表达不同氨基端二级结构HCVNS3/4A点突变质粒的构建及在Huh7细胞中的表达

目的 构建表达不同氨基端二级结构HCVNS3/4A的点突变质粒,并在Huh7细胞中进行表达.方法 以pSG5/M-H05-5/4A为模板(A1-1),根据分型标准设计点突变引物.首先构建4个单点突变质粒:pSG5/M-H05-5(A1-2)/4A(A1-2)(Y56F),pSG5/M-H05-5(B1-1)/4A(B1-1)(L80Q),pSG5/M-H05-5(B2-1)/4A(B2-1)(v5IA),pSG5/M-H05-5(B2-2)/4A(B2-2)(S61A).然后,分别以A1-2,B2-1,B2-2为模板,再将第80位的赖氨酸点突变为谷氨酸(L80Q),构建另外3个双点突变质粒:pSG5/M.H05-5(B1-2)/4A(B1-2),pSG5/M-H05-5(A2-1)/4A(A2-1)和pSG5/M-H05-5(A2-2)/4A(A2-2).每个质粒均进行序列测定验证点突变成功.用FuGene 6转染试剂将构建物转染入Huh7细胞,并应用间接免疫荧光试验和Western blotting检测构建物的表达.结果 免疫荧光实验检测到NS3的4种亚细胞定位方式:点状,弥漫样,面包圈样,及短棒状.WesternBlotting亦显示构建物均成功表达,同时发现A2-1和B2-1亚型NS3/4A存在不完全切割现象.表明与其他亚型相比,A2-1和B2-1 NS3 in cis 丝氨酸蛋白酶活性较弱.结论 成功构建表达不同氨基端二级结构HCVNS3/4A点突变质粒,为抗不同亚型HCV的深入研究提供基础.     

与登革病毒NS4A蛋白相互作用的宿主蛋白的鉴定

目的 鉴定与登革病毒NS4A蛋白发生相互作用的宿主蛋白.方法 利用串联亲和纯化系统(TAP)纯化分离与NS4A相互作用的蛋白,进行质谱分析,鉴定可能与NS4A相互作用的蛋白;构建其真核表达质粒,通过蛋白免疫共沉淀技术验证其相互作用.结果 质谱结果表明α磷酸烯醇酶(Eno-1)可能与登革病毒的NS4A存在相互作用,在pSG5载体中构建了C端带FLAG标签的pSG5-Eno-1-FLAG重组质粒,并检测到其真核表达.共表达pSG5-Eno-1-FLAG和pSG5-NS4A-HA重组质粒,双向蛋白免疫共沉淀实验进一步证实了Eno-1是与NS4A相互作用的宿主蛋白.结论 宿主蛋白Eno-1与登革病毒NS4A存在相互作用,为进一步阐明NS4A在登革病毒复制过程中的调控机制奠定了基础.     

丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂高通量筛选模型的建立及应用

目的 应用荧光共振能量转移(FRET)法检测丙型肝炎病毒(HCV)丝氨酸蛋白水解酶(NS3 - 4A)活性,建立HCV蛋白酶抑制剂筛选模型.方法 将质粒pMAL-c2/NS3 - 4A转化到大肠杆菌K12TB1中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,亲和层析柱纯化得到麦芽糖结合的NS3 - 4A融合蛋白,用FRET法测定蛋白水解酶活性,建立特异性蛋白酶抑制剂筛选模型,优化反应体系,评价模型的可靠性.结果 建立了HCV蛋白酶抑制剂高通量筛选模型,经优化确定了酶及底物用量.在模型可靠性评价中,Z因子高达0.80,变异系数为1.91%.蛋白酶的Km值为4.74 μmol/L,测得已知HCV蛋白酶抑制剂BILN 2061的Ki值为0.30 nmol/L.结论 建立的HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂FRET法筛选模型稳定可靠,适用于高通量筛选.     

稳定表达丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶的HepG2细胞克隆的建立

目的：构建丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶（scNS4A／NS3）的真核表达载体;建立重组质粒稳定转染的HepG2细胞克隆．方法：根据文献报道设计扩增scNS4A／NS3编码基因的引物,从HCV阳性患者血清中提取病毒RNA,RT-PCR方法扩增出scNS4A／NS3基因片段,BamH Ⅰ／HindⅢ双酶切后连接到经同样酶切的真核表达载体pcDNA3,1（-）,转化菌株JM109感受态细胞,获得重组质粒pcDNA3．1（-）～scNS4A／NS3,经酶切鉴定及序列测定．将阳性重组质粒用脂质体法转染HepG2细胞,经持续G418压力选择和克隆化获得稳定转染的细胞系,用RT-PCR,IFA,Western-blot证实该稳定细胞系可以表达单链丝氨酸蛋白．结果：成功构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-scNS4A／NS3;建立了稳定转染的HepG2细胞克隆,命名为scpHepG2．结论：获得稳定的scpHepG2细胞克隆可表达单链丝氨酸蛋白,为下一步建立以细胞为基础的评价抗HCV丝氨酸蛋白酶药物系统奠定基础．     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活SV40病毒早期启动子的研究

目的：探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A的反式激活作用。方法：扩增HCV NS5A基因，构建HCV NS5A基因真核表达载体pcDNA3．1(-)—NS5A；并转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，免疫印迹方法检测转染细胞中HCV NS5A蛋白的瞬时表达；与报告质粒pCAT3--promoter共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果：质粒pcDNA3．1(-)—NS5A在HepG2细胞瞬时表达HCV NS5A蛋白，共转染实验中pcDNA3．1(-)—NS5A组的CAT表达活性是空质粒对照组的3．8倍。结论：构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS5A蛋白反式激活的靶基因，深入阐明HCV NS5A蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供依据。     

1,25-二羟维生素D_3抑制报导载体pGL_2荧光素酶表达的研究

通过磷酸钙沉淀法将载体DNA转染Caco－2细胞。Caeo－2细胞经不同浓度1,25一二羟维生素D3处理后,测定表达的荧光素酶活性。结果;当pSG5－VDR表达载体共转染时1,25一二羟维生素D3显著地抑制Caco－2细胞荧光素酶的表达;而未使用pSG5－VDR表达载体共转染时,则无抑制作用。说明1,25一二羟维生素D3能抑制报导载体pGL2荧光素酶的表达。类似于人类PTH基因中的潜在抑制性VDRE存在于报导载体pGL2。     

抑制丙型肝炎病毒 NS5A基因表达的shRNA系统的构建及意义

目的：构建抑制丙型肝炎病毒 NS5A基因(HCV NS5A)表达的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体系统,观察其对HCV NS5A蛋白表达的抑制作用。方法：根据HCV NS5A基因已知序列,设计3段19个碱基的HCV NS5A特异性靶序列,合成两对63 bp并含有编码shRNA序列的寡核苷酸,双链退火后,克隆到经过BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后线性的pSilencer^TM 3.1-H1neo载体的H1启动子下游,重组构建RNA干扰(RNAi)质粒,进行电泳,将3个不同的RNAi质粒和阴性对照质粒分别与HCV NS5A真核表达质粒共转染正常肝细胞HL-7702细胞系,用Western  blotting印迹法鉴定 NS5A蛋白表达。结果：对重新构建的pSilencer^TM3.1-H1neoHCV  NS5A- R1、R2、R3质粒进行测序,与设计的序列完全相同;3个质粒电泳均在4　348 bp处出现特异性条带;Western blotting印迹法测得R1、R2和R3的 NS5A蛋白未见明显条带,阴性对照质粒 NS5A蛋白在相对分子质量5　600处出现条带。结论：设计合成的3个不同位点的63个碱基均成功插入到预计位点,并且序列完全正确,对HCV NS5A基因表达有特异性抑制作用。     

ERR1突变体K244A对其转录活化功能的影响

目的分析ERR1突变体K244A对ERR1转录活化功能的影响。方法用重叠延伸PCR构建ERR1的缺失突变体ERR1/K244A到表达质粒pSG5上．通过荧光素酶报告基因表达系统检测ERR1 K244A对ERR1转录活化功能的影响结果测序证实成功构建了ERR1的突变体pSG5/ERR1／K244A。报告基因表达系统检测显示ERR1 K244A激活的荧光素酶报告基因活性明显低于野生型的ERR1。结论ERR1突变体ERR1 K244A转录活化功能明显低于野生型的ERR1．为进一步研究ERR1的结柏与功能打下了基础．     

CYP3A4基因启动子受AFB1调控位点的鉴定

目的 构建不同长度人CYP3A4基因启动子荧光素酶报告质粒并予鉴定,检测L02细胞中各荧光素酶报告质粒相对荧光素酶活性,并分析AFB1处理对其影响,找出AFB1调控人CYP3A4基因可能的启动子区域.方法 采用PCR技术扩增不同长度人CYP3A4基因启动子片段,将其插入荧光素酶报告质粒pGL3-basic中荧光素酶编码序列之前,构建含不同长度CYP3A4启动子的报告质粒pGL3-basic-CYP3A4-1～7,将报告质粒转染L02细胞,检测其荧光素酶活性来表示CYP3A4对应启动子片段的转录活性.检测各报告质粒在AFB1处理下与DMSO对照相比荧光素酶活性上升的比例,找出AFB1上调CYP3A4启动子转录活性的作用区域.结果 报告质粒测序结果证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功.将报告质粒转染L02细胞,AFB1和DMSO处理后检测结果表明pGL3-basic-CYP3A4-1～6和pGL3-basic-CYP3A4-7相对荧光素酶活性受AFB1上升比率差异有统计学意义(P＜0.05),pGL3-basic-CYP3A4-1至pGL3-basic-CYP3A4-6这6个报告质粒相对荧光素酶活性受AFB1上升比率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功构建了人CYP3A4基因不同长度启动子片段的荧光素酶报告质粒,并初步确定AFB1可以通过调控CYP3A4启动子-200～0 nt的结合位点来上调CYP3A4的转录活性.     

酶联免疫吸附试验检测HCV NS3-4A蛋白酶活性

目的 建立一种检测丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ３－４Ａ丝氨酸蛋白酶的酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）方法,用于筛选ＨＣＶ蛋白酶抑制剂。方法 将闰ｐＭＡＬ－ｃ２／ＮＳ３－４Ａ转化到大肠杆菌Ｋ１２ＴＢ１中,经ＩＰＴＧ诱导表达,亲和层析柱纯化后得到麦芽糖结合的ＮＳ３／ＮＳ３－４Ａ融合蛋白,用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析其免疫学活性,并以酶联免疫吸附试验检测其生物学活性。结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析并用考马     

丙型肝炎治疗新药替拉瑞韦

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）是一种高度变异的正链RNA黄病毒,具有慢性转化率高、病变率高等特征。有研究表明,NS3/NS4A多功能蛋白酶是HCV复制所必须的,因而NS3/NS4A蛋白酶抑制剂在HCV治疗中的意义备受关注。替拉瑞韦（Telaprevir）是一种可逆的HCV NS3/NS4A蛋白酶抑制剂,动物试验和临床试验都表明它可以有效地直接攻击HCV并阻断其复制,对HCV的抑制作用持久,将成为丙型肝炎病毒的新型治疗药物。     

慢性乙型肝炎患者的基线丙氨酸氨基转移酶水平与抗病毒疗效的关系

目的分析恩替卡韦与α干扰素在不同基线丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平治疗48周后的疗效,为临床慢性乙型肝炎（CHB） 抗病毒治疗提供参考依据。方法回顾性分析369例CHB患者的资料,根据治疗方案及基线ALT水平分组,分析治疗48周后不 同治疗方案、不同基线ALT水平的病毒学应答率、HBeAg转阴率、HBsAg下降情况,评估治疗效果。结果①病毒学应答情况： 治疗48周后恩替卡韦组在基线ALT≤5倍正常值上限（ULN）（组1）、5~10×ULN（组2）、>10×ULN（组3）的病毒学应答率分别为 83.3%、91.4%、95.5%,α干扰素组则分别为19.7%,40%,42.9%,不同治疗方案之间及不同ALT水平组之间对比差异均有统计学 意义（P<0.05）。②HBeAg转阴情况：恩替卡韦组的组1、组2、组3在治疗48周后的HBeAg转阴率分别为8.3%、16.7%、35.5%, 而α干扰素组分别为1.8%、41.9%、38.1%,对比同一治疗方案不同ALT分组,差异具有统计学意义（P<0.05）,而分析同一ALT分 组不同治疗方案,仅在组2中两种治疗方案的HBeAg转阴率差异有统计学意义（P<0.05）。③HBsAg下降情况：恩替卡韦组在 基线ALT≤5×ULN组和>5×ULN组的HBsAg小于200 U/mL率分别为2.5%、13.8%,两者差异无统计学意义,α干扰素组则分别 为30.6%、33.3%,差异无统计学意义（P>0.05）,而同一ALT分组两种治疗方案的HBsAg小于200 U/mL率的差异均具有统计学 意义（P<0.05）。结论治疗48周后,恩替卡韦组在各个ALT组均较α干扰素组有更高的病毒学应答率。在基线ALT5~10×ULN 组中,α干扰素组的HBeAg转阴率高于恩替卡韦组。对于HBsAg下降情况,α干扰素组在各个ALT组均较恩替卡韦组有更好的效 果,而同一治疗方案不同ALT组中,基线高ALT水平（ALT>5×ULN）组的疗效均优于基线低ALT水平（ALT≤5×ULN）组。因此, 建议基线ALT水平在5~10×ULN的患者优先选择α干扰素治疗,而基线ALT水平≤5×ULN、>10×ULN的患者选用恩替卡韦治疗。     

New hepatitis C therapies in clinical development

With the current standard of care for the treatment of chronic hepatitis C, a combination of pegylated interferon alfa and ribavirin, sustained virologic response rates can be achieved in approximately 50% of patients only. - Improved understanding of the viral life cycle has led to the identification of numerous potential targets for novel, direct-acting antiviral compounds. Inhibitors of the NS3/4A protease are currently the most advanced in clinical development. Recently completed phase 3 studies of the two protease inhibitors telaprevir and boceprevir, each given in combination with standard of care, yielded sustained virologic response rates in the range of 66-75% in treatment-naive patients and 59-66% in treatment-experienced patients with HCV genotype 1 infection. Studies of second-generation protease inhibitors, with the potential advantage of improved potency, drug metabolism and pharmacokinetics profile, are already underway. - Inhibitors of the HCV NS5A protein and NS5B polymerase are potentially active across different HCV genotypes and have shown promising antiviral efficacy in early clinical studies. Other emerging mechanisms include silymarin components and inhibitors of cell proteins required for HCV replication. - While improved formulations of current HCV therapies are also being developed, future hopes lie on the combination of direct-acting antivirals with the eventual possibility of interferon-free treatment regimens.     

丙型肝炎病毒NS5B RNA聚合酶抑制剂研究进展

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是引起慢性肝炎并进而发展为肝硬化和肝细胞癌的主要病原体之一。目前,临床上采用α-干扰素(IFN-α)和利巴韦林(RBV)联合用药治疗丙型肝炎,但有效率仅为40%~50%。寻找HCV特定靶向抗病毒治疗药物是抗HCV研究的重要方向,相应靶点包括NS2 和 NS3 蛋白酶,NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B,其中以NS5B RNA依赖性RNA聚合酶(NS5B RdRp)为靶标的抗HCV药物研究近年来颇受关注。本文在介绍NS5B及NS5B RdRp结构和功能的基础上,总结归纳以NS5B RdRp为靶点的HCV特定靶向抗病毒治疗药物研究的主要策略,以及近年来相关NS5B RdRp抑制剂的研究进展。     

Direct-acting Antiviral Agents Resistance-associated Polymorphisms in Chinese Treatment-na?ve Patients Infected with Genotype 1b Hepatitis C Virus

Background:

It has been reported that several baseline polymorphisms of direct-acting antivirals (DAAs) agents resistance-associated variants (RAVs) would affect the treatment outcomes of patients chronically infected with hepatitis C virus (CHC). The aim of this study is to investigate the prevalence of DAAs RAVs in treatment-naïve GT1b CHC patients.

Methods:

Direct sequencing and ultra-deep sequencing of the HCV NS3, NS5A, and NS5B gene were performed in baseline serum samples of treatment-naïve patients infected with genotype 1b hepatitis C virus (HCVs).

Results:

One hundred and sixty CHC patients were studied. Complete sequence information was obtained for 145 patients (NS3), 148 patients (NS5A), and 137 patients (NS5B). Treatment-failure associated variants of DAAs were detected: 56.6% (82/145) of the patients presented S122G for simeprevir (NS3 protease inhibitor); 10.1% (14/148) of the patients presented Y93H for daclatasvir and ledipasvir (NS5A protein inhibitors); 94.2% (129/137) of the patients presented C316N for sofosbuvir (NS5B polymerase inhibitor). Nearly, all of the DAAs RAVs detected by ultra-deep sequencing could be detected by direct sequencing.

Conclusions:

The majority of genotype 1b CHC patients in China present a virus population carrying HCV DAAs RAVs. Pretreatment sequencing of HCV genome might need to be performed when patients infected with GT1b HCV receiving DAAs-containing regimens in China. Population sequencing would be quite quantified for the work.     

Molecular epidemiology of respiratory syncytial virus

Objective To determine the epidemiologic pattem of subgroups A and B and genotypes of respiratory syncytial virus (RSV) during two noncontinuous epidemics during 1990- 1991 and 1997- 1998 in Beijing. Methods Nasopharyngeal secretion (NPS) samples of RSV positive or RSV isolates tested by indirect immunofluorescence (IIF) assay were classified into subgroups A and B. Isolates of RSV were divided into at least six different lineages, designated NP1-NP6, by restriction mapping of the N gene. Np1, 3 and 6 were given by subgroup B isolates, while NP2, 4 and 5 were given by subgroup A isolates. Strains of subgroup A were further subdivided into six lineages SHL1-SHL6 on the basis of the SH gene sequence. SH lineages were closely related to each other and to NP1-NP6. Strains of SHL1, 3 and 4 were closely related and belonged to NP2, SHL2 and 6 to NP4, and SHL5 to NP5. Results Of 145 RSV NPS samples from the 1997- 1998 epidemic, 83 (57.2％) were of subgroup B RSV positive, 62 (42.8％) of subgroup A RSV positive. The rate of occurrence of subgroup A to B strains was about 1:1.3. Two of 10 isolates during the epidemic were subgroup A strains, whereas 8 were subgroup B strains. The rate of occurrence of subgroup A to B strains was 1:4. Eight subgroup A strains of 10 isolates from the 1990 - 1991 epidemic were dominant; the proportion of subgroup A to B strains was 4:1. With 10 RSV isolates in 1997- 1998, all 2 subgroup A strains gave N gene fragment restriction pattern NP4, and fell into SH lineage SHL2, whereas 8 subgroup B strains all belonged to NP3. All 8 subgroup A isolates from the 1990- 1991 epidemic gave pattem NP4, and fell into SHL2, while 2 subgroup B strains all belonged to NP3. The classification of subgroups A and B deduced from NP pattems corresponded to the definition of these subgroups by monoclonal antibodies. Conclusions These observations confirm that subgroups A and B or multiple lineages of RSV co circulated in Beijing, but different genome types predominated each year. Moreover, very similar viruses were isolated up to more than 5 years ago, indicating that despite apparent diversity of the subgroup A strains, the separate lineages might be relatively stable.     

慢性丙型肝炎患者对NS3／4A蛋白酶抑制剂预存耐药的研究

目的对我国南方184例无抗病毒治疗史的慢性丙型肝炎患者进行NS3／4A蛋白酶抑制剂相关耐药位点检测。方法NS3／4A蛋白酶抑制剂相关的耐药位点分析采用自行设计型别特异性引物行巢式PCR．PCR产物经纯化后采用直接测序法鉴定。结果184例样本中有162例扩增成功,其中125例（77．16％）患者共检出266个变异位点。HCVlb型A156S变异率为18．33％,V170I为16．67％;HCV2a型V36L、Q80G、V170I变异率为100％,A156S为64．29％;HCV6a型Q80K变异率为95．45％,V170I为98．86％。结论未使用抗病毒药的慢性丙型肝炎患者对NS3／4A蛋白酶抑制剂也存在预存耐药,变异率因HCV基因型而不同。1b型发生变异较少,HCV2a型及6a型普遍发生变异。