基因芯片技术

基因芯片 (又称ＤＮＡ芯片、生物芯片 )是随着人类基因计划的逐步实施和分子生物学的迅猛发展应运而生的。基因芯片技术综合了分子生物学、半导体微电子、激光、化学染料等领域的最新科学技术〔1〕,是当今世界高度交叉、高度综合的前沿科学与研究热点。基因芯片是将预先设计好的寡核苷酸或基因(ｃＤＮＡ)片段有序地高密度地 (点与点之间的距离一般小于 5 0 0 μｍ)排列在玻璃、硅或尼龙膜载体上 ,采用高速打印或光刻合成技术制成的ＤＮＡ微点阵〔1～ 4〕。样品ＤＮＡ/ＲＮＡ通过ＰＣＲ扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子 ,与微阵列杂交后…     

DNA芯片技术及其应用

随着人类基因组计划 (ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅｐｒｏｊｅｃｔ;ＨＧＰ)和分子生物学的飞速发展 ,各种微分析仪器和生物传感器相继出现 ,各国科学家将微加工、电子、材料等学科新的研究成果应用于基因芯片 ,它可以同时、准确、快速地分析数以万计的基因组信号。基因芯片的发展和应用将给生命科学、医学、化学、新药开发等领域带来一场革命。1　基因芯片的研究概况基因芯片又称ＤＮＡ芯片 (ｃＤＮＡ ｃｈｉｐ) ,生物芯片(Ｂｉｏｃｈｉｐ) ,ＤＮＡ微阵列 (Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ) ,寡核苷酸微芯片 (Ｏｌｉｇｏｎｕ ｃｌｅｏｔｉｄｅｍｉｃｒｏｃ…     

基因芯片技术在创伤骨科研究领域的应用进展

基因芯是将大量的DNA片段按预先设计的排列方式固化在载体表面，并以此为探针，在一定的条件下与样品中待测的靶基因片段杂交，通过检测杂交后的信号，实现对靶基因信息的快速检测。基因芯片可以分为很多种类，常见并广泛应用的有cDNA微点阵和寡核苷酸原位合成芯片。基因芯片能对微量样品中的核酸序列进行检测和分析，其高通量、快速、并行化采集生物信息的特点更是优于其他传统的技术方法。笔者概述了近年来基因芯片技术在骨科创伤机制、创伤修复及在骨组织工程领域研究中的应用进展。     

乙型肝炎、丁型肝炎病毒联合诊断芯片制备的初步研究

目的制备联合检测乙型肝炎病毒(HBV)、丁型肝炎病毒(HDV)基因芯片并进行杂交验证。方法利用Primer Premier 5．0分别针对HBV、HDV基因保守区域设计多对PCR引物,扩增后的产物克隆至pMD18-T载体,提取阳性克隆质粒进行测序分析鉴定。用PixSys5500芯片打印仪将PCR产物打印在氨基修饰的玻片上制备成检测芯片。样品荧光标记采用限制性显示(RD)技术,标记后进行杂交验证分析。结果序列分析表明,运用PCR技术得到的多个基因片段均属于HBV、HDV特异基因。杂交结果显示,敏感性、特异性、重复性等指标均佳。结论利用PCR扩增产物作为探针制备HBV、HDV联合诊断芯片是一种快速、简便的实用方法,有着广阔的应用前景;利用RD技术标记样品可提高多种肝炎病毒混合检测的敏感性。     

人乳头瘤病毒分型长链寡核苷酸芯片的制备

目的 制备用于人乳头瘤病毒（HPV）初步检测和分型的长链寡核苷酸基因芯片。方法 对4型HPV（6,11,16,18）全基因组序列进行分析,设计特异性高、熔解温度（Tm）和GC含量相近的HPV型特异性长链寡核苷酸探针,点样制备成寡核苷酸基因芯片,利用限制性显示技术对HPV样品进行荧光标记,并将标记好的样品与芯片杂交,以了解寡核苷酸基因芯片在HPV病毒检测和分型中的作用。结果 荧光标记的HPV样品与多个型特异性HPV探针杂交有明显的荧光信号,可以根据杂交结果进行初步的分型检测。结论 采用设计合理的60mer寡核苷酸基因芯片可以从基因水平实现对HPV的检测和分型。     

基因芯片技术检测10种烈性RNA病毒

目的 利用基因芯片技术检测包括披膜病毒科甲病毒属、黄病毒科黄病毒属、布尼亚病毒科汉坦病毒属及SARS病毒等10种烈性RNA病毒。方法 设计了甲病毒属的属保守区通用引物和黄病毒属的通用引物,与布尼亚病毒及SARS病毒的引物一起用于扩增靶核酸。另外,在通用引物所能扩增的区域内设计每种病毒的特异引物,利用该引物通过PCR反应制备cDNA克隆探针,在判定其特异性后,制备氨基化探针。对探针浓度、杂交温度、杂交时间、不同杂交液及杂交后芯片的洗涤方法进行了优化。结果核酸探针浓度为0．3ug／ul时,可获得杂交信号;在杂交液终浓度含20％甲酰胺、杂交60℃、1．5h的条件下,可分别获得以上10种病毒的特异杂交信号。利用多重PCR扩增靶序列时,可获得2种或4种混合病原体的特异性杂交信号。结论 利用基因芯片技术检测病毒性病原体是可行的,关键在于设计合适的引物及探针序列。     

人兽共患病病毒基因芯片检测敏感性的测定

目的 测定人兽共患病病毒基因芯片检测的敏感性,为建立高通量的人兽共患病病毒检测基因芯片提供依据. 方法 以黄病毒属的日本脑炎病毒(JBEV)作为检测敏感性的模型,以随机PCR扩增法扩增病毒基因组,然后将扩增产物标记荧光染料后与基因芯片进行杂交,以两种方式测定芯片的敏感性,即最低检出核酸量和最低检出病毒TCID50,量.最后,与特异PCR敏感性比较,评估本芯片的检测敏感性. 结果 人兽共患病病毒基因芯片至少可以检测出300ng的随机PCR产物核酸量.对病毒的检测敏感性可以达到10倍稀释的TCID50病毒量(即每200μl含有105TCID50的病毒量),与特异PCR检测敏感性相当. 结论 人兽共患病病毒芯片技术达到了较高的检测敏感性;建立高通量的人兽共患病病毒检测基因芯片技术具有可行性与实用性.     

基因芯片技术及其在体育科研中的应用展望

基因芯片是指应用原位合成或微量点样等方法,将大量cDNA片段、肽核苷酸或寡核苷酸探针有序地固化于支持物(如玻璃片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等)的表面,组成密集二维分子排列,然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交,通过激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机等特定仪器对杂交信号的强度扫描分析,从而获得大量的基因序列或表达信息[1].基因芯片的突出特点在于高度并行性、多样性、微型化和自动化.高度的并行性不仅可以大大提高实验的进程,并且有利于基因芯片技术所展示图谱的快速对照和阅读;多样性是指单个芯片中可以进行样品的多方面分析,从而提高分析的精确性,避免因不同的实验条件产生的误差;微型化是当前芯片发展的趋势,其优势是减少试剂用量和减少反应体积,从而提高样品浓度和反应速率.高度自动化可以降低制造芯片的成本和保证芯片的制造质量不易波动.另外,与计算机相连的图像分析系统使研究结果更客观、准确.同时由于生物信息学的迅速发展,为基因芯片的研究提供了物质基础[2].目前,该技术已应用于基因表达分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序、个体化医疗等.此技术为"后基因组计划"时期基因功能的研究及现代医学科学及医学诊断学的发展提供了强有力的工具[1,3].     

基因芯片结合可环化探针对单碱基突变的检测

目的：将基于连接反应的可环化探针(circularizable oligonucleotide probe，C-probe)技术用于基因芯片对单碱基突变的检测。方法：可环化探针是一种检测核酸分子中单碱基突变的线性寡核苷酸分子，中间部分是通用引物结合区(约40mer)，5’端与3’端是两段与待检测的DNA分子中靶序列互补的目标序列识别区(各约20mer)。与靶序列互补结合后，可环化探针的两个末端在空间靠近并在DNA连接酶的作用下连接形成环状分子，利用荧光分子标记的通用引物对连接产物进行PCR扩增，再利用基因芯片检测荧光标记的PCR产物，从而确定所检测的核苷酸位点的性质。本实验以检测CYP3A4基因外显子5中14026位点的单核苷酸多态性为例，优化了连接反应、荧光标记通用引物的PCR扩增以及探针杂交检测等条件，并用该方法对合成模板和人基因组DNA标本进行检测。结果：以合成的寡核苷酸序列为模板进行10倍系列稀释，确定可环化探针的检测灵敏度，PCR产物的凝胶电泳结果表明，检测灵敏度达到10^3拷贝；可环化探针对合成的野生型和突变型模板具有良好的区分效果。用该方法检测人基因组DNA标本，芯片检测结果与测序结果符合，证实了该方法的可行性。结论：连接反应是最具特异性的酶促反应，将其与基因芯片技术结合用于单碱基突变检测，有助于简化荧光标记过程，提高检测结果的准确性。     

HIV检测长寡核苷酸芯片的研制和临床初步应用

目的 研制人类免疫缺陷病毒(HIV)快速筛查的寡核苷酸芯片并初步应用于临床。方法 以HIV2个基因型(包括9个亚型)的32株典型性代表株和HIV-2特有的vpx序列的保守序列为靶序列,设计长寡核苷酸探针,并制备成Oligo芯片。样品经随机特异性引物PCR标记后与芯片杂交,PCR产物同时进行测序分析。结果 1例HIV患者芯片杂交结果阳性,20名健康对照血清均为阴性。阳性标本的序列分析表明,芯片杂交结果符合测序的分型结果。结论 此芯片可初步用于检测血清HIV RNA,并对HIV基因(亚)型进行分析。     

小鼠运动性疲劳相关基因筛选的初步研究

目的：运用基因芯片技术筛选运动性疲劳的相关基因。方法：将小鼠２３０４点阵的基因芯片中的２２０１条待研究基因，与对照组和疲劳组小鼠脑组织中抽提的ｍＲＮＡ并被Ｃｙ３和Ｃｙ５逆转录荧光标记制成的ｃＤＮＡ混合探针杂交，通过芯片扫描仪对其荧光强度进行扫描，经计算机进行分析。结果：在待研究的２２０１条基因中，与中枢疲劳相关的１１７条基因具有显著性表达差异，其中上调表达的基因有６３条，下调表达的基因有５４条。结论：应用基因芯片技术可同时检测与运动性中枢疲劳相关的多个基因的差异表达，具有高通量、并行性和快速准确等优点。     

人β—干扰素在杆状病毒载体与Sf细胞体系中的表达

采用苜蓿尺蠖核多角体病毒ＤＮＡ中多角体蛋白基因启动子及其前后序列作为转移载体，将人β－干扰素（ＨｕＩＦＮ－β）基因插入转移载体ｐＵＡｃ－５，构建成ｐＡｃ－ＩＦＮ－β载体。该质粒ＤＮＡ与野生型ＡｃＮＰＶ ＤＮＡ经ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ共转染秋粘虫传代细胞（Ｓｆ９细胞），利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征，进行病毒空斑筛选。用核酸杂交方法鉴定出携带ＨｕＩＦＮ－β基因的重组病毒。用重组病毒感染Ｓｆ９细胞，     

中国大陆庚型肝炎病毒结构区与非结构区部分cDNA基因的序列分析

作者在建立检测庚型肝炎病毒酶免疫和ＰＣＲ技术的基础上，将抗－ＨＣＶ上阳性病人血清经逆转录－巢式ＰＣＲ分离部分ＨＧＶｃＤＮＡ片段，用与ＨＧＶ基因互补的特异寡核苷酸引物进行双脱氧核苷酸链末端终止法－ＰＣＲ直接测序。结果表明，中国大陆ＨＧ－３０２Ⅰ株部分ｃＤＮＡ序列与Ｌｉｎｎｅｎ等报道的ＨＧＢ美国株ｃＤＮＡ序列有极高的同源性。     

人类致病病毒属水平基因筛查芯片的制备及其在黄病毒属检测中的初步应用

目的：制备人类致病病毒属水平高通量筛查用基因芯片，并通过检测黄病毒属病毒初步验证其筛查效果。方法：利用Clustal W和BLAST软件设计针对人类致病病毒的属特异性寡核苷酸探针，对探针浓度、杂交温度、杂交时间、不同杂交液及杂交后芯片的洗涤方法进行优化。分别用特异或随机PCR方法从病毒感染的细胞培养上清中扩增病毒核酸，在扩增过程中掺入aa-dUTP并进一步偶联cy5或cy3荧光素进行标记，随后与基因芯片进行杂交，并通过荧光扫描仪对杂交结果进行分析，然后分析检测的特异性和敏感性验证基因芯片的筛查效果。结果：共设计了针对人类医学病毒的1090条寡核苷酸探针及其他阳性、阴性对照探针，其中黄病毒属共46条探针，Tm值为77，67～83．53℃，通过随机或特异PCR扩增8株黄病毒属病毒核酸，在42℃、过夜杂交的条件下，通过基因芯片方法均获得了黄病毒属特异性杂交信号，与其他属病毒之间没有非特异性交叉反应。结论：所制备的基因芯片可用于黄病毒属病毒的快速筛查，本研究为进一步建立大规模病毒性病原体的高通量筛查与鉴定技术平台提供了实验依据。     

耐万古霉素肠球菌检测基因芯片方法的建立和验证

目的：基于基因芯片技术建立一种能快速甄别粪肠球菌、屎肠球菌及万古霉素耐药基因的检测方法。方法根据GenBank中查找的2种常见肠球菌特异性基因序列（ ddl）及万古霉素耐药基因（ vanA,vanB）序列,设计与合成用于检测肠球菌的特异性基因及耐药基因的引物和探针,制备耐万古霉素肠球菌（VRE）检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增样品中的特异性基因与耐药基因片段,标记产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、化学发光法显色后进行结果分析。在优化的多重PCR体系、杂交反应和化学发光法检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏性和重复性。结果共筛选出1对通用引物、4对特异性引物和1条细菌通用探针、4条特异性检测探针。该芯片具有良好的特异性和重复性,灵敏性可达103 CFU／ml。10例临床分离株样本的芯片检测结果与药敏实验基本一致（8／10）。结论初步建立了检测VRE的基因芯片方法,利用此方法可以甄别2种VRE种类并检测其耐药基因。     

7种立克次体甄别检测基因芯片方法的建立

目的：建立一种能同时检测7种立克次体的化学发光基因芯片法。方法根据NCBI公开发表的7种立克次体的序列设计引物和探针,制备立克次体甄别检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增立克次体靶基因片段,标记的产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、化学发光显色后进行结果分析。在优化的多重PCR体系、杂交反应和化学发光检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏度、重复性。用实时荧光PCR法与芯片法分别检测莫氏立克次体梯度稀释的核酸,比较两种方法的灵敏度。制备双盲模拟样本,进一步评价芯片方法的准确性。结果该研究共筛选出1对通用引物、4对特异性引物和1条立克次体属通用探针、9条特异性检测探针。该芯片检测质粒DNA的灵敏度为1．5×102～3×103拷贝／反应,检测模拟样本的灵敏度为103～104拷贝／μl。实时荧光PCR法与芯片法检测结果一致,实时荧光PCR法比芯片法灵敏度高10倍。双盲模拟样本检测符合率为100％。结论成功建立了可同时检测7种立克次体的化学发光基因芯片检测方法,为立克次体病的临床诊断和流行病学调查提供了一种新的高通量检测手段。     

可视化基因芯片技术检测肠道病毒方法的建立

目的建立一种能同时检测10种肠道病毒的可视化基因芯片法。方法根据公开发表的10种常见肠道病毒的序列,设计病毒引物和探针,制备肠道病毒检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增样品中的病毒靶片段,标记产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、可视化显色后进行结果分析。在优化的RT-PCR体系、杂交反应和可视化检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏度和重复性。结果本研究共筛选出2对通用引物、3对特异性引物和1条肠道病毒属通用探针、9条特异性检测探针。该芯片具有较好的特异性和重复性,可检测出不低于102拷贝/μl的体外转录RNA。30例临床标本的芯片检测结果与荧光PCR法一致。结论本研究所建立的方法具有高通量、高特异性、高灵敏度等特点,因此在临床上具有潜在的应用前景,可以为肠道病毒诊断提供实验室依据。     

可视化基因芯片技术检测肠道病毒方法的建立

目的建立一种能同时检测10种肠道病毒的可视化基因芯片法。方法根据公开发表的10种常见肠道病毒的序列,设计病毒引物和探针,制备肠道病毒检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增样品中的病毒靶片段,标记产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、可视化显色后进行结果分析。在优化的RT-PCR体系、杂交反应和可视化检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏度和重复性。结果本研究共筛选出2对通用引物、3对特异性引物和1条肠道病毒属通用探针、9条特异性检测探针。该芯片具有较好的特异性和重复性,可检测出不低于102拷贝/μl的体外转录RNA。30例临床标本的芯片检测结果与荧光PCR法一致。结论本研究所建立的方法具有高通量、高特异性、高灵敏度等特点,因此在临床上具有潜在的应用前景,可以为肠道病毒诊断提供实验室依据。     

现代生物技术进展给核医学的启示

我在美国Ｙａｌｅ大学博士后培训期间 ,初步了解和掌握了一些生物医学技术发展的相关技术。在此将与核医学有关的新技术简要介绍如下 ,期望为我国核医学发展有所帮助。一、转基因技术为疾病的诊断和治疗提供了机遇分子生物学在临床医学中的两个重要应用是基因诊断和基因治疗。ｃＤＮＡ表达文库、ＤＮＡ杂交分子探针筛选文库和ＤＮＡ测序技术的开发应用可谓分子生物学的一场革命。早在 1978年Ｂｒｏｏｍｅ等[1] 就创建了放射性核素标记抗体筛选多种质粒载体中的重组克隆技术。将外源基因导入靶细胞或组织的基因治疗将成为新世纪疾病治疗的主…     

应用DNA芯片技术结合核技术对辐射致癌分子机制的研究

DNA芯片技术是新近出现的新的基因分析方法。它是将成千上万个寡核苷酸固定在约厘米大小的硅片上,将待测材料用荧光素或同位素标记,在DNA芯片上与探针杂交,通过激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描获取杂交探针的荧光信号。该技术可用于DNA测序,转录情况分析,基因诊断与基因药物设计,突变及多肽性检测遗传作图等方面的研究。