新生小鼠端脑组织神经干细胞诱导分化为胆碱能神经元的研究

目的探讨新生小鼠端脑组织神经干细胞是否能够分化成胆碱能神经元。方法取新生小鼠端脑组织．用无血清方法分离培养神经干细胞；用克隆培养的方法检验培养细胞的干细胞特性；用免疫荧光细胞化学的方法检测神经干细胞标志巢蛋白（nestin）及干细胞诱导分化后神经元标志微管相关蛋白2（MAP2）、星形胶质细胞标志胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、胆碱能标志胆碱乙酰转移酶（CHAT）；比较不同的诱导分化条件（5％胎牛血清、5％胎牛血清＋碱性成纤维细胞生长因子）对胆碱能神经元分化的影响。结果从新生小鼠端脑组织分离培养出具有自我更新、扩增能力的神经球；各培养基中神经球均为nestin阳性。诱导分化后均能够产生MAP2阳性神经元、GFAP阳性星形胶质细胞以及ChAT阳性的胆碱能神经元。分化培养中加入碱性成纤维细胞生长因子能够提高胆碱能神经元分化的比例。结论新生小鼠端脑组织神经干细胞能够分化成胆碱能神经元。     

胚胎大鼠神经干细胞培养及分化鉴定的实验研究

目的建立胚胎大鼠神经干细胞体外培养及分化鉴定的方法。方法分离不问孕龄(13- 18d)SD胎鼠脑室下区、中脑及海马等部位组织,在含有表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子及N-2 添加剂的DMEM培养基中悬浮培养,形成神经球体后撤除生长因子,经消化传代于含胎牛血清培养基中贴壁生长。应用免疫荧光方法检测原代细胞特异性标记巢蛋白、神经元标记微管蛋白-β、胶质细胞标记胶质纤维酸性蛋白,以及少突胶质细胞标记半乳糖脑苷的表达。结果胎鼠脑组织不同部位均可分离出神经干细胞,体外培养可以向神经元和神经胶质细胞分化,孕龄13d与18d胎鼠产生神经干细胞球体的能力不同,前者优于后者。结论 (1)胚胎大鼠脑内不同部位来源的组织生成神经干细胞球体数量和质量基本相同,但是不同胎龄的鼠脑组织产生神经干细胞球体的能力有所差异。(2)神经干细胞具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。     

大鼠胎脑神经干细胞的培养分化及鉴定的实验研究

目的建立大鼠胎脑皮质神经干细胞的培养、扩增、诱导分化及鉴定的方法。方法选取孕14d胎鼠的大脑皮质作为细胞来源,在无血清培养基中添加B27、碱性成纤维细胞因子、表皮生长因子,建立胚胎神经干细胞的体外培养体系,用5%的胎牛血清诱导神经干细胞分化,用免疫荧光染色技术进行对神经干细胞及诱导分化细胞的鉴定。结果原代培养的神经干细胞折光性强,培养第2d开始形成细胞集落,第3d形成大的神经球。3～5代传代的细胞生长稳定。经胎牛血清诱导后第3d开始,神经球开始向周边发出突起,悬浮的细胞开始贴壁生长。原代及传代培养的神经球表达Nestin阳性,分化细胞分别表达NSE、GFAP和GALC阳性。结论应用无血清培养技术可在体外培养、扩增出神经干细胞。5%的胎牛血清可以诱导神经干细胞向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等成熟细胞分化。     

低氧环境下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑神经干细胞的分化*

背景：有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的定向诱导分化是神经干细胞移植治疗帕金森病的关键所在。 目的：观察低氧条件下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑源性神经干细胞向多巴胺能神经元的分化。 方法：体外分离培养孕12 d胚鼠腹侧中脑组织,制成单细胞悬液,在含碱性成纤维细胞生长因子和B27的无血清培养基中培养并传代,分别置于常氧(体积分数21%O2)或低氧(体积分数3%O2)环境下增殖5~7 d后,接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,或含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12+1 µg/L胶质源性神经营养因子。 结果与结论：低氧环境下分化10~12 d,中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化均高于常氧组,在胶质源性神经营养因子诱导下向多巴胺能神经元分化比例更高,表型更成熟。说明低氧环境下胶质源性神经营养因子可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元。     

成年C57小鼠脊髓神经干细胞的培养与鉴定

目的　 从成年小鼠脊髓中培养神经干细胞 ,并对其进行鉴定和诱导分化。方法　 成年C5 7小鼠 ,悬浮培养神经干细胞技术。结果　培养 1～ 2周时 ,培养液中即可出现神经干细胞克隆球。该克隆球具有很强的自我增殖能力 ,可多次传代。免疫细胞化学技术证明该克隆球表达大量的神经干细胞特征性的中间丝———巢蛋白(Nestin) ;经 1%胎牛血清诱导后可表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特征性标志物β tubulinIII、胶质纤维酸性蛋白 (Gliafibrillaryacidicprotein ,GFAP)和RIP ,提示它们可朝神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞方向分化。 结论　 本研究结果提示正常成年C5 7小鼠脊髓中含有神经干细胞 ,在体外条件下可以大量增殖 ,经诱导后可朝神经元和胶质细胞的方向分化     

羊水干细胞分泌细胞因子及其对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响

背景：关于细胞移植的功效,重点在于其分泌的促增殖或抗凋亡的细胞因子,羊水干细胞能否分泌相关细胞因子有必要深入分析。 目的：观察分离培养的羊水干细胞分泌细胞因子情况,及其对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的作用。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-12/2009-06在南昌大学第一附属医院高血压病研究所完成。 材料：10例剖宫产孕妇足月羊水,50 mL/例,用于分离培养羊水干细胞,同时留取其产后脐静脉用于分离培养内皮细胞,取前均获孕妇知情同意。 方法：①贴壁法分离培养羊水干细胞,达80%融合时胰酶消化传代,取传至第3代细胞,调整细胞密度为5×108 L-1,分为2组：缺氧羊水干细胞组通入体积分数为2% O2 + 体积分数为5% CO2 +体积分数为93% N2,常规羊水干细胞组通入体积分数为5% CO2 +体积分数为95%空气,两组细胞37 ℃培养24 h,收集各自培养上清液及细胞以备分析。②取体外分离培养的第2代人脐静脉内皮细胞,以2×104细胞/孔的密度接种于12孔板,分为3组：对照组加入含体积分数为5%胎牛血清的EBM-2新鲜培养液2 mL,常规羊水干细胞组加入含体积分数为5%胎牛血清的EBM-2新鲜培养液1 mL +羊水干细胞培养液1 mL,缺氧羊水干细胞组加入含体积分数为5%胎牛血清的EBM-2新鲜培养液1 mL + 缺氧诱导羊水干细胞培养液1 mL,培养3 d,加入10 μg/L 肿瘤坏死因子α诱导细胞凋亡。 主要观察指标：流式细胞仪测定羊水干细胞表面抗原表达,ELISA法测定羊水干细胞分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子情况,RT-PCR法测定细胞因子mRNA的表达,检测内皮细胞增殖率及凋亡率。 结果：培养7 d后羊水干细胞呈长梭形,以漩涡状、辐射状排列,第3代羊水干细胞呈CD29+,CD105+,CD34-。常规培养的羊水干细胞可分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子;缺氧诱导条件下血管内皮细胞生长因子水平明显增加(P < 0.01),其mRNA表达明显上调(P < 0.05),而肝细胞生长因子含量及mRNA的表达均无明显变化(P > 0.05)。与对照组比较,培养3 d后常规羊水干细胞组、缺氧羊水干细胞组内皮细胞数均明显增加(P < 0.05),肿瘤坏死因子α诱导凋亡24 h后内皮细胞凋亡率均明显降低(P < 0.05),且缺氧羊水干细胞组变化幅度大于常规羊水干细胞组(P < 0.05)。 结论：羊水干细胞可分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子,羊水干细胞培养液能促进内皮细胞增殖,抑制内皮细胞凋亡。经缺氧处理后,羊水干细胞分泌血管内皮细胞生长因子的能力增加,对内皮细胞的增殖和凋亡干预作用增强。     

骨髓中一类新细胞群——神经组织定向干细胞的确立☆

背景：骨髓间充质干细胞和造血干细胞具有分化为神经类细胞的潜能已得到共识。另有研究者认为骨髓中除骨髓间充质干细胞和造血干细胞以外，还寄居着CXCR4阳性的组织定向干细胞，包括骨骼肌、心、肝及神经组织定向干细胞。 目的：实验拟进一步证实神经组织定向干细胞寄居于骨髓，并寻求确立神经组织定向干细胞分离、培养的新方法。 设计：开放性实验。 单位：解放军第二军医大学解剖学教研室。 材料：所用成年清洁级SD大鼠由解放军第二军医大学动物中心提供。DMEM/F12，B27，N2均购自Invitrogen公司；bFGF源于CytoLab Ltd；EGF源于Invitrogen公司；Nestin、CXCR4，β-Tublin Ⅲ，神经胶质纤维酸性蛋白等一抗为Santa Cruz公司兔抗鼠多克隆抗体；MAP2ab（Clone11-5B），CNPase（Clone AP20）为NeoMarkers公司小鼠抗大鼠单克隆抗体；荧光（FITC，Cy3）标记试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；免疫组化试剂盒购自Vector Laboratories公司。NycoPrepTM分离液（1.077A）购自Axis-Shield 公司。 方法：实验于2004-01/2006-12在解放军第二军医大学组织工程研究所完成。取SD大鼠双侧股骨及胫骨，冲洗骨髓腔，经NycoPrepTM分离液分离单核细胞层，DMEM/F12（1∶1） 无血清神经干细胞培养液（内含2%B27，1%N2，20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子， 20 μg/L 表皮生长因子,1×105 U/L青霉素, 100 mg/L链霉素），通过先贴壁、后悬浮的方法从骨髓中分离、培养单克隆生长的神经组织定向干细胞。 主要观察指标：通过免疫细胞化学法检测神经组织定向干细胞细胞球CXCR4和nestin蛋白，以及细胞球自然分化后神经元以及神经胶质细胞的标志蛋白。 结果：①神经组织定向干细胞细胞球表达神经干细胞标志蛋白nestin和组织定向干细胞标志蛋白 CXCR4。②神经组织定向干细胞细胞球在含15%胎牛血清的DMEM培养液中可自然分化，分化细胞呈梭形或多角形，有2~5个细胞突起，免疫荧光检测显示神经元标志蛋白β-tublinIII及MAP2ab，以及神经胶质标志蛋白CNPase和神经胶质纤维酸性蛋白阳性。 结论：骨髓中存在神经组织定向干细胞，可自然分化为神经元样细胞及神经胶质样细胞。     

星形胶质细胞条件培养液体外诱导胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景：在神经干细胞移植治疗神经系统退行性变及修复神经系统功能损伤过程中,有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的定向诱导分化尤为关键。 目的：以星形胶质细胞条件培养液为诱导剂,观察胎鼠室管膜前下区神经干细胞体外向多巴胺能神经元的分化。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2006-12/2007-08在解放军第三军医大学新桥医院实验中心完成。 材料：清洁级新生2 d龄KM小鼠15只,孕16 d Wistar大鼠40只,均由解放军第三军医大学实验动物中心提供。 方法：采用差速黏附法和振荡分离法纯化培养KM小鼠星形胶质细胞,收集传至第3代、培养5 d的星形胶质细胞条件培养液,-20 ℃冻存待用。体外分离Wistar胎鼠室管膜前下区神经干细胞,加入含B27和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12无血清培养基进行原代培养,传至第3代后按0.5×108 L-1密度接种,设立2组：对照组单纯加入含体积分数0.1为胎牛血清的DMEM/F12培养基予以自然分化,实验组加入已制备的星形胶质细胞条件培养液进行诱导分化。 主要观察指标：免疫细胞化学染色鉴定胎鼠室管膜前下区神经干细胞,流式细胞仪检测胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元分化的阳性率。 结果：培养的神经球细胞表达巢蛋白,可分化为神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。诱导分化7 d后,实验组可见酪氨酸羟化酶阳性细胞,胞体呈圆形或椭圆形,酪氨酸羟化酶位于胞质及突起中;对照组酪氨酸羟化酶阳性细胞在数量、细胞成熟形态上均未达到实验组水平。实验组酪氨酸羟化酶阳性细胞分化率明显高于对照组（t=35.296,P < 0.01）。 结论：在体外星形胶质细胞条件培养液可显著促进胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元分化。     

胎鼠海马神经干细胞生物学特性的研究

目的研究胎鼠脑组织中海马神经干细胞的自我繁殖特性及多向分化潜能.方法在碱性成纤维生长因子(FGF-2)作用下从胎鼠脑组织中分离、培养神经干细胞并诱导其分化,然后采用间接免疫荧光和免疫组化技术研究神经干细胞的特性.结果由胎鼠海马中分离出的神经干细胞在体外分裂增殖形成干细胞团,分化产生神经元和胶质细胞,它们分别对神经上皮干细胞蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白等抗原标记呈现阳性.结论胎鼠脑海马中存在神经干细胞,其具有自我增殖特性和多向分化潜能,在FGF-2的作用下分裂增殖,并分化成神经元、胶质细胞.     

EGF和FGF-2促神经干细胞增殖与分化研究

目的 建立人胚胎大脑神经干细胞的分离培养方法并观察在不同诱导因子作用下细胞分化的生物学特性。方法 将经培养的人胚胎大脑神经干细胞分为4组,在不同培养液中培养、分化:(1)DMEM/F-12标准培养液组;(2)标准培养液+表皮生长因子(EGF)组;(3)标准培养液+碱性成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)组;(4)标准培养液+表皮生长因子+碱性成纤维细胞生长因子-组。用定量RT-PCR方法及免疫组织化学染色方法鉴定神经干细胞的原始特性、端粒酶活性以及不同诱导因子对神经干细胞分化特性的影响。结果 于培养第6d,标准培养液中的脑细胞死亡;而在加入EGF和FGF-2的培养液中则形成神经干细胞球体,而且增殖细胞核抗原染色和神经干细胞巢蛋白表达均呈阳性反应;其端粒酶活性为63％,低于瘤细胞而高于正常脑组织。神经干细胞分化后经胶质纤维酸性蛋白、神经微丝、突触素、微管相关蛋白-2及神经细胞核抗原染色显示,分化的神经元最高值达(18±2.5)％。不同诱导因子对不同传代的细胞球体内神经干细胞的促增殖作用差异有显著性意义(均P<0.05)。结论 EGF和EGF-2均具有促进神经干细胞存活、增殖和分化的作用。     

多聚赖氨酸和明胶对神经干细胞增殖和分化的影响

摘要 背景：目前大鼠神经干细胞体外诱导分化的研究报道诸多,但其分化过程很难控制,很多实验的操作方法复杂,分化比率也很低。 目的：探索大鼠胚胎前脑神经干细胞体外原代及传代培养方法,并观察其分化规律。 方法：胎鼠在无菌条件下分离出前脑,制备单细胞悬液,以1×1011L-1接种于含N2的DMEM/F12培养基中培养,传代培养过程中加入BrdU,标记神经干细胞球。诱导分化实验分为多聚赖氨酸铺板组、明胶铺板组和无铺板组。采用体积分数20%胎牛血清刺激其分化。免疫细胞化学检测nestin、BrdU及在血清诱导条件下神经干细胞向神经细胞分化的能力。 结果与结论：细胞呈神经干细胞样生长,具有连续增殖能力,可以传代培养。传代神经球中的细胞均呈nestin阳性和BrdU阳性。多聚赖氨酸铺板组和明胶铺板组贴壁后分化为神经细胞能力强于无铺板组(P < 0.01)。多聚赖氨酸铺板组略强于明胶铺板组(P > 0.05)。神经谱系标记物神经胶质纤维酸性蛋白和微管相关蛋白2的免疫细胞化学结果均阳性。结果表明,大鼠胚胎前脑富含神经干细胞,其分化观察,多聚赖氨酸和明胶在诱导神经干细胞分化中作为细胞贴壁支持物提高分化细胞数量的作用,且多分化为星形胶质细胞。 关键词：多聚赖氨酸;神经干细胞;明胶;增殖分化;体外培养 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.004     

联合应用碱性成纤维细胞生长因子和脑源性神经营养因子对成年大鼠脑海马神经干细胞分化为神经元的影响

背景：调控神经干细胞分化的微环境因素很多,数种因素可以不同程度地刺激神经干细胞向神经元分化,如何使神经干细胞更有效地分化为神经元尤为关键。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子与脑源性神经营养因子联合应用对成年大鼠脑海马神经干细胞分化为神经元的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-05在中国医科大学神经解剖研究室完成。 材料：清洁级雄性SD大鼠3只,由中国医科大学实验动物部提供。 方法：无菌条件下分离大鼠脑海马组织,胰蛋白酶消化后采用无血清培养技术体外培养神经干细胞,传至第4代克隆球直径约为200 µm时,滴加含B27、表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12进行单细胞克隆培养。传代的神经干细胞分成4组：空白对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液,碱性成纤维细胞生长因子组、脑源性神经营养因子组、联合组分别在空白对照组培养液的基础上加入10 µg/L碱性成纤维细胞生长因子、200 µg/L脑源性神经营养因子、10 µg/L碱性成纤维细胞生长因子+200 µg/L脑源性神经营养因子,培养1周。 主要观察指标：免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞,检测神经干细胞分化为神经元的比例。 结果：单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。与空白对照组比较,碱性成纤维细胞生长因子组、脑源性神经营养因子组、联合组神经干细胞分化为神经元的比例均明显提高(t =3.409~7.558,P < 0.05),且联合组升高幅度尤为显著。 结论：适宜浓度的碱性成纤维细胞生长因子和脑源性神经营养因子联合应用,比其单独应用具有更强的促神经干细胞向神经元分化的作用。     

甲状腺激素对大鼠骨髓间充质干细胞分化为少突胶质细胞的影响

背景：如何为脱髓鞘疾病的细胞替代治疗提供丰富的少突胶质细胞来源是急需解决的问题。 目的：实验拟采用表皮生长因子及碱性成纤维细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向神经干细胞方向分化,撤退细胞因子后,用甲状腺激素诱导神经干细胞向少突胶质细胞分化。 设计、时间及地点：细胞观察实验,于2007-08/12在泸州医学院神经生物学研究室完成。 材料：普通级SD大鼠5只用于骨髓间充质干细胞的培养。 方法：采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞,传至第4代,用含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、N2辅助因子、甲状腺激素T3的DMEM/F12诱导液诱导向神经干细胞分化。诱导后4 d,更换成含胎牛血清、甲状腺激素T3的DMEM/F12分化液,诱导向少突胶质细胞分化。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞生长情况和形态变化,采用SABC法进行免疫细胞化学检测神经细胞特异性标志的表达。 结果：原代细胞接种3 d后多数贴壁,传代后细胞贴壁速度加快,增殖能力更强。诱导液处理第4天,圆形细胞聚集成簇。换成分化液后,细胞伸出树枝状细长突起,交织成网,形成少突胶质细胞样细胞。骨髓源性细胞簇表达巢蛋白阳性,示神经干细胞;从细胞簇分化的细胞,多数细胞表达半乳糖脑苷脂,部分细胞表达髓鞘碱性蛋白,示少突胶质细胞,少数细胞表达微管相关蛋白2阳性,示神经元。 结论：甲状腺激素在体外可诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化。     

鼠胚胎神经干细胞的体外培养及诱导分化

背景：随着神经干细胞培养技术条件的成熟,为颅脑损伤后神经系统功能重建、神经再生和神经系统疾病治疗提供了新的思路和途径。但移植所用的细胞来源及移植后的神经干细胞能否分化为神经细胞是急需解决的重要问题。 目的：拟将体外分离培养的鼠胚胎神经干细胞稳定增殖传代,并诱导分化出神经系统的3种基本细胞。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-06/2008-06在新疆维吾尔自治区人民医院完成。 材料：14~16 d孕龄Wistar大鼠胚胎,由新疆自治区实验动物研究所和新疆医科大学实验动物中心提供。 方法：取胎鼠额叶大脑皮质,组织块消化法体外分离培养神经干细胞,在表皮生长因子、碱性成纤维生长因子和B27联合作用下使其稳定增殖。原代培养7 d后,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导14 d。 主要观察指标：倒置显微镜下观察神经干细胞的生长形态,并行巢蛋白免疫荧光染色鉴定。应用免疫组化染色检测诱导后神经干细胞的分化情况。 结果：原代培养一两天细胞散在分布,胞体较小,呈圆形,折光性较好,3 d后逐渐形成由数个细胞组成的细胞球;传代后贴壁细胞多数分化为长梭形或扁平形的胶质细胞,10 d时可见大量由数十至数百个细胞组成的较大细胞球,其生长速度基本与原代培养相同,但成球速度明显加快;免疫荧光染色呈巢蛋白阳性反应。以含体积分数为10%胎牛血清的培养液诱导后,免疫化学染色示神经干细胞球呈神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、髓鞘碱性蛋白阳性表达。 结论：实验成功从鼠胚胎脑皮质分离培养出神经干细胞,并诱导分化为神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。 关键词：神经干细胞;体外培养;诱导分化     

大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化及神经蛋白的动态表达

背景：现阶段骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞的方法并不统一。 目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞体外向神经样细胞诱导分化的条件，及其定向分化过程中神经蛋白的动态表达。 设计、时间及地点：细胞形态学观察及蛋白分子水平检测，于2006-09/2007-01在苏州大学生命科学学院完成。 材料：清洁级SD大鼠2只。胎牛血清为杭州四季青产品，成纤维生长因子、丁羟基茴香醚为Sigma公司产品，二甲基亚砜为Amresco产品。 方法：Percoll法体外分离培养、扩增纯化大鼠骨髓间充质干细胞，调整细胞密度为5×107 L-1。设立2组，诱导组用含10%胎牛血清和10 μg/L成纤维生长因子的L-DMEM培养基预诱导24 h后，再以含2%二甲基亚砜和200 μmol/L丁羟基茴香醚的L-DMEM无血清培养基诱导1，3，5 h。对照组始终用含10%胎牛血清的L-DMEM进行培养。 主要观察指标：细胞形态学变化，免疫荧光染色鉴定神经细胞表型。 结果：预诱导24 h，胞体由原来的长梭形变成多角形或不规则形，伸出多个短棒状突起，可见2~3个核仁，细胞间漩涡状生长趋势消失，排列无规律；诱导1~3 h，细胞逐渐变圆，胞质收缩明显，折光性增强，双级或多极的突起互相连接呈网状；诱导5 h，突起出现一、二级分支。诱导1 h后部分细胞表达神经前体细胞表面抗原巢蛋白；3 h后巢蛋白达高峰，同时表达成熟神经元标志物神经元特异性烯醇化酶和微管蛋白；5 h后巢蛋白表达下降，神经元特异性烯醇化酶和微管蛋白达高峰。对照组细胞形态无明显变化，巢蛋白表达为阴性。 结论：在添加化学诱导剂之前先使用成纤维生长因子进行预诱导，能促进骨髓间充质干细胞向神经前体细胞和神经元转化，且在诱导分化过程中神经蛋白分子的表达顺序与神经细胞发育过程一致。     

胎鼠脊髓神经干细胞的分离培养、鉴定与诱导分化

目的 探讨胚胎大鼠脊髓神经干细胞分离、培养、传代及鉴定的方法.方法显微解剖分离E14d胚胎大鼠脊髓组织,用机械吹打法制成单细胞悬液,接种于含有表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维生长因子(bF-GF)及N2的DMEM/F12(1:1)无血清培养基中培养,待形成克隆球后进行传代培养.取第3代培养的细胞分别进行Nestin免疫细胞化学鉴定和诱导分化后β-Ⅲ-tubulin、GFAP、CNPase免疫细胞化学鉴定.结果 E14d胚胎大鼠脊髓组织细胞培养72h后可形成悬浮生长的神经球,7～10d后即可传代.经传代扩增后得到大量同源的Nestin免疫阳性的细胞克隆球,经诱导分化后大部分细胞分化为GFAP免疫阳性的星形胶质细胞和CNPase免疫阳性的少突胶质细胞,少量细胞分化为β-Ⅲ-tubulin免疫阳性的神经元.结论成功从胚胎大鼠脊髓组织中分离出神经干细胞,为进一步开展脊髓疾病的细胞移植治疗研究奠定了基础.     

无血清培养大鼠胚胎向神经干细胞的分化

背景：体外培养扩增获取大量、高纯度的神经干细胞是其移植应用的前提,无血清培养主要目的是去除血清中可能诱导神经干细胞分化的生长因子等干扰因素。 目的：在无血清条件下体外分离培养大鼠胚胎神经干细胞,并观察其生物学特性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2005-03/2006-03在河北医科大学第三医院中心实验室完成。 材料：14~16 d龄SD胎鼠2只,由河北医科大学实验动物中心提供。 方法：无菌条件下取胎鼠大脑皮质,剪碎后机械分离法制作单细胞悬液,加入含B27神经营养添加剂的无血清MEM/F12培养基进行培养,1周后传代。 主要观察指标：免疫荧光染色鉴定神经干细胞巢蛋白的表达及传代能力,加入含血清的MEM/F12培养基诱导分化1周后免疫组化检测细胞分化情况。 结果：培养48~72 h细胞聚集悬浮生长,形成典型的神经球,呈神经干细胞特异性抗原巢蛋白阳性表达。传代的神经干细胞置于BrdU培养液中5~7 d形成次代神经球,呈BrdU阳性,表明次代神经球中绝大部分细胞为传代后细胞分裂而来,具有传代能力,传代后加入含血清的培养基后可以分化为微管相关蛋白2阳性细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。 结论：利用无血清培养技术可成功从胎鼠脑皮质中分离培养出具有分裂增殖能力及多向分化潜能的神经干细胞。     

移植神经干细胞的存活与迁移：电刺激小脑顶核可提高移植效率吗？**

背景：缺血早期半暗带中神经元和内皮细胞的坏死和凋亡无法得到缓解,加之移植后的存活率低,向功能细胞的分化率低,是单纯神经干细胞移植的缺陷。课题组提出整体干预理念,期望给移植细胞提供优化的整体环境。 目的：观察神经干细胞移植与电刺激小脑顶核相结合整体干预对移植神经干细胞存活与迁移的影响。 方法：体外分离、培养新生Wistar大鼠海马表皮生长因子反应性神经干细胞,Brdu标记,并用胎牛血清诱导,观察其多向分化潜能;80只Wistar大鼠分为4组：顶核刺激+神经干细胞移植组(n=32)：左侧小脑顶核刺激24 h后行右侧大脑中动脉梗死,再24 h后将神经干细胞立体定向注入右侧侧脑室内;顶核刺激组(n=8)：PBS代替神经干细胞,其余同顶核刺激+神经干细胞移植组;单纯神经干细胞移植组(n=32)：同心圆电极插入小脑顶核,不通电其余同顶核刺激+神经干细胞移植组;对照组(n=8)：同心圆电极插入小脑顶核后不通电,其余同顶核刺激组。记录梗死后6,24 h,3,7,14,28 d大鼠的神经功能;分别在移植后3,7,14,28 d处死大鼠,以梗死灶为中心切片,Brdu免疫组织化学染色,观察移植神经干细胞的存活与迁移。 结果与结论：分离培养的表皮生长因子反应性细胞表达nestin抗原,并有自我更新及多向分化潜能,在胎牛血清诱导下可分化为神经胶质细胞和神经元。经Brdu标记后,85%以上神经干细胞表达Brdu抗原。移植28 d内顶核刺激+神经干细胞移植组功能评分明显优于与其他3组(P < 0.05~0.01)。顶核刺激+神经干细胞移植组在移植14,28 d存活细胞数明显多于单纯神经干细胞移植组;提示电刺激小脑顶核可显著提高移植神经干细胞的存活率及大脑中动脉梗死大鼠的神经功能评分;优化的整体环境可提高移植神经干细胞对局灶性脑缺血损伤细胞的替代作用。     

PDGF对人神经干细胞分化和甲状腺激素受体表达的影响

目的　探讨血小板衍生生长因子 (platelet-derived growth factor,PDGF)在神经干细胞 (neural stem cell,NSC)定向分化中的作用 ,以及 PDGF在 NSC分化过程中对甲状腺激素受体 (thyroid hormone receptors,TRs)表达的调控。方法　用免疫细胞化学方法鉴定分化后的细胞类型 ,分别用 RT-PCR半定量法、ELISA法检测不同诱导条件下 NSC分化前后 TR-α1 、TR-α2 、TR-β1 在转录与蛋白表达水平上的变化。结果　 PDGF诱导分化后神经丝蛋白 (neurofilament protein,NF)细胞约占 80 % ;TR-α1 、TR-α2 、TR-β1 m RNA表达水平分别比 1 0 % (体积分数 )胎牛血清诱导分化组上调约 40 %、3 0 %、1 0 % (P<0 .0 5 )。TR-α、TR-β蛋白质表达趋势为 NSC>PDGF诱导分化组 >血清诱导分化组 (P <0 .0 5 )。结论　 PDGF能引发 NSC向神经元分化 ,同时在转录与蛋白表达水平上调 NSC分化后 TR各亚型的表达 ,增强甲状腺激素对中枢神经系统发育的调控作用。     

不同体外诱导培养条件下新生鼠基底前脑神经干细胞增殖和分化为神经元的能力*☆

目的：研究神经干细胞的增殖、迁移和分化可为揭示神经系统的发生、发育过程提供可靠依据。观察表皮生长因子和碱性成纤维生长因子在体外刺激新生鼠基底前脑神经干细胞的增殖情况，及其各自诱导神经干细胞分化成神经元的能力。 方法：实验于2005-12/2006-07在广州医学院解剖学教研室完成。①动物：清洁级新生24 h内的SD大鼠30只，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：新生鼠在无菌条件下取脑，分离出基底前脑，胰蛋白酶消化，离心过滤制备单细胞悬液，接种于含B27的DMEM/F12培养基培养瓶中，每瓶40~60万个细胞，加入终浓度均为10μg/L的表皮生长因子和碱性成纤维生长因子刺激生长，在体外进行神经干细胞的克隆培养，传代培养过程中加入终浓度为6 mg/L BrdU用于标记神经球，设立3组，各自加入体积分数为0.1的小牛血清、终浓度均为10μg/L的表皮生长因子、碱性成纤维生长因子，对培养得到的神经干细胞进行诱导分化。③实验评估：免疫荧光染色检测神经干细胞巢蛋白抗原的表达，并用BrdU标记和免疫荧光证实其增殖能力。免疫荧光染色检测不同诱导条件下神经干细胞向神经元分化的能力。 结果：①细胞形态观察：从新生鼠基底前脑成功分离出神经干细胞，原代培养呈透亮的圆球形，2~3 d后细胞数目明显减少，部分细胞开始分裂。1周左右培养瓶中出现许多由数十到数百个细胞组成的悬浮生长的细胞球，球中的细胞形态规则，边界清楚，折光性较强，胞浆颜色较深，核/浆比较大。该细胞具有连续增殖能力，可以传代培养。②巢蛋白抗原的表达：传代神经球中的细胞均呈巢蛋白抗原阳性。③BrdU标记检测：克隆球中的细胞均为BrdU阳性，表明克隆球是由不断分裂增殖的细胞组成。④诱导分化结果：在体积分数为0.1小牛血清、终浓度均为10μg/L的表皮生长因子、碱性成纤维生长因子诱导条件下，神经干细胞分化为神经元的比例分别为20%，22%，40%。 结论：①表皮生长因子和碱性成纤维生长因子在体外能够刺激新生鼠基底前脑神经干细胞连续增殖，且具有胚胎源性。②以血清作为对照，碱性成纤维生长因子诱导神经干细胞向神经元分化的能力强于表皮生长因子。