诱导效应。方法:分离培养大鼠骨髓M SCs,通过检测不同浓度的5-aza诱导后M SCs表面CD 45、CD 54、CD 90分子的表达并与正常心肌细胞表型进行比较,以观察5-aza对间充质干细胞体外分化诱导的影响和作用。结果:5-氮胞苷能有效地诱导间充质干细胞分化为心肌样细胞,诱导后的细胞表面均表达M H C和desm in分子。浓度为10μm ol/L的5-aza诱导组细胞表型更接近于心肌细胞。结论:M SCs在体外条件下经5-aza诱导可以分化为心肌样细胞,10μm ol/L的诱导浓度为最优浓度。     

PKH26标记大鼠骨髓间质干细胞的实验研究

目的建立PKH26标记大鼠骨髓间质干细胞（MSCs）的方法，并探讨标记MSCs的基本生物学活性。方法大鼠MSCs按PKH26标记程序进行标记后培养，采用激光共聚焦显微镜、流式细胞分析仪等观察细胞生长状态和荧光标记活性变化；应用RT-PCR检测标记后MSCs的GAPDH、nucleostemin及Bmi-1基因的表达；选用碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色及骨形成蛋白3（BMP3）基因表达分析等技术，观察标记后MSCs体外分化成骨细胞的特性。结果PKH26标记后细胞呈红色荧光，荧光的强度随着PKH26浓度的增加而递增，并与传代时间和代数相关；标记后细胞生长状态良好，基本生长特性如传代培养和生长曲线无明显改变；细胞GAPDH、nucleostemin及Bmi-1基因表达未见改变；标记MSCs诱导后ALP、Von Kossa染色阳性，呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征，并表达BMP3基因。结论PKH26可稳定标记大鼠骨髓MSCs并能传代培养，标记后细胞形态、生长活力及多向分化潜能等无明显影响，该技术可用于追踪MSCs转归、可塑性及干细胞移植方面的实验研究。     

骨髓间质干细胞降低大鼠移植物抗宿主反应的实验研究

目的 探讨MSCs对GVHD的作用及其机制.方法 建立大鼠同种异体骨髓移植模型,同时输入供者的T淋巴细胞诱导出移植物抗宿主反应,联合或不联合移植供体来源的MSCs,观察受鼠的生存时间,同时利用RT-PCR法研究Th1/Th2淋巴细胞亚群的比例,用ELISA法检测移植后体内IL-4细胞因子的浓度.结果 GVHD组的平均生存时间为(17.30±2.33)天,实验组的平均生存时间为(24.10±2.36)天 , 与单独移植HSCs相比,MSCs与HSCs共移植明显延长的受鼠的生存时间.同时,GVHD组Th1/Th 2 细胞比值为1.29±0.06,IL-4因子的浓度平均为(14.84±2.59) pg/mL,实验组Th1/Th 2细胞比值为(0.77±0.14),IL-4因子的浓度平均为(40.09±13.99) pg/mL.MSCs与 HSCs 共移植降低了体内Th1/Th2淋巴细胞亚群的比例,提高了体内IL-4细胞因子的浓度.结论 MSCs与HSCs共移植能有效抑制HSCs移植后致死性GVHD的发生,延长生存时间,同时MSCs 可能通过作用于体内Th1/Th2淋巴细胞亚群的比例,促进体内IL-4细胞因子的分泌从而间接发挥了抑制GVHD的作用.     

人胚胎干细胞HuES17向造血干细胞的分化

背景：人类胚胎干细胞是来源于着床前囊胚的内细胞团,能在长期培养中无限增殖并保持未分化状态,且具有分化成人体组织各种细胞类型能力的细胞。 目的：进一步验证人胚胎干细胞HuES17细胞株向造血干细胞分化的能力。 方法：人胚胎干细胞HuES17采用与人包皮成纤维细胞二维共培养的方式培养,采用人胚胎干细胞与小鼠骨髓基质细胞(OP9) 二维共培养的方法诱导胚胎干细胞向造血干细胞分化。 结果与结论：人胚胎干细胞与小鼠骨髓基质细胞(OP9) 二维共培养诱导造血分化的第四五天即开始出现OP9细胞逐渐老化,很快死亡;可以观察到人胚胎干细胞分化,然而,随着OP9细胞死亡,分化的人胚胎干细胞亦死亡,不能诱导人胚胎干细胞向造血干细胞分化。提示人胚胎干细胞HuES17细胞株可能不能向造血干细胞分化,或向造血干细胞分化的能力较低。     

骨髓间质干细胞体外分化为成骨细胞的实验研究

建立猪骨髓间质干细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)体外分离培养方法。对猪MSCs体外分化为成骨细胞的能力进行研究。抽取猪骨髓 ,体外培养MSCs。取第二代MSCs ,以含有不同浓度的抗坏血酸、β -磷酸甘油、地塞米松及碱性成纤维细胞生长因子等条件培养基进行成骨细胞诱导分化。通过细胞形态变化 ,碱性磷酸酶染色及钙盐沉积对成骨细胞进行鉴定。结果表明MSC细胞形态由长梭形向多边形转变 ,ALP染色阳性 ,VonKossa染色阳性 ,经体外诱导分化后呈典型的成骨细胞样改变。猪骨髓MSCs可在体外长期、稳定培养 ,具有向成骨细胞分化的潜能 ,可以为骨组织工程研究提供较理想的细胞来源和动物模型。     

微重力对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

骨髓间充质干细胞（BMSCs）是一种多能成体于细胞,是组织工程重要的种子细胞来源之一.微重力对BMSCs成骨分化具有抑制作用,可使骨量减少和骨微结构改变,从而导致骨质疏松症.这一过程受到多条信号通路的调控,如MAPK信号通路、Notch信号通路和Wnt/β-catenin信号通路等,它们协同调节微重力下BMSCs向成骨细胞方向的分化.研究微重力对BMSCs成骨分化的影响,可以阐明骨质流失机理,为相关疾病的治疗提供新的靶点,促进我国太空宇航事业的发展.     

骨髓间充质干细胞对致敏小鼠造血干/祖细胞移植植入的影响

目的: 前期的研究已经证实致敏小鼠造血干/祖细胞移植植入失败率高。本研究拟通过骨髓间充质干细胞(MSCs)进行干预,观察能否提高造血干、祖细胞移植的植入率。方法: 应用贴壁培养法体外培养正常小鼠骨髓MSCs,并分为6个实验组,包括实验组1:d11 MSCs干预的致敏组;实验组2: d0 MSCs干预的致敏组;实验组3:d11和d0 2次MSCs干预的致敏组;实验组4: 无MSCs干预的致敏小鼠对照组;实验组5:无MSCs干预的正常小鼠(非致敏小鼠)移植对照组;实验组6:无MSCs干预的正常小鼠不移植对照组。观察指标包括生存分析、移植效果分析(血象改变、骨髓细胞恢复及嵌合分析等)和移植物抗宿主病(GVHD)检测,最终评估MSCs干预对各实验组异基因造血干/祖细胞移植植入率的影响效果。结果: 与对照组(实验组4、5、6)比较,MSCs干预(实验组1、2、3)在2次异基因脾细胞注射法致敏的动物模型进行异基因造血干/祖细胞移植时,未能促进骨髓造血干/祖细胞移植的植入,也未能延长致敏动物移植后的生存时间。结论: 体内应用1×10⁶ MSCs干预,未能促进2次异基因1×10⁶ C57BL/6小鼠脾细胞输注法建立的重度致敏模型异基因造血干/祖细胞移植的植入。     

骨髓间充质干细胞及其向肝样细胞分化的潜能

背景：研究表明,在一定条件下骨髓间充质干细胞可诱导分化为肝样细胞,为治疗急性肝衰竭等终末期肝病提供了新的思路。 目的：对骨髓间充质干细胞的发现、分离培养、诱导分化及应用前景等方面做一综述。 方法：计算机检索中国期刊网全文数据库以及PubMed数据库1999至2014年期间有关骨髓间充质干细胞及其向肝样细胞分化的文章。检索词分别为“肝样细胞,骨髓间充质干细胞,细胞分化”和“hepatocyte-like cells,bone marrow mesenchymal stem cells,differentiation”。最后选择52篇文章纳入结果分析。 结果与结论：目前,肝组织工程的首要问题是寻找性状稳定具有肝特异性功能的种子细胞,成熟肝细胞获取难度较大,并具有产生免疫排斥反应、体外培养困难等缺陷,严重限制了肝移植的开展。骨髓间充质干细胞具有多向分化、自我更新快、易于扩增及培养等优点,被认为是最有前途的细胞来源。已有研究表明骨髓间充质干细胞在体内外均可分化为肝细胞,并具有肝细胞的合成和分泌功能。但如何大量扩增此类细胞的同时又能保持其良好的分化潜能、体外培养的最佳条件、诱导分化机制和临床应用的安全性等尚需进一步研究和探讨。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

microRNA-1诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的研究microRNA-1(miRNA-1)能否诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化。方法构建大鼠miRNA-1表达载体,分离扩增培养及鉴定大鼠MSCs。脂质体法转染大鼠第4代MSCs,实时定量RT-PCR(qRT-PCR)检测转染miRNA-1质粒后MSCs的miRNA-1表达水平。分别于转染2、4和6 d后用RT-PCR检测心肌重要转录因子GATA4、NKx2.5和MEF2C的mRNA表达,免疫荧光检测心肌特异蛋白I(cTnI)的表达。结果 90%以上的MSCs表达MSCs重要标志物CD29、CD44;未检测到造血前体细胞标志抗原CD34、白细胞标志抗原CD45的表达。转染miRNA-1质粒后,miRNA-1表达水平明显上调。转染miRNA-1质粒2、4和6 d后,GATA4、NKx2.5和MEF2C的mRNA表达逐渐增强。第4和6天后可见cTnI阳性表达细胞。结论 miRNA-1能诱导大鼠MSCs向心肌样细胞分化。     

聚乙烯亚胺-蛋白纳米复合体转染蛋白进入骨髓间充质干细胞的应用研究

目的:探索纳米材料聚乙烯亚胺(PEI)携载不同分子量的蛋白质转染进人骨髓间充质干细胞(h BMSCs)的作用及优化其最佳配比条件。方法:利用物理化学作用构建6组PEI-DNase I(DNA酶I)复合体,运用激光散射技术初步摸索其最佳摩尔比,用透射电镜直观复原纳米-蛋白复合体外貌;同时,原代分离培养健康人的骨髓间充质干细胞并进行体外扩增,通过构建成功的4组PEI-GFP(绿色荧光蛋白)纳米蛋白复合体对h BMSCs进行转染,共聚焦荧光显微镜下观察荧光表达情况,再通过MTT法检测该复合体对细胞增殖的毒性影响,并用β-半乳糖苷酶实验验证其转入蛋白的活性表现。结果:当PEI与蛋白质的摩尔比为4∶1时,形成的复合体转染效率最高,β-半乳糖苷酶实验细胞染色变蓝。结论:PEI能与蛋白质形成纳米复合体,并能转染多种蛋白质进入人骨髓间充质干细胞,所转染的蛋白质分子仍具有活性,为细胞重编程技术提供了新途径。     

Zfp521在大鼠骨髓间充质干细胞向神经元分化过程中的表达变化及意义

目的: 探讨锌指蛋白521(Zfp521)在大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元过程中的表达变化及意义。方法: 体外培养大鼠MSCs,实验分为未转染组、转染组(转染Rn-Zfp521-siRNA)和阴性对照组(转染negative control siRNA),采用β-巯基乙醇诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元。倒置荧光显微镜下观察MSCs转染后荧光表达情况。采用免疫细胞化学法、RT-PCR法及Western blotting法检测诱导后神经元特异性烯醇化酶(NSE)和微管相关蛋白2(MAP-2)的表达情况及诱导前、后Zfp521的表达变化。结果: (1)siRNA转染72 h荧光表达最强,转染率可达84.1%±2.3%,转染组骨髓间充质干细胞的Zfp521 mRNA表达下降(P<0.05);(2)β-巯基乙醇可以诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元,以转染组诱导效果最佳,NSE和MAP-2表达显著高于其它各组(P<0.05);(3)Zfp521在各组细胞中均有表达,诱导后Zfp521表达明显低于诱导前(P<0.01)。结论: Zfp521在大鼠骨髓间充质干细胞神经分化中表达下降,抑制Zfp521表达可促进神经元的分化,提示Zfp521在骨髓间充质干细胞的神经分化中可能发挥重要调控作用。     

骨髓间充质干细胞向雪旺细胞诱导分化方法的研究进展

细胞移植技术治疗周围神经损伤已成为新兴的组织工程学研究热点。骨髓间充质干细胞(BMSCs),由于其具有扩增快、便于分离提纯、可以体外诱导分化成为雪旺细胞(SC)的特性,有可能成为雪旺细胞的有效替代品和组织T程化神经的新型种子细胞。就种子细胞雪旺细胞和骨髓间充质干细胞的生理功能、生物学特性、体外诱导骨髓间充质干细胞生成雪...     

Caveolin-1在大鼠骨髓间质干细胞分化为神经细胞中的作用

目的:探讨caveolin-1在骨髓间质干细胞(MSCs)分化为神经细胞中的作用。方法:实验分为未转染组、转染组(转染Rn-caveolin-1-siRNA)、阳性对照组(转染Rn-MAPK-1control siRNA)及阴性对照组(转染negative control siRNA)4组。采用β-巯基乙醇诱导大鼠MSCs分化为神经细胞。倒置荧光显微镜下观察MSCs转染后荧光表达情况;RT-PCR检测caveolin-1和促分裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)mRNA的表达变化;免疫细胞化学法检测caveolin-1、神经元烯醇化酶(NSE)、神经微丝亚单位(NF-M)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达变化;MTT方法检测细胞存活率。结果:(1)siRNA转染72h,MSCs荧光表达最强,转染率可达(81.5±2.8)%;而且转染组MSCs的caveolin-1mRNA转录下降(P0.05);MTT提示转染组细胞存活率无显著变化(P0.05)。(2)β-巯基乙醇可以诱导MSCs向神经细胞分化,其中以转染组诱导效果最佳,NSE、NF-M的表达率显著高于其它各组(P0.01)。(3)随诱导时间延长,各组caveolin-1表达持续增加,诱导6d达到峰值,与诱导前、诱导6h相比有显著差异(P0.05)。此外,转染组与其它各组同时点的caveolin-1表达均显著降低(P0.01)。结论:以caveolin-1为标记蛋白的脂筏在MSCs诱导分化为神经细胞中可能起到重要的调控作用。     

正弦交变电磁场促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨性分化的研究

研究50 Hz不同强度正弦交变电磁场(SEMFs)对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)增殖与成骨性分化的影响,筛选出最佳磁场强度参数。采用贴壁筛选法培养原代rBMSCs,每天在频率为50 Hz,强度分别为0、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 mT的磁场环境中处理30 min。MTT法检测细胞增殖情况;于处理后的第3、6、9、12 d分别测定细胞碱性磷酸酶活性、钙盐沉积量、钙化结节数以及Ⅰ型胶原表达量,并比较各组间差异;于处理后6、12、24、48 h分别提取细胞总RNA,用RT Real-Time PCR法检测成骨性分化相关基因Osterix和IGF-1表达情况。实验结果显示电磁场干预组的细胞增殖率均低于对照组;但1.4~2.2 mT区间的磁场具有促成骨效应,以1.8 mT促进rBMSCs的成骨性分化更明显,表现在该组的碱性磷酸酶活性、钙盐沉积量、钙化结节数、Ⅰ型胶原表达量以及成骨性分化基因的表达量最高,亦显著高于对照组(P<0.05)。由此可以认为频率为50 Hz、强度范围在1.4~2.2 mT内的SEMFs抑制rBMSCs的增殖;但促进其成骨性分化,以1.8 mT效果最为明显。     

Oct3/4在体外诱导大鼠骨髓间质干细胞神经分化中的作用

目的: 探讨Oct3/4在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元中的作用。方法: 构建大鼠 Oct3/4慢病毒载体(Oct3/4 -LV)并感染大鼠MSCs;实验分为感染组(感染 Oct3/4 -LV)、阴性对照组(感染FU-PGC-NC-LV)和未感染组3组;采用β-巯基乙醇诱导各组大鼠MSCs分化为神经元。倒置荧光显微镜下观察MSCs感染后形态学变化;MTT法检测细胞存活率;免疫细胞化学法检测神经元烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白 2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP) 和Oct3/4的表达变化;Western blotting法检测MAP-2和Oct3/4蛋白的表达变化;RT-PCR法检测MAP-2和Oct3/4 mRNA的表达变化。结果: (1)阳性克隆PCR证明大鼠 Oct3/4 慢病毒载体构建成功,孔稀释法测定病毒滴度为2×10¹¹ TU/L。(2)倒置显微镜下观察大鼠 Oct3/4 慢病毒载体感染成功,感染复数(MOI)值为10,感染48 h时感染率最高,荧光表达最强;感染率可达83.4%±2.2%。感染组中,MSCs形态发生变化;MTT提示感染组细胞存活率显著降低(P<0.05)。(3)β-巯基乙醇可以诱导大鼠MSCs向神经元分化,其中以感染组诱导效果最佳,具有比较典型的神经元形态,NSE和MAP-2的表达率与其它各组相比显著增高(P<0.05)。(4)感染组与其它各组同时点的Oct3/4表达相比均显著增高(P<0.01)。并且随着诱导时间的延长,各组Oct3/4表达持续减少,诱导后5 h与诱导前相比存在显著差异(P<0.05)。结论: Oct3/4在大鼠MSCs分化为神经元的过程中可能起到了重要的调控作用。