COL5A1抑制肺腺癌转移的蛋白分泌组分析的研究

背景肺腺癌(LAC)是全球范围内癌症相关死亡的首要原因。LAC分泌组中,优先表达基因/蛋白的异常表达可能为其治疗和预后提供依据。FOLR1在多种肿瘤研究中作为治疗靶点,但在肺腺癌中未见研究。本研究拟对同一来源的具有高低转移性的两株LAC细胞系进行比较分泌组研究,在LAC的转移分泌组作为生物标志物的组中进行比较分析,进一步探究LAC转移相关早期生物标志物,为其治疗和预后提供依据。方法对同一来源的两株肺腺癌细胞系Anip973和AGZY83a进行有血清和无血清培养后提取其分泌蛋白,采用同位素标记绝对与相对定量(iTRAQ)技术进行蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团进行标记,经二维液相色谱-串联质谱(2D-MS/MS)进行所获得全部蛋白的鉴定。利用信号肽预测软件SignalP 4.0和软件共筛选出经典途径分泌蛋白。免疫印迹(Western Blot)方法分析两株细胞系分泌蛋白中COL5A1蛋白的表达变化。结果经信号肽预测软件共筛选出82个分泌蛋白,研究表明Anip973细胞系中表达高于AGZY83a细胞系的蛋白27个,AGZY83a细胞系中表达高于Anip973细胞系的蛋白55个。COL5A1在低转移细胞系AGZY83a中高表达,由此推测分泌蛋白COL5A1有抑制肺腺癌转移的作用,可以作为肺腺癌潜在的治疗和预后靶点。结论 COL5A1有抑制肺腺癌转移的作用,可以作为肺腺癌潜在的治疗和预后潜在靶点。     

重组腺病毒介导IL-2、TNF-α抗肿瘤实验研究

目的　研究腺病毒介导的细胞因子基因hIL 2、hTNF a对人肺腺癌细胞系的生物学特性的影响 ,探讨重组腺病毒的体内抗肿瘤作用。方法　将分别携带有hIL 2基因、hTNF a基因的重组腺病毒 (rAd hIL 2、rAd hTNF a)感染人肺腺癌Anip973细胞系 ,通过细胞生长实验、克隆形成实验等观察其对肿瘤细胞的作用 ;利用PCR技术对转染后的细胞进行检测并应用ELISA试剂盒检测转染后的细胞IL 2、TNF a的分泌量 ;通过肿瘤局部注射rAd hIL 2、rAd hTNF a的方法观察其在小鼠体内的抗肿瘤作用。结果　rAd hIL 2、rAd hTNF a经纯化后 ,滴度可达 10 1 0 PFU ml,当病毒为 30MOI时 ,对Anip973细胞的转染率达 90 %以上。体外转染的肿瘤细胞生长能力、克隆形成率等无明显变化。 2 4h细胞培养上清IL 2的分泌量为 5 0pg 2× 10 5细胞 ,TNF a的分泌量为 2 0pg 2× 10 5细胞。体内实验表明注射rAd LacZ、rAd hIL 2、rAd hTNF a的小鼠肿瘤生长缓慢 ,体积明显小于对照组 (P <0 0 5 ) ,生存期显著延长。结论　腺病毒介导的细胞因子基因hIL 2、hTNF a转染的肿瘤细胞形态学未见明显变化。转染hIL 2、hTNF a基因的肿瘤细胞可表达IL 2及TNF a。rAd hIL 2、rAd hTNF a重组腺病毒具有抗肿瘤作用     

应用重组基底膜侵袭技术对人肺腺癌细胞侵袭能力的研究

目的　研究RAB5A基因转染后对肺腺癌侵袭能力的影响。方法　采用重组基底膜侵袭实验 ,观察转染前后的细胞系对基底膜侵袭能力的改变。结果　转染pcDNA3.1 RAB5A正义表达载体的AGZY83 a细胞系基底膜侵袭能力增强 ,转染pcDNA3 AntiRAB5A反义RNA重组质粒的Anip973细胞系侵袭能力明显减弱。结论　RAB5A在人非小细胞肺癌的侵袭及转移特性的形成中具有重要的作用 ,RAB5A的反义分子能够有效地阻断该基因表达的翻译过程 ,在细胞内发挥预期作用。     

基底膜侵袭实验技术对人肺腺癌细胞侵袭能力的研究

目的:研究RAB5A基因转染后对肺腺癌侵袭能力的影响。方法:采用重基底膜侵袭实验,观察转染前后的细胞系对基底膜侵袭能力的改变。结果：转染PcDNA3.1-RAB5A正义表达载体的AGZY83-a细胞系基底膜侵袭能力增强,转染PcDNA3-AntiRAB5A反义RNA组质粒的Anip973细胞系侵袭能力明显减弱。结论：RAB5A在人非小细胞肺癌的侵袭及转移特性的形成中具有重要的作用,RAB5A的反义分子能够有效地阻断该基因表达的翻译过程,在细胞内发挥预期作用。     

人IL-2重组腺病毒转染人肺腺癌细胞的体外生物学特性的研究

目的 在利用COS／TPC同源重组法高效制备hIL-2重组腺病毒基础上，对感染人IL－2重组腺病毒的人肺腺癌细胞（Anip973）的体外生物学特性进行研究。方法 将携带有人IL－2基因的重组腺病毒（rAd-hIL-2）感染人肺腺癌细胞系，通过细胞生长实验、克隆形成实验、流式细胞分析、形态学检查等观察其对Anip973肿瘤细胞的作用；利用PCR和琼脂糖电泳对肺癌中人IL－2基因进行了检测。结果 rAd-hIL-2经扩增、纯化后，滴度可达10^10PFU/ml，当病毒为30MOI时，对Anip973细胞的转染率达90％以上。转染的Anip973肿瘤细胞除表面结构和超微结构有轻微变化外，其生长能力、克隆形成率及细胞周期等无明显变化。结论 腺病毒介导的细胞因子基因hIL-2转染的Anip973肿瘤细胞未见明显变化。     

人TNF-α重组腺病毒转染人肺腺癌细胞的体外生物学特性研究

目的 在利用COS／TPC同源重组法高效制备hTNF-α重组腺病毒基础上，对感染人INF-α重组病毒的人肺腺癌细胞（Anip973）的体外生物学特性进行研究。方法 将携带有人TNF－α基因的重组腺病毒（rAd-hTNF-α）感染人肺腺癌细胞系,通过细胞生长实验、克隆形成实验、流式细胞分析、形态学检查等观察其对Anip973肿瘤细胞的作用；利用PCR和琼脂糖电泳对肺癌中人TNF－α基因进行了检测。结果 rAd-hTNF-α经扩增、纯化后，滴度可达10^10PFU／ml，当病毒为30MOI时，对Anip973细胞的转染率达90％以上。转染的Anip973肿瘤细胞除表面结构和超微结构有轻微变化外，其生长能力、克隆形成率及细胞周期等无明显变化。结论 腺病毒介导的细胞因子基因hTNF-α转染的ANIP973肿瘤细胞未见明显变化，为制备肿瘤疫苗打下基础。     

人体肺腺癌细胞系AGZY83-a的细胞遗传学研究初报

体外培养肿瘤细胞系的生物学特性的研究是肿瘤病因学研究的一个重要方面。细胞遗传学特性是任何肿瘤细胞系的重要特性之一,又是一个细胞系其它生物学特性的基础。最近,我们对人体肺腺癌细胞系AGZY83-a 进行了细胞遗传学研究,现将结果初报如下。材料与方法AGZY83-a 细胞系该细胞系取自1例57岁男性肺腺癌患者肺门淋巴结组织在鞍钢铁西     

高低转移性癌细胞的粘附性比较

为了研究肿瘤细胞特性与它们的转移能力之间的关系,我们比较了高低转移性不同的细胞系的粘附特性。结果显示,高转移性的Anip[973]细胞具有较强的同型聚集能力,而低转移性的AGZY细胞对内皮及其基质的粘附较Anip[973]快。二者均无促血小板凝集活性。体外培养的集落形态两者不同,高转移性的Anip[973]具有较低的贴壁依赖性。所以,此细胞系的同型聚集及聚堆生长与转移能力增加有关。     

RAB5A正义表达载体对两种人肺腺癌细胞系粘附基底膜成份能力的影响

目的　RAB5A基因过表达与人肺腺癌细胞系Anip 973的高转移性相关 ,进一步确认该基因在人低转移肺腺癌细胞系SPC a1和人低分化肺腺癌细胞系GLC 82中的作用。方法　采用癌细胞粘附基底膜成分的测定方法 ,分析RAB5A正义真核表达载体转染后的SPC a1、GLC 82两种肺腺癌细胞系的侵袭能力的改变。结果　RAB5A正义表达载体PcDNA3 .1 RAB5A转染的SPC a1较未转染细胞与基底膜成分粘附能力明显增强 ,t检验P <0 0 1;GLC 82细胞的侵袭能力作用不明显。结论　RAB5A在侵袭转移表型形成中发挥一定的作用     

外源性p16基因对人原发性肝癌细胞生物学行为的影响及其机制

目的:探讨导入外源性p16cDNA真核表达载体对人原发性肝癌细胞系SMMC- 772 1生物学行为的影响及其分子机制。方法:构建外源性p16基因真核表达载体并转染SMMC- 772 1细胞,经G4 18抗性筛选和扩增,得到稳定的表达株,并经RT -PCR及免疫细胞化学鉴定。通过生长曲线,流式细胞术,免疫细胞化学及Western -Blot等实验方法,对转基因后肿瘤细胞生物学行为及细胞周期调控因子CDK4 ,CyclinD1及pRb进行观察。结果:转染外源性p16基因的SMMC- 772 1细胞有外源性p16基因的整合及表达,细胞生长速度明显减慢,倍增时间明显延长,G1期细胞明显多于转基因前(P <0 .0 5 ) ;免疫细胞化学显示外源性p16表达可下调CDK4及cylinD1的表达(P <0 .0 5 ) ,Western -Blot提示转染外源性p16基因后细胞中磷酸化pRb表达明显降低。结论:外源性p16基因导入人肝癌细胞株SMMC -772 1中可稳定表达并使细胞停滞在G1期,抑制细胞生长,其机制可能为下调CDK4、cyclinD1的表达和抑制pRb磷酸化有关。     

Over-Expression of the RAB5 Gene in Human Lung Adenocarcinoma Cells with High Metastatic Potential

The objective of this study is to better understand the molecular mechanism of tumor invasion and metastasis, and isolating tumor metastasis-related genes. Two human lung adenocarcinoma cell lines AGZY-83a and Anip973 were studied, Anip973 was derived from AGZY 83a ,but it manifested a very much higher metastatic potential than the parent lirie. Differential cDNA fragments were isolated by oslag the techniques of mRNA differential display, and analyzed by means of molecular cloning and sequencing. The expression of RABSA gene in clinical samples of non-small cell lung cancer was determined by RT-PCR. There were significant differences between AGZY-83a and Anip973 in gene expression, part of the differential cDNA fragments were cloned and sequenced. We found that there was over-expression of RABSA gene in the Anip973 cell line. And there was over-expression of RABSA gene in those samples of ehnlcal lung cancer showing metastasis. In conclusion, the expression or over expression of RABSA gene was associated with the metastatic phenotype of Anip973. Probably, over-expression of RABSA gene in ncaa-trmall lung cancer may serve as a diagnostic marker for metastasis.     

肺腺癌高、低转移细胞系Anip973、AGZY83-a中野生型p53基因过表达研究

目的探讨野生型ｐ５３基因及其表达产物ｐ５３蛋白在恶性肿瘤基因治疗中的作用。方法应用腺病毒为载体将野生型ｐ５３基因转入高、低转移的肺癌细胞系Ａｎｉｐ９７３、ＡＧＺＹ８３－ａ,并且对各组转染细胞进行生长曲线、原位末端标记、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ等技术检测分析。结果野生型ｐ５３蛋白的过表达对上述肺腺癌细胞系均呈现出较强的生长抑制作用,野生型ｐ５３蛋白的过表达对高转移肺癌细胞系Ａｎｉｐ９７３的抑制作用明显高于低转移细胞系ＡＧＺＹ８３－ａ。结论外源性野生型ｐ５３基因的过表达,可以有效抑制上述肿瘤细胞的增殖,同时对高转移肺腺癌细胞系的抑制作用更加显著。     

RAB5A对人肺腺癌细胞系粘附能力的影响

目的：研究RAB5A基因转染后对肺腺癌粘附能力的影响。方法：采用细胞粘附能力测定,观察转染前后细胞系粘附能力的改变。结果：转染PAB5A正义表达载体的AG2Y83－α细胞系粘附能力增强,转染反义重组质粒的Anip9n3细胞系粘附能力明显减弱。结论：RAB5A在人肺腺癌转移特性的形成中具有重要的作用。     

应用荧光染色mRNA差异展示方法从人肺腺癌细胞系中分离差异表达基因

报道一种快速，简单地从癌细胞中分离差异表达基因的改进的ｍＲＮＡ差异展示技术。选择两株具有相同的细胞来源，但具有不同转移能力的人肺腺癌细胞系ＡＧＺＹ８３ａ和Ａｎｉｐ９７３作为研究材料，利用一种灵敏度极高的ＳＹＢＲ ＾ＴＭ ＧＲＥＥＮ Ｉ荧光染料凝胶直接染色方法进行ｍＲＮＡ差异显示，对这两个细胞系的基因表达差异情况进行分析，发瑞这两个细胞染色方法进行ｍＲＮＡ差异显示，对这两个细胞系的基因表达差异情况进     

人肺腺癌耐药细胞模型的建立及生物学特性的初步鉴定

目的建立人肺腺癌耐药细胞模型Anitp973／NVB（去甲长春新碱）并鉴定其生物学特性。方法应用人肺腺癌细胞系Anip973,采用NVB逐步增加剂量法,诱导建立耐药细胞模型Anip973／NVB,观察其生长规律;用MTT法鉴定抗药性;观察细胞形态和超微结构;流式细胞技术检测其细胞周期分布;高效液相色谱法测定细胞内NVB的浓度变化。结果经MTT法鉴定Anip973／NVB细胞较Anip973细胞的NVB半数致死浓度（IC50）增大21．81倍。两细胞系的倍增时间无明显差异。光镜及电镜下观察到,两细胞系结构变化较大。经流式细胞仪测定Anip973／NVB细胞,S期细胞减少（P=0．035）而G0-G1期细胞增多（P=0．014）;高效液相色谱法检测发现Anip973细胞内药物浓度明显高于Anitp973／NVB。结论Anip973／NVB细胞是一个明确的多药耐药细胞模型,具有耐药细胞的基本生物学特性。