建立于PCR基础上的基因突变检测技术进展

建立于ＰＣＲ基础上的基因突变检测技术进展王亮综述吴审阅遗传病和恶性肿瘤都是由于遗传物质改变引起的基因病，过去由于研究基因的技术极为复杂，严重阻碍了基因病分子机制的研究，限制了这一技术的普及和推广。自从ＰＣＲ技术问世以来，建立于ＰＣＲ基础上的突变检测技...     

一种快速简便的定点突变方法

目的 探索一种快速简便的定点突变方法。方法 应用一步反向PCR方法,分别对鼠抗人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)单克隆抗体重、轻链可变区基因进行定点突变。结果 成功地将鼠抗hTNF-α抗体重链可变区88位Ser突变为Ala、轻链可变区17位Glu 18位Lys分别突变为Asp和Arg。结论 此种定点突变方法操作简便、突变效率高,整个操作过程不需亚克隆、不需酶切。     

一种鉴定重组子的快速简便方法

外源ＤＮＡ与质粒ＤＮＡ连接产生大量待鉴定的重组子。目前一般采用常规碱裂解法或煮沸法小量提取质粒ＤＮＡ后 ,酶切鉴定〔1,2〕。或者用菌落ＰＣＲ法鉴定重组子〔3〕。酶切鉴定要求质粒ＤＮＡ质量较高 ,且要求量较大 ,菌落ＰＣＲ由于菌量较少 ,常会出现丢失菌落情况。对于质粒ＤＮＡ小量制备 ,目前常采用常规的碱裂解法和煮沸法 ,前者操作步骤多 ,较繁锁 ,后者在加热裂解时可释放相对大量的糖类 ,很难避免质粒ＤＮＡ内污染有糖类 ,而糖类可抑制多种限制酶的活性。另外煮沸不能完全灭活内切核酸酶Ａ ,在Ｍｇ2 + 存在下温育时质粒ＤＮＡ会被…     

一种BRAF基因突变检测方法的建立

目的 建立一种适用于临床样品检测的BRAF基因V600E突变的检测方法.方法 利用已知BRAF基因野生型、突变型样品,以BRAF基因15外显子V600E突变为靶位点设计特异性扩增引物和测序引物,建立BRAF基因V600E突变的SYRB Green PCR-Sanger测序检测方法,并对该方法进行方法学评价和21例结直肠癌临床样品检测.结果 成功建立了BRAF基因V600E突变SYRB GreenPCR-Sanger测序检测方法,该方法的灵敏度达5.0×101拷贝/ul,检测线性范围5×101～ 5×107拷贝/ul,且检测的重复性好.检测21例结直肠癌临床样品,突变率为9.5％(2/21).结论 成功建立了BRAF基因V600E突变SYRB Green PCR-Sanger测序检测方法,该方法可用于临床样品的检测.     

SmaRT——一种简便,有效的PCR产物直接克隆技术

ＳｍａＲＴ──一种简便、有效的ＰＣＲ产物直接克隆技术宋莉，李明月，张秀清，但美霞，刘国仰，杨焕明（中国医学科学院基础医学研究所，中国协和医科大学基础医学院医学遗传室，北京１００００５）ＰＣＲ已成为医学与生物学、特别是医学遗传学领域中最重要的技术。在序...     

PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体及其功能的研究

目的 :用PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL 39基因突变体 ,并比较研究FALL 39及其突变肽的功能。方法 :采用PCR体外定点突变技术 (PCR SDM ) ,设计一对方向相反的引物 ,其中一个引物引入一个突变点 ,应用高保真的PolybestDNA多聚酶进行含FALL 39肽的PGEXλ1T质粒的PCR扩增 ,使FALL 39第 2 2位密码子由CAG突变为AAG ,将扩增片段自身连接后克隆入工程菌JM1 0 9中使其表达其突变肽 (FALL 39 lys2 2 ) ,纯化后与FALL 39进行抗菌活性比较。结果 :DNA测序结果表明在预期位点发生突变 ,突变后FALL 39 lys2 2抗菌活性…     

PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体及其功能的研究

目的 :用PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL - 39基因突变体 ,并比较研究FALL - 39及其突变肽的功能。方法 :采用PCR体外定点突变技术 (PCR -SDM) ,设计一对方向相反的引物 ,其中一个引物引入一个突变点 ,应用高保真的PolybestDNA多聚酶进行含FALL - 39肽的PGEXλ1T质粒的PCR扩增 ,使FALL - 39第 2 2位密码子由CAG突变为AAG ,将扩增片段自身连接后克隆入工程菌JM10 9中使其表达其突变肽 (FALL - 39-lys2 2 ) ,纯化后与FALL - 39进行抗菌活性比较。结果 :DNA测序结果表明在预期位点发生突变 ,突变后FALL - 39-lys2 2…     

一种快速,简便的PCR产物直接银染测序法

一种快速、简便的ＰＣＲ产物直接银染测序法何友吉李明发鲁晓萱单祥年ＤＮＡ序列分析作为一种常规技术手段已在分子生物学、生物化学、分子遗传学等领域得到了广泛的应用。但多数实验室对测序反应产物的检测是采用放射自显影法，而测序模板大多采用将ＤＮＡ克隆到载体内的...     

PCR标记系统——一种高效快速的DNA标记方法

利用探针片段一般都插入到半乳糖操纵子基因（LacZα）中间的特点，选取合适的引物建立的PCR标记系统，可以以微量的质粒为模板，直接进行DNA探针的放射与非放射标记。具有模板用量少（10－100pg）、快速（2-3小时）、高效和标记后探针完整的特点，其产物的放射比活性可高达5×109／μ，远高于缺口平移（nicktranslation）和随机引物延长（randompriming）等方法所能达到的效果。     

基于PCR的体外诱变技术

定点突变技术是蛋白质工程中应用的重要技术之一,可以有目的改变DNA序列中的碱基。它不仅可以阐明基因表达的调控机理,还可用研究蛋白质结构与功能间的关系,改造天然蛋白质,使之更符合应用需求。自从PCR技术发明以来,便被用于进行定点突变。综述了各种基于PCR技术的定点突变方法,并与其他定点突变方法进行对比。     

A rapid and highly efficient method for PCR-based site-directed mutagenesis using only one new primer

We present a rapid, cheap and highly efficient method for site-directed mutagenesis using the polymerase chain reaction (PCR). This method is applicable to every DNA fragment which has to be cloned into the multiple cloning site of any vector, or vector pair, in two different orientations. It requires only two primers, one new and specific mutagenic primer and one of the usual sequencing primers. In the first PCR, a mutagenic DNA fragment is synthesized which is amplified exponentially in the second PCR. In contrast, wild-type sequences are only linearly amplified resulting in an efficiency of mutagenesis of nearly 100%.     

血型基因检测对照品的制备及其在三种稀有血型筛选中的应用

目的 应用基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)的基因定点诱变技术(sitedirected mutagenesis,SDM)制备s、Oka血型等位基因检测对照品.用多重聚合酶链反应(multiplex PCR)技术建立3种血型Fy2、s和Ok2的基因分型方法,以了解这3种血型在中国随机献血者中的多态性分布状况.方法 采用基于PCR的基因定点诱变技术对s和Oka血型等位基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点构建了含有突变SNP位点(GYPB基因cDNA 153位C/T突变和BSG基因cDNA 274位G/A突变)的标准质粒,作为s和Oka血型等位基因检测的对照品.同时针对血型抗原Fya、s和Oka等位基因的SNP位点设计序列特异性(sequence specific primer,SSP)引物,构建多重PCR体系,对438份随机献血者样本进行Fya、s和Oka血型抗原的基因筛选.结果 成功应用定点诱变技术完成了s和Oka基因检测中等位基因对照品的制备,并建立了可同时检测Fya、s和Oka血型的多重PCR体系,438份随机献血者样本中共检出2例Fy(a-)样本,未检出s-和Ok(a-)样本.结论 基于PCR的基因定点诱变技术能够得到难以获得的血型基因检测等位基因对照品,用于验证基因分型方法.本实验建立的多重PCR体系是一种有效的进行Fya、s和Oka血型基因检测的方法.     

Activity after site-directed mutagenesis of CD59 on complement-mediated cytolysis

CD59 may inhibit the cytolytic activity of complement by binding to C8/C9 and protect host cell membranes against homologous membrane attack complex （MAC）. However, CD59 is widely overexpressed on tumor cells, which has been implicated in tumorigenesis. The active site of CD59 relative to MAC is still confused. As reported the MAC binding site is located in the vicinity of a hydrophobic groove on the membrane distal face of the protein centered around residue W40. Here two site-directed mutagenesis were performed by overlapping extension PCR to delete residue W40 site （Mutant 1, M1） or to change C39W40K41 to W39W40W41 （Mutant 2, M2）. Then we constructed mutant CD59 eukaryotic expression system and investigated their biological function on CI-IO cells compared with wild-type CD59. Stable populations of CHO cells expressing recombinant proteins were screened by immunotechnique. After 30 passages culturing, proteins could be tested. Dye release assays suggest that M1CD59 loses the activity against complement, while M2CD59 increases the anti-complement activity slightly. Results indicate that W40 of human CD59 is important to its activity, and prohibition of this site may be a potential way to increase complement activity and to treat tumors. Cellular ＆ Molecular Immunology.     

突变型人PRKAG2基因的克隆及其表达载体构建

目的构建含有定点突变的人PRKAG2基因表达载体。方法首先应用Trizol法抽提健康人全血mRNA,通过实时聚合酶链反应(RT-PCR)克隆得到野生型人PRKAG2 cDNA;继而通过聚合酶链反应(PCR)定点突变的方法获得突变型人PRKAG2基因,命名为G100S,最后应用酶切连接的方法得到重组载体pEGFP-G100S。结果Trizol法提取人细胞mRNA,经RT-PCR合成cDNA第一条链,特异性引物PCR扩增得到PRKAG2基因片段,目的片段条带在1 761 bp左右。分段克隆得到的G100S片段分别为300 bp与1 500 bp左右。转化Top10感受态细菌,PCR筛选阳性菌落5个克隆有3个克隆可见1 800 bp左右的阳性片段,筛选得到pEGFP-G100S重组阳性克隆。测序证实重组载体pEGFP-G100S构建成功。结论构建的含定点突变人PRKAG2基因重组载体pEGFP-G100S为进一步研究基因PRKAG2 G100S突变的功能奠定了基础。     

人白细胞介素-3突变体的构建及在大肠杆菌中表达的研究

目的：为了在大肠杆菌中高效表达ｈＩＬ－３ｃＤＮＡ,获得ｈＩＬ－３蛋白,拟对天然型ｈＩＬ－３进行构建以获得新的突变体,同时进行了活性测定,以便深入了解ｈＩＬ－３的结构与功能之间的关系。方法：利用ＰＣＲ技术对天然型ｈＩＬ－３ Ｎ末端第３位蛋氨酸（Ｍｅｔ３）和Ｃ末端第１７位蛋氨酸（Ｌｙｓ１１６）进行定点突变,获得突变体ＭｈＩＬ－３和ＭＶｈＩＬ－３。结果：经Ｓｕｇｅｒ双脱氧法测序证实突变体ＭｈＩＬ－３ｃＤ     

Expression of cloned envelope protein genes from the flavivirus tick-borne encephalitis virus in mammalian cells and random mutagenesis by PCR

The structural membrane proteins prM and E of the flavivirus tick-borne encephalitis (TBE) virus were expressed in mammalian cells for the purpose of probing the structure and molecular interactions of these proteins. Advantage was taken of the natural error frequency of the Taq polymerase used in the PCR amplification to generate a randomly mutated population of genes that were then cloned directly into plasmid expression vectors under the control of an SV40 promoter. Analysis of the mutation frequency by direct sequencing of 22 separate clones showed that the PCR produced mutations at a rate yielding an average of one to two amino acid changes per clone in the 496 amino acid long protein E. This is an ideal rate for assessing the importance of individual amino acid residues within protein domains, thus demonstrating the potential value of the PCR as a random mutagenesis method. Clones encoding wild-type prM and E proteins, and a truncated form of E, were also constructed by recombining portions of selected PCR clones. Transfection of COS-1 cells with these constructs resulted in expression of the prM and E proteins, which was demonstrated by indirect immunofluorescence using monoclonal antibodies (Mabs). The intracellular level of TBE virus antigen, measured in lysates of transfected cells by ELISA, reached approximately 25% of that found in virusinfected COS cells. Furthermore, it was shown by immunofluoresence using a panel of 19 anti-E Mabs that the antigenic structure of the expressed E proteins was nearly identical to that of E protein in infected cells, thus confirming the suitability of this model system as a tool for studying flavivirus protein structure.     

一种简易的HIV-1病毒载量定量筛查方法的建立

目的 建立一种基于RT-PCR法的简易的HIV-1感染者或艾滋病患者血浆病毒载量筛查方法.方法 在广西南宁市采集18例HIV-1感染者和18例阴性对照者血液标本,提取RNA,以引物LTR-1/LTR-2对待测样本进行PCR扩增,获得Ct值.同时,应用Nuclisens EasyQ HIV-1 v1.2法作为对照对这些样本进行病毒载量检测.对Ct值与病毒载量之间进行相关性分析,获得相应的回归方程.结果 待测样本中HIV-1感染者Ct值在29.103～31.610个循环之间,阴性对照者未能扩增出产物.RT-PCR法Ct值与Nuclisens EasyQ HIV-1 v1.2法检测出的病毒载量对数值之间具有良好的线性关系（r=-0.51,P=0.03）,回归方程为logY（viral road）=57.55-1.56＆#215;（Ct value）.结论 所建立的HIV-1病毒载量RT-PCR检测方法操作简单,价格便宜,与商业化试剂盒具有较好的一致性,可用于HIV-1感染定量筛查.