重组人促红细胞生成素对小鼠视网膜光损伤的防护作用

（青岛）为了探讨重组人促红细胞生成素（rHEPO）通过小鼠血视网膜屏障的情况及其对视网膜光损伤的保护作用，研究者对24只BALB／c小鼠腹腔注射rHEPO，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测小鼠视网膜中促红细胞生成素（EPO）的含量；24只BALB／c小鼠建立光损伤动物模型，通过光镜和核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口标记（TUNEL）法观察实验组小鼠和对照组小鼠视网膜细胞的变化情况。结果腹腔注射rHEPO后2、4、6及8h小鼠100μg视网膜蛋白中EPO的含量差异有统计学意义，在腹腔注射药物后4h视网膜中EPO的浓度达到高峰。随光照时间延长，光镜下可见对照组视网膜杆细胞的内、外节破坏明显加重，外核层逐渐变薄，出现核固缩，甚至核碎裂；实验组各观察时间点损伤变化均较轻，仅见感光细胞内、外节排列紊乱，形成空泡，外核层细胞排列稍紊乱，厚度无明显变化。     

中性粒细胞在不同品系正常小鼠角膜的分布及其与角膜创伤修复的关系

背景 以往人们通常认为角膜无血管、无髓系来源的免疫细胞存在.C57BL/6J小鼠、BALB/c小鼠和裸鼠是眼科免疫学基础研究的常用模型,这些小鼠的角膜是否存在天然免疫的关键细胞——中性粒细胞是值得关注的问题. 目的 研究实验室常用的C57BL/6J鼠、BALB/c鼠和裸鼠正常角膜的中性粒细胞分布特征及其与角膜创伤修复的关系,为相关研究提供依据. 方法 选取角膜正常、10 ～ 12周龄的SPF级雄性C57BL/6J鼠、BALB/c鼠和BALB/c背景的裸鼠各16只,取3种小鼠各8只制备成中央区相连的4瓣角膜铺片,并以角膜周边血管缘为界向内以3个同心圆分区.分别用Gr-1-FITC抗体和CD31/PECAM-1-PE抗体对角膜中性粒细胞和血管进行免疫荧光染色,用免疫荧光显微镜和AR软件测量角膜血管面积并计数中性粒细胞.选取3种小鼠各8只制备角膜创伤模型,用无菌手术刀片以角膜中央为中心做十字划痕,深度至角膜前弹力层.创伤后即刻（0 h）、12h、24 h用2 g/L荧光素钠点眼,荧光显微镜下以AR软件计算不同时间点的创伤面积.于划痕后24 h取小鼠角膜制备铺片,用Gr-1-FITC抗体和CD31/PECAM-1-PE抗体行荧光染色,比较3种创伤小鼠角膜的血管分布、中性粒细胞的数量和分布情况.实验动物的饲养与使用均遵循美国视觉与眼科研究协会制定的科研动物使用规范. 结果 正常C57BL/6J小鼠、BALB/c小鼠和裸鼠角膜中性粒细胞总数分别为（1 733±237）、（353±96）和（1 601 ±223）个/角膜,BALB/c小鼠角膜中性粒细胞数明显少于C57BL/6J小鼠和裸鼠,差异均有统计学意义（P＜0.01）.3种正常小鼠角膜缘均可见血管分布,BALB/c小鼠角膜缘血管面积明显小于C57BL/6J小鼠和裸鼠,C57BL/6J小鼠角膜缘血管面积明显大于裸鼠,差异均有统计学意义（P＜0.01）.3种正常小鼠中性粒细胞的数量与血管面积均呈明显正相关（C57BL/6J：r=0.936,P=0.001;BALB/c：r =0.939,P=0.001;     

肺炎链球菌表面黏附素A的原核表达和抗原性分析

目的应用基因工程技术制备肺炎链球菌表面黏附素A（pneumococcal soffaee adhesinA,PsaA）,并分析其抗原性。方法根据基因库中报道的psaA基因序列,从肺炎链球菌基因组中扩增出psaA基因,连接到原核表达载体pET28a中,构建出重组质粒pET28a-psaA,转化大肠杆菌B121（DE3）,采用镍柱亲和层析法纯化PsaA蛋白,Western—blot分析其抗原性。结果克隆出的psaA基因同基因库中报道的psaA基因序列一致。成功构建出重组质粒pET28a-psaA,基因测序证实重组质粒构建正确。成功表达和纯化出PsaA蛋白,十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳显示蛋白分子量为37-kDa,最终得到纯度较高的蛋白,主要以可溶性形式存在,Western—blot分析显示在37-kDa处见到目的蛋白条带。结论利用基因工程技术可以克隆出psaA基因,并成功表达和纯化出PsaA蛋白,其抗原性良好。     

甲状腺相关眼病与Th1/Th2免疫平衡

背景 甲状腺相关眼病(GO)是自身免疫性疾病,目前其发病机制尚不清楚,近年来的研究发现Th1/Th2型免疫平衡反应的失调是导致GO的主要原因. 目的 采用脂质体包裹的人促甲状腺激素受体(hTSHR)胞外段基因重组质粒免疫同系雌性BALB/c小鼠以建立GO动物模型,研究关于在GO小鼠模型血清Th 1/Th2型免疫反应平衡状态,探讨GO的病理机制.方法 采用计算机数字随机分配法将同系6～8周龄雌性BALB/c小鼠32只分为重组质粒注射组、空白对照组、空质粒注射组和脂质体注射组.重组质粒注射组分别于实验的0、3、6周采用脂质体包裹的重组质粒pcDNA3.1 +/hTSHR289各30 μg行双胫前肌内注射,再于腹腔内注射40 μg以免疫小鼠,空质粒注射组和脂质体注射组分别采用pcDNA3.1+和脂质体以同样的方法进行免疫,空白对照组不做任何处理.分别于注射前及各次注射后第4天及第17周末处死小鼠行心脏采血,采用ELISA法检查各组小鼠血清中白细胞介素(IL)-2及IL-4质量浓度,计算IL-2/IL-4值.于初次免疫后17周末处死重组质粒注射组小鼠,取甲状腺及眼眶组织制作病理切片,采用苏木精-伊红染色法检测标本组织中炎性细胞浸润情况,对有炎性细胞浸润的标本进行免疫组织化学检测,计算B细胞特异标志物CD20阳性细胞(B)与T细胞特异标志物CD3ε阳性细胞(T)的比值,B∶T＞1.0者为Th2反应,相反者为Th1反应.结果 在第2次和第3次注射后,重组质粒注射组小鼠血清中IL-2质量浓度明显低于空白对照组、脂质体注射组、空质粒注射组,差异均有统计学意义(均P＜0.05),但组间小鼠血清IL-4质量浓度差异无统计学意义(P＞0.05);重组质粒注射组小鼠在第2次、第3次免疫后血清IL-2质量浓度明显低于免疫前及第1次免疫后,差异均有统计学意义(注射前:P=0.009、0.019;第1次注射后:P=0.002、0.004),而处死时小鼠血清IL-2质量浓度有所回升,明显高于第3次免疫后IL-2质量浓度[(44.31±1.77) pg/ml与(42.43±2.29) pg/ml],差异有统计学意义(P=0.031).空白对照组、空质粒注射组、脂质体注射组、重组质粒注射组第2次、第3次注射后血清IL-4质量浓度及IL4/IL2值均明显高于注射前和第1次注射后,其处死时重组质粒注射组小鼠血清IL-4质量浓度明显高于第3次注射后,差异均有统计学意义(均P＜0.05).处死时重组质粒注射组苏木精-伊红染色有炎性细胞浸润的7只小鼠12个眼眶标本中4个眼眶B∶T值＞1.0. 结论 采用脂质体包裹的TSH受体胞外段基因重组质粒免疫同系雌性BALB/c小鼠可成功建立GO动物模型,重组质粒注射组小鼠在初次免疫后17周内以Th1型反应为主,小鼠第2次免疫后免疫平衡开始向Th2型转变.     

IL-17A-OVA疫苗对实验性自身免疫性葡萄膜炎的影响

 目的 研究IL-17A-OVA多肽疫苗对于实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）的影响。设计 实验研究。 研究对象  30只C57BL/6小鼠。方法  制备IL-17A-OVA疫苗。将30只C57BL/6小鼠随机分为疫苗组、佐剂组及环孢素组3组,每组10只,佐剂组及疫苗组提前免疫小鼠,第10周时三组小鼠同时用光感受器间维生素A类结合蛋白（IRBP）诱发EAU动物模型。环孢素组造模成功后环孢素连续灌胃2周。HE染色观察小鼠眼球活组织切片,ELISA方法检测小鼠血清中IL-17A、IL-17A特异性抗体、IL-6及IL-23水平。主要指标 小鼠血清中IL-17A、IL-17A特异性抗体、IL-6及IL-23水平。结果 组织病理学显示疫苗组、环孢素组与佐剂组组织病理学评分均有显著性差异（佐剂组评分较高）,疫苗组与环孢素组组织病理学评分无显著性差异;血清中IL-17A水平疫苗组（25.785±4.677 pg/ml）与环孢素组（23.129±3.940 pg/ml）均较佐剂组（33.774±6.478 pg/ml）显著降低（F=8.125,P=0.003）;IL-17A特异性抗体水平疫苗组（106.379±12.603 pg/ml）较环孢素组（59.431±8.626 pg/ml）及佐剂组（56.712±4.214 pg/ml）显著升高（F=63.008,P=0.000）,环孢素组与佐剂组无显著性差异;血清中IL-6水平疫苗组（41.124±4.959 pg/ml）与环孢素组（29.418±3.34 7 pg/ml）均较佐剂组（49.329±8.768 pg/ml）显著降低（F=18.603,P=0.000）;IL-23水平环孢素组（73.492±12.324 pg/ml）较佐剂组（109.770±20.848 pg/ml）及疫苗组（100.893±13.467 pg/ml）显著降低,疫苗组与佐剂组无显著性差异（F=4.916,P=0.018）。结论 IL-17A-OVA疫苗可通过产生IL-17A特异性抗体在减轻EAU的炎性反应中起到一定的作用,该疫苗可能成为自身免疫性葡萄膜炎治疗的新方法。（眼科,2017,26： 34-38）     

NYD-SP15基因的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:克隆NYD-SP15基因,构建融合表达载体,在大肠杆菌中表达,并制备抗体。方法:PCR技术扩增NYD-SP15全长开放阅读框,克隆入原核表达载体PET28a,转化大肠杆菌感受态细胞,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后收集菌体蛋白,行SDS-PAGE电泳。将此融合蛋白Ni柱纯化后免疫BALB/C小鼠,Western blotting鉴定。结果:成功地构建了PET28a-NYD-SP15原核表达质粒,并获得了高效表达NYD-SP15的BL21菌株,表达的His标签融合蛋白,分子量为58kDa左右,经免疫小鼠获得了抗NYD-SP15抗体。经Western blotting法分析,抗体为NYD-SP15特异性抗体。结论:构建的NYD-SP15基因的原核表达载体,体外高效表达蛋白,免疫小鼠获得抗NYD-SP15抗体,将为眼部增殖性视网膜病变(PVR)的研究及治疗奠定坚实的基础。     

白细胞介素17中和性抗体对角膜移植排斥反应的抑制作用

背景白细胞介素17（IL-17）是一种促炎性细胞因子,在多种器官移植免疫排斥反应和自身免疫性疾病中发挥致病作用。IL-17拮抗剂在器官移植排斥反应中的作用被广泛研究,但其对角膜移植后排斥反应防治作用的研究较少。目的探讨抗小鼠IL-17单克隆抗体对小鼠角膜移植排斥反应的抑制效果。方法选取8～10周龄C57BL／6小鼠25只和BALB／c小鼠50只,将直径2min的C57BL／6小鼠双眼中央角膜作为供体角膜移植到50只BALB／c小鼠右眼角膜植床上,11,0尼龙线间断缝合8针,建立小鼠角膜移植模型。将建立的40只角膜移植小鼠模型按随机数字表法随机分为2个组,术后腹腔内分别注射小鼠IL-17中和性抗体（IL-17中和性抗体组）或同型对照抗体（同型对照抗体组）,并于术后不同时间点根据Plskova等的标准对受体角膜植片的炎症反应情况进行评分,≥5分为发生排斥反应。应用免疫荧光组织化学法检测受体植片炎性细胞的浸润;用逆转录PCR法对植片中的炎性细胞进行定量;应用ELISA法分析两组受体小鼠Th1、Th2和Th17相关细胞因子在脾脏中的表达情况。结果与同型对照抗体组相比,IL-17中和性抗体可以提高角膜植片的存活率（P〈0．05）。IL-17中和性抗体组受体植片中性粒细胞、CD4＋T淋巴细胞和CD8＋T淋巴细胞mRNA含量分别为2．22±0．10、1．64±0．04、1．32±0．10,明显低于同型对照抗体组的3．61±0．08、2．69±0．06、2．17±0．04,差异均有统计学意义（P=0．000、0．000、0．000）。同型对照抗体组受体小鼠脾脏中γ-干扰素（IFN-γ）、IL-12p40和IL-17质量浓度分别为（741．48±10．51）、（1156．90±69．93）、（366．13±7．93）ng／L,明显高于IL-17中和性抗体组的（529．80±13．83）、（539．58±10．74）、（173．70±8．11）ng／L,差异均有统计学意义（P=0．000、0．001、0．000）。结论中和IL-17的生物学活性可以在一定程度上抑制同种异体角膜移植术后的免疫排斥反应。     

局部使用作用于肿瘤坏死因子α的反义寡核苷酸对实验性小鼠单疱病毒性脉络膜视网膜炎的影响

目的 观察局部使用作用于肿瘤坏死因子α（TNF-α）的反义寡核苷酸对实验性单疱病毒性脉络膜视网膜炎病理过程的影响。 方法 将50只BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组，每组25只。将单纯疱疹病毒-Ⅰ型（HSV-Ⅰ）注入所有小鼠右眼（注射眼）前房内，建立单疱病毒性脉络膜视网膜炎的小鼠模型。实验组中分别于HSV-Ⅰ型感染前1 d，感染后1、4 d，将异硫氰酸荧光素标记的作用于TNF-α的反义寡核苷酸2 μl注射于感染小鼠的左眼（非注射眼）球结膜下;对照组则于相同的时间段内注射等量的磷酸盐缓冲液于感染小鼠的左眼（非注射眼）球结膜下，观察两组小鼠眼部的炎症改变并根据有无前房炎症反应、瞳孔和虹膜血管扩张、白内障形成、玻璃体混浊等行临床评分。于病毒感染后10 d处死所有小鼠，观察其组织学变化并采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定小鼠脉络膜视网膜的TNF α含量。 结果 感染后，两组小鼠右眼均表现为急性炎症改变;实验组小鼠左眼炎症反应临床评分明显小于对照组。组织学观察结果:对照组有12只小鼠左眼表现程度不等的坏死性脉络膜视网膜炎，实验组有2只小鼠左眼表现为轻度的脉络膜视网膜炎，两组间视网膜、脉络膜及睫状体部位炎性细胞计数差异有统计学意义（P＜0.05），而前房、玻璃体腔及虹膜部位无明显差别（P＞0.05）。ELISA测定结果:实验组脉络膜视网膜TNF-α含量为（60±1.25） pg，对照组脉络膜视网膜TNF-α含量为（305±1.03）pg，两者相比差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论 采用作用于TNF-α的反义寡核苷酸局部治疗小鼠单疱病毒性脉络膜视网膜炎，能明显降低感染小鼠眼内细胞因子TNF-α的含量，减轻眼内脉络膜视网膜炎症反应。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 245-248)     

白细胞介素10对小鼠单纯疱疹性角膜基质炎作用的实验研究

研究白细胞介素10(IL-10)在小鼠单纯疱疹性角膜基质炎(herpetic stromal keratitis,HSK)中的作用。方法雌性BALB／c小鼠80只分为2组,每组40只;将单纯疱疹病毒1型接种于小鼠角膜上建立HSK动物模型;分别于鼠角膜接种病毒前的6h、当日及接种后2、4d,向实验组鼠的角膜内注射重组IL-10 20ng,腹腔内注射鼠重组IL-10 500 ng;对照组同步注射生理盐水;观察IL-10对小鼠HSK的发病率、临床特征、角膜病毒滴度、角膜细胞因子含量、角膜病理改变及迟发型超敏反应(DTH)的影响。结果IL-10降低了HSK发病率,减轻了HSK角膜混浊程度、角膜新生血管化程度及角膜内炎性细胞浸润,降低了角膜内IL-2和IL-6的含量,抑制了鼠的DTH反应。IL-10不影响病毒在角膜内的复制和清除。结论IL-10可抑制鼠的DTH反应和HSK的发病进展。     

乳酸脱氢酶A促进人脉络膜黑色素瘤细胞的生长

目的　成功构建带有Flag标签的人乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A,LDHA）的真核表达载体,初步检测LDHA基因对人脉络膜黑色素瘤（choroidal melanoma,CM）MUM-2B细胞生长功能的影响。方法　将军事科学院传代培养的人CM系随机分为实验组和对照组,实验组MUM-2B细胞瞬时转染构建成功带有Flag标签的人LDHA重组质粒（Flag-LDHA）,对照组MUM-2B细胞瞬时转染Flag空载质粒;以带有GST标签的Flag-LDHA为模板,采用聚合酶链反应（PCR）技术扩增LDHA基因,并将其插入到Flag载体,应用菌液PCR、双酶切和测序方法鉴定重组质粒,鉴定成功后瞬时转染人CM,通过Western blot鉴定其表达;CCK8法检测并绘制生长曲线。结果　PCR技术扩增得到长约1000 bp的LDHA基因的编码区序列,并成功克隆至Flag载体上;与对照组相比,实验组菌液PCR结果为阳性,双酶切鉴定结果为切开两条长约4000 bp的Flag载体和1000 bp的LDHA基因条带,测序鉴定结果为插入的序列与LDHA基因的编码序列完全一致。Western blot检测结果显示,与对照组相比,实验组MUM-2B细胞成功表达LDHA蛋白;CCK8法检测结果显示,实验组MUM-2B细胞较对照组MUM-2B细胞生长快。结论　成功构建了Flag-LDHA真核表达载体,并发现LDHA基因能够促进人CM MUM-2B细胞的生长,为研究LDHA在人CM的发生发展中的功能奠定基础。     

丙酮酸激酶M1（PKM1）对眼黑色素瘤细胞迁移的影响

目的　构建带有pXJ-40-myc标签的丙酮酸激酶M1（pyruvate kinase M1,PKM1）基因真核表达载体,并初步探讨PKM1对眼黑色素瘤的影响。方法　将传代培养的眼B16黑色素瘤细胞随机分为实验组（转染pXJ-40-myc-PKM1重组质粒）和对照组（转染pXJ-40-myc空载质粒）;以人肝cDNA文库为模板应用PCR扩增出PKM1基因的CDS编码区序列,应用菌液PCR、双酶切鉴定,分别将pXJ-40-myc-PKM1重组质粒和pXJ-40-myc空载质粒瞬时转染眼B16黑色素瘤细胞,Western blot检测其表达,应用划痕实验法检测PKM1对眼B16黑色素瘤细胞转移的影响。结果　PCR技术扩增出长1800 bp的PKM1基因,与预期大小一致;与对照组相比,菌液PCR结果为阳性,双酶切切出的条带分别为4000 bp和1800 bp;与对照组相比,Western blot检测结果为重组质粒pXJ-40-myc-PKM1在眼B16黑色素瘤细胞成功表达。与对照组相比,划痕实验结果为重组质粒pXJ-40-myc-PKM1抑制眼B16黑色素瘤细胞的迁移。结论　成功构建了pXJ-40-myc-PKM1真核表达载体,并证明该基因抑制眼B16黑色素瘤细胞的迁移。     

Construction of the Enhanced Yellow Fluorescent Protein Expression Vector Carrying IFN-γ Gene

Purpose: To construct the enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) vector carryinginterferon-γ gene (ifn-γ) in order to provide an ideal reporter in the expression of ifn-γand location of protein in vitro and in vivo.Method: According to the nucleotide sequence of ifn-r gene, a pair of oligonucleotideswas designed as primer whose two end contained nucleotide sequence of EcoR V and NotI restriction endonuclease respectively. The gene encoding for inf-γ was amplified usingPCR technique. After the PCR product was retrieved and purified, it was digested withEcoR V and Not I restriction endonuclease, and then cloned into the plasmidpIRES-EYFP. The recombinant plasmid pIRES-EYFPIFN-γ was identified by restrictionendonuclease enzyme analysis and DNA sequence analysis.Results: The ifn-γ was successfully amplified and verified by partial DNA sequenceanalysis. The recombinant plasmid was correctly screened.Conclusion: The EYFP expression vector carrying ifn-γ gene was successfully established.Thi     

Construction of the Enhanced Yellow Fluorescent Protein Expression Vector Carrying IFN—γ Gene

Purpose:To construct the enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) vector carrying interferon-γ gene(ifn-γ)in order to provide an ideal reporter in the expression of ifn-γand location of protein in vitro and in vivo.Method:According to the nocleotide sequence of ifn-γ gene,a pair of oligonucleotides was designed as primer whose two end contained nucleotide sequence of EcoR V and Not I restriction endonuclease respectively .The gene encoding for ,inf-γ was amplified using PCR technique After the PCR product was retrieved and purified,itwas digested with EcoR V and Not I restiction endonuclease,and then cloned into the plasmid p IRES-EYFP.The recombinant plasmid p IRES-EYFPIFN-γ was identified by restriction endonuclease enzyme analysis and DNA sequence analysis .Results:The ifn-γ was successfully amplified and verified by partial DNA seuqence analysis.The recombinant plasmid was correctly screened.Conclusion:The EYFP expression vector carrying ifn-γ gene was successfully established.This research work has formed a base for monitoring the ifn-γ gene expression and protein positon in living cells.Eye Science 2001;17:154-157.     

单纯疱疹病毒I型截短糖蛋白B基因序列的克隆及鉴定

目的构建单纯疱疹病毒I型（herpes simplex virusI，HSV—I）SM44株截短糖蛋白B基因序列，为研制联合基因疫苗奠定基础，用于角膜炎的防治。方法利用聚合酶链反应（polymerase chain response，PCR）技术从感染HSV—I SM44株的vero细胞中扩增出HSV-gBt编码基因，经双酶切鉴定后将目的基因定向插入真核表达质粒pcDNA，载体中，构建出重组真核表达质粒pcDNA3-gBt，并对其进行酶切分析和测序鉴定。结果对pcDNA3-gBt双酶切后，电泳可见目的基因（1．5kb）和线性质粒pcDNA3（5．4kb）两条带；测序结果表明，克隆基因插入方向正确，与基因库中登录的HSV-1 F株gB基因序列比较，同源性达99．5％。结论经证实成功地构建了重组真核表达质粒pcDNA3-gBt，为进一步研究其免疫学效应及构建病毒糖蛋白联合疫苗并最终用于单疱病毒角膜炎的预防和治疗奠定理论基础.     

人TGFBI基因克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆人TGFBI基因,并构建其真核表达载体.方法:通过RT-PCR从供体角膜移植术后留下的角膜组织中克隆人TGFBI基因全长编码区,将该DNA片断亚克隆到克隆载体pMD18-T中,进一步通过和SalI双酶切将目的片断定向克隆至真核表达质粒载pCI中.经PCR,酶切和序列测定方法鉴定重组质粒.结果:获得了人TGFBI的编码基因,并成功建了其真核表达载体.结论:人TGFBI基真核表达质粒的成功构建并鉴定.     

细菌内同源重组法构建LEDGFp52基因腺病毒载体及体外表达

目的: 构建表达人类晶状体来源的上皮生长因子 p52(LEDGFp52)重组腺病毒载体,检测 LEDGFp52 重组腺病毒能否在真核细胞中有效表达目的基因。方法: 将 LEDGFp52 基因片段亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack- CMV上构建腺病毒穿梭载体 pAdTrack- CMV-LEDGFp52,将腺病毒穿梭载体 pAdTrack- CMV- LEDGFp52 与5 型腺病毒骨架质粒 pAdeasy- 1 共转染 BJ5183 细菌, 经细菌内同源重组产生携带 LEDGFp52 基因的重组腺病毒载体 pAd- LEDGFp52, 将 pAd- LEDGFp52 经脂质体法转化293 细胞包装产生重组腺病毒 Ad- LEDGFp52, 将 Ad-LEDGFp52 体外转染 293 细胞, CPE 法及 westernblot 观察目的基因的表达。结果: 构建了表达 LEDGFp52 基因的重组腺病毒质粒, E.coli 内成功同源重组腺病毒, 在 293 细胞内包装产生重组腺病毒 Ad- LEDGFp52, 滴度可达 5×1012 pfu/L。在真核细胞中有效表达目的基因 LEDGFp52, 出现显著的 CPE 效应。结论: 成功构建表达 LEDGFp52 的重组腺病毒载体, 为进一步进行 LEDGF p52 基因功能的研究提供了实验基础。     

大鼠癌钙调蛋白基因原核表达载体的构建及表达

目的 在原核表达载体中构建癌钙调蛋白（OM）基因,并对构建的原核表达质粒进行表达和鉴定.方法 取SD大鼠6只,提取腹腔巨噬细胞并活化,提取总RNA,设计引物对OM基因进行RT-PCR扩增.通过中间载体pUC57进行目的 基因克隆,将阳性克隆质粒酶切,与原核表达载体pET-22b（＋）连接,转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α,菌检PCR筛选阳性克隆后小量提取质粒,送样行核苷酸序列分析鉴定.成功构建的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组体的表达,并用Western blot鉴定表达产物.结果 琼脂糖凝胶电泳获得目的 基因OM,大小为350 bp左右,与预期的目的 基因大小一致.构建的重组质粒pET-22b（＋）/OM菌检PCR获得长度为500 bp左右的阳性克隆,与预期大小一致.抽提质粒经核苷酸序列分析后表明,克隆的片段与OM基因序列一致.在IPTG的诱导下,重组体表达出分子量约11.7 kD的表达产物,Western blot结果证实其为目的 蛋白.结论 实验成功构建了OM基因原核表达载体及其表达,为该蛋白促进视神经损伤后再生的研究奠定了基础.     

视网膜特异性表达人血管内皮生长因子 基因载体的构建

目的构建在视网膜组织特异性表达的人血管内皮生长因子（VEGF）₁₆₅基因。方法用聚合酶链反应(PCR)方法从BLAB/C鼠全基因组扩增能在视网膜组织特异性表达的rho启动子，经限制性内切酶纯化后克隆于质粒pcDNA^3.1+-VEGF₁₆₅中，建立重组质粒pcDNA^3.1+-rho-VEGF₁₆₅，通过限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确重组质粒pcDNA^3.1+-rho-VEGF₁₆₅,由jetPEI介导转染人视网膜色素上皮细胞和人脐静脉内皮细胞，并通过免疫组织化学染色以及绘制细胞生长曲线检测在人视网膜色素上皮细胞和人脐静脉内皮细胞中VEGF蛋白的表达。结果在人视网膜色素上皮细胞中，重组质粒pcDNA^3.1+-rho-VEGF₁₆₅比质粒pcDNA^3.1+-rho-VEGF₁₆₅的VEGF蛋白表达强，在人脐静脉内皮细胞，两者的表达量无明显差别。结论pcDNA^3.1+-rho-VEGF₁₆₅载体的构建为进一步研究VEGF在视网膜新生血管形成中的致病机理提供基础材料，并为进一步建立视网膜特异性表达VEGF转基因鼠模型建立了基础。(中华眼底病杂志,2005,21:106-109)