人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建、筛选及表达

用常规RT PCR法 ,直接从 5名丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因 ,构建噬菌体抗体Fab库。对抗体库进行 5轮吸附 洗脱 扩增的亲和选择后 ,以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体。 5轮亲和选择使特异性噬菌体抗体得到高度富集 ,抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达 96 %。对一阳性克隆在大肠杆菌中表达 ,经ELISA及Westernblot分析鉴定 ,证实成功表达出人源可溶性Fab。对抗体基因VH和VκDNA序列进行测定 ,证实所获基因为抗体可变区基因。抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCV单克隆抗体Fab段的制备 ,为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具。     

肺癌患者噬菌体抗体库的构建及抗肺癌单抗的筛选

目的　探索从人体肿瘤局部引流淋巴结扩增免疫球蛋白基因构建噬菌体抗体库及从中筛选抗肿瘤单抗的可行性。方法　从肺癌患者肺门淋巴结提取总RNA ,经逆转录 聚合酶链反应扩增免疫球蛋白重链Fd段和κ链基因 ,以pcomb3H为载体 ,构建噬菌体抗体库 ,以 2株肺癌细胞对噬菌体抗体库进行 6轮亲和筛选 ,再以人成纤维细胞进行 2轮吸附 ,以筛选出抗肺癌细胞抗体。以细胞ELISA法初步鉴定抗体活性。结果　构建成噬菌体抗体库 ,库容为 7.5× 10 7个克隆 ,κ链和Fd段基因与载体DNA的重组率分别为 10 0 % (10 / 10 )和 90 % (9/ 10 )。通过亲和筛选和吸附从中获得了能与肺癌细胞结合的人单抗。结论　从人体肿瘤局部引流淋巴结扩增免疫球蛋白基因构建噬菌体抗体库并从中筛选抗肿瘤单抗是可行的 ,以肿瘤细胞作抗原从抗体库中筛选抗肿瘤抗体是可取的。     

噬菌体呈现抗体库的构建及抗Fas—Fab抗体的研究

目的构建噬菌体抗体库,获得具有功能的抗Fas-Fab噬菌体抗体。方法以Fas重组蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠。取其脾细胞提取mRNA,采用RT-PCR方法扩增抗体基因,构建重链和κ链基因库,用重组Fas抗原对所构建的抗体库进行4轮筛选,并以ELISA法鉴定其功能。结果获得抗体重链Fd基因和κ链基因长度约700bp。构建的重链Fd基因为3.5×106的抗体重链基因库。构建的重链和κ链基因库的容量均为3.1×106。经VCSM13感染得到噬菌体的滴度为8.9×1016cFu/L的噬菌体抗体库,含有抗体重链和κ链基因的噬菌体占27％。用重组人Fas抗原进行4轮筛选,得到100％的富集,说明Fas重组抗原富集了抗Fas-Fab噬菌体抗体,经ELISA检测均有抗Fas抗体的特异性。结论制备的可溶性抗Fas-Fab抗体具有抗Fas抗体的特异性,为进一步的研究奠定了基础。     

黑素瘤患者噬菌体抗体库的构建与筛选

目的 :构建噬菌体抗体库并筛选抗黑素瘤细胞的人抗体。方法 :从 1例长期存活的黑素瘤患者的外周血中分离单个核细胞 (PBMC) ,提取总RNA ,并逆转录为cDNA。用PCR扩增多样性κ链基因和重链Fd段基因 ,分别构建κ链库和重链库 ,组合为Fab段噬菌体抗体库 ,用两种黑素瘤细胞系对抗体库进行筛选和鉴定。结果 :所构建的噬菌体抗体库的库容量达 1.2× 10 8,用两种黑素瘤细胞系进行亲和吸附筛选 ,获得针对其中 1种黑素瘤细胞系的特异性抗体。结论 :采用噬菌体抗体库技术 ,成功地从 1例长期存活的黑素瘤患者体内克隆到特异性抗黑素瘤细胞的抗体 ,为进一步的研究和应用奠定了基础     

人源抗人免疫缺陷病毒1型噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建人免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）特异性噬菌体抗体库，制备人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体。方法以半巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）从ＨＩＶ－１感染者外周血单个核淋巴细胞中扩增抗体重链Ｆｄ和轻链（ｋ）基因，与噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３连接，构建噬菌体抗体Ｆａｂ组合文库。对抗体库进行３轮吸附－洗脱－扩增的亲和选择后，以ＥＬＩＳＡ法筛选抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体，并进行ＤＮＡ序列分析和Ｆａｂ的可溶性表达。结果半巢式ＰＣＲ有效地扩增出Ｆｄ和ｋ基因，以此构建成容量为１９５×１０７的噬菌体抗体库。３轮亲和选择使特异性抗体得到高度富集，抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体阳性克隆占３２％。对一阳性克隆抗体基因ＣＨ１和ＣＬ部分ＤＮＡ序列进行了测定，并在大肠杆菌表达出可溶性Ｆａｂ。结论抗ＨＩＶ－１特异性噬菌体抗体库的构建和人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体的制备为今后筛选抗ＨＩＶ中和抗体奠定了基础，具有重要的应用价值。     

抗戊型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建与筛选

目的 :构建人抗戊型肝炎病毒 (HEV)噬菌体抗体库 ,筛选人源中和性抗HEV的单克隆抗体 (mAb)。方法 :取抗HEV抗体阳性的 6例HE患者静脉血 ,分离淋巴细胞 ,提取细胞总RNA后逆转录。用一组人IgGFab基因特异性引物 ,分别扩增IgGκ0轻链与重链Fd段基因。将κ轻链与Fd段基因先后克隆入噬菌体载体pComb3的相应位点 ,经电穿孔法转化大肠杆菌XL1 Blue ,再以辅助噬菌体VCSM13超感染 ,构建人抗HEV噬菌体抗体库。采用独特的 5轮筛选法 (逐渐降低抗原包被量 ,严格洗脱条件 ) ,以固相化的 4种含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原 ,筛选人噬菌体抗体库 ,并以ELISA鉴定噬菌体抗体。结果 :经数次电转化构建了容量为1.9× 10 7重组率为 80 %的κ轻链基因库 ;容量为 1.8× 10 7重组率为 2 0 %的Fab基因库。以含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原特异淘筛 5次 ,出现特异富集。ELISA鉴定第 5轮筛选产物 ,得到 4株与HEVORF2重组混合抗原具有较高亲和力的Fab噬菌体抗体 ,可能为中和抗体。结论 :成功地构建了人抗HEV噬菌体抗体库 ,并获得人源抗HEV特异性噬菌体抗体。     

EBV转化B型健康人B淋巴细胞构建噬菌体抗体库

目的构建人源抗红细胞A抗原单链噬菌体抗体库。方法应用EB病毒转化方法和噬菌体抗体库技术,从EB病毒转化成功的B型个体淋巴细胞中提取总RNA,逆转录合成cDNA第一条链,PCR分别扩增VH和Vκ基因,经重叠延伸拼接法(SOE)组成ScFv基因并将其克隆入pCANTAB5E,转化E.coliTG1,加入辅助噬菌体M13KO7援救,构建人源抗红细胞A抗原单链噬菌体抗体库,并测定文库的库容、滴度及ScFv基因的插入率。使用完整A型红细胞对该库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,细胞ELISA、红细胞血凝实验对所获抗体进行初步鉴定。结果所构建的噬菌体抗体库,其库容为1.2×106,噬菌体DNA中全长ScFv基因的插入率为0.90,用辅助噬菌体援救后,得到滴度为2.52×1010PFU/mL的初级噬菌体抗体库。以完整A型红细胞进行四轮淘筛,出现特异性富集。经细胞ELISA、红细胞血凝实验鉴定,得到2株与A型红细胞特异结合的ScFv噬菌体抗体。结论EB病毒转化方法联合噬菌体展示技术构建噬菌体抗体库切实可行,可进行亲和筛选以得到人源抗红细胞A抗原的基因工程抗体。     

以鼠源重链Fd片段为模板导向筛选人源性抗γ-精浆蛋白抗体轻链

目的:以鼠源抗γ-sm抗体重链Fd片段为模板,筛选人源性抗人γ-精浆蛋白抗体轻链。方法:利用RT-PCR从前列腺癌患者外周血淋巴细胞扩增出全套的人抗体轻链基因,克隆入含鼠源性抗γ-sm抗体重链Fd片段的噬粒载体pComb3X/mFd中,电转化大肠杆菌XL1-Blue后建立人-鼠杂合的Fab抗体库。通过稀释滴定、限制性酶切和随机测序,对所建杂合库的库容、重组率和多样性分别进行鉴定,以M13K07辅助噬菌体超感染,利用亲和纯化的γ-sm为抗原,对挽救展示的噬菌体抗体库进行3轮淘筛和克隆鉴定。最后对筛选出的杂合抗体进行初步的功能检测。结果:构建成功1.2×107CFU、重组率为90%、多样性好的杂合人-鼠噬菌体抗体库。利用纯化的γ-sm3轮亲和淘筛后,5个克隆成功诱导表达特异性的pIII融合抗体。ELISA进一步检测表明,5个克隆均呈特异性阳性反应,其中2个克隆亲和力较高,测序显示其所含轻链基因序列完全相同,可变区来源于IGKV4-101胚系基因家族。结论:利用鼠源Fd片段为模板,导向筛选杂合噬菌体库,成功筛选到人源性抗人γ-精浆蛋白抗体轻链。     

人源抗SARS病毒噬菌体抗体库的构建及筛选

目的: 构建人源抗SARS病毒的Fab片段抗体基因的噬菌体表面呈现文库, 筛选抗SARS病毒特异性的噬菌体抗体。方法: 用PCR扩增人Fab片段抗体基因, 连入载体pComb3内, 构建噬菌体抗体库。以固相化的SARS抗原淘筛抗体库, 并用ELISA检测噬菌体抗体结合SARS病毒的特异性。结果: 用PCR共扩增出 13条Ig基因片段。电转化构建的噬菌体抗体库的库容为 1. 3×106, Fab基因的重组率为60%。以纯化的SARS抗原淘筛 3轮, 特异性富集了抗SARS病毒的噬菌体抗体, 并用ELISA法从中筛选出了 10个结合活性好、特异性强的克隆。结论: 成功地构建了人源抗SARS病毒的组合抗体文库, 从中获得人源抗SARS病毒的特异性抗体。     

人源噬菌体Fab抗体库构建过程中引物的优化和初步鉴定

目的 优化设计一套引物，扩增全套人抗体Fd片段和L链基因，改善扩增效率，益于人源噬菌体抗体库的构建。方法 根据V-BASE数据库提供的人抗体可变区胚系基因，在其家族分类基础上，根据FR1区5’端保守序列重新分组，设计特异性的5’端扩增引物。同时对设计引物的匹配情况进行分析，并应用PCR扩增和测序反应对其扩增效果进行鉴定。结果 Fd链5’端扩增引物有5条，κ轻链有6条5’端扩增引物，而λ轻链5’和3’扩增引物有10条。分析表明，人抗体可变区胚系基因与5’引物有较好的匹配率，数目较少，匹配率较高。PCR结果显示，全部的重链及轻链引物对均能高效扩增出特异性较高的目的片段。测序结果表明PCR扩增产物具有较好的亚类和可变区家族分布。结论 优化了一套扩增全套人抗体Fd片段和L基因的引物，为人源噬菌体抗体库的构建奠定了良好的基础。     

Calculation of monoclonal antibody affinity constants directly from antibody dilution curves

A method for estimating the affinity constants of monoclonal antibody directly from antibody dilution curves is described.     

治疗性抗体的改造

市场上已有18个被FDA批准的单克隆抗体,它们用于治疗如肿瘤、移植排斥、自身免疫病、病毒感染等人类疾病。治疗性抗体代表了生物制药业发展最快的领域之一。随着技术的发展,各种形式的工程抗体被构建来改善它们的特性和效能,包括:鼠抗体人源化,提高生物学活性,如亲和力成熟,改进效应功能,改善药代动力学。文章评述了这一领域的最新进展,同时也讨论了工程抗体的免疫原性和亲和力。     

A rapid method for the determination of antibody affinity

A rapid method for estimating antibody affinity is described. To perform the assay fixed amounts of radiolabeled antigen and antibody are mixed in different total reaction volumes. The fraction of antigen bound to antibody is measured in aliquots from each reaction volume by the ammonium sulfate precipitation technique. Affinity constants can be estimated from these data graphically or by means of a microcomputer. This method is much quicker and easier to perform than traditional techniques for estimating antibody affinity.     

免疫性抗体在不孕不育妇女诊治中的作用

目的探讨抗精子抗体（AsAb）、抗子宫内膜抗体（EMAb）、抗心磷子抗体（ACAb）和抗卵巢抗体（AO-Ab）在不孕不育过程中的作用。方法采用ELISA法检测AsAb、EMAb、ACAb和AOAb。结果AsAb阳性率为29.7%,EMAb阳性率为16.3%,ACAb阳性率为15.2%,AOAb阳性率为14.1%。结论AsAb、EMAb、ACAb和AOAb和不孕不育密切相关,对女性不孕不育有一定的诊断价值。可以作为不孕不育症妇女常规检查的项目。     

Identification of HBsAg-specific antibodies from a mammalian cell displayed full-length human antibody library of healthy immunized donor

Hepatitis B immunoglobulin (HBIG) is important in the management of hepatitis B virus (HBV) infection. Aiming to develop recombinant monoclonal antibodies as an alternative to HBIG, we report the successful identification of HBV surface antigen (HBsAg)-specific antibodies from a full-length human antibody library displayed on mammalian cell surface. Using total RNA of peripheral blood mononuclear cells of a natively immunized donor as template, the antibody repertoire was amplified. Combining four-way ligation and the Flp recombinase-mediated integration (Flp-In) system, we constructed a mammalian cell-based, fully human, full-length antibody display library in which each cell displayed only one kind of antibody molecule. By screening the cell library using fluorescence-activated cell sorting (FACS), eight cell clones that displayed HBsAg-specific antibodies on cell surfaces were identified. DNA sequence analysis of the antibody genes revealed three unique antibodies. FACS data indicated that fluorescent strength of expression (FSE), fluorescent strength of binding (FSB) and relative binding ability (RBA) were all different among them. These results demonstrated that by using our antibody mammalian display and screening platform, we can successfully identify antigen-specific antibodies from an immunized full-length antibody library. Therefore, this platform is very useful for the development of therapeutic antibodies.     

抗CD3/抗CD20双特异双链抗体的生物学活性研究

目的研究抗CD3/抗CD20双特异双链抗体的生物学活性.方法采用亲和层析法纯化本室构建的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体可溶性表达产物,并用SDS-PAGE,Westernblot和分子排阻层析鉴定纯化产物;采用FACS法和玫瑰花环试验测定纯化产物与靶细胞的结合活性;采用3H-TdR掺入实验和51Cr释放试验测定该双特异双链抗体的生物学性质.结果纯化的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体具有与Jurkat(CD3+)和Daudi细胞(CD20+)的结合活性,且能同时与Jurkat和Daudi细胞结合形成玫瑰花环,并能竞争性封闭亲代鼠源性抗体HIT3a和HI47与Jurkat和Daudi细胞的结合位点;该双特异双链抗体具有促有丝分裂原作用和介导激活的T细胞杀伤Daudi细胞的活性.结论抗CD3/抗CD20双特异双链抗体具有与亲代鼠源性抗体HIT3a和HI47相同的性质,且能介导激活的T细胞杀伤表达CD20抗原的肿瘤细胞,是一个有望用于B细胞恶性肿瘤临床治疗的双特异性抗体.     

微型双功能抗体抗CD3／抗CD20的构建和表达

目的：构建和表达抗CD3／抗CD20微型双功能抗体,并测定微型双功能抗体的生物学活性。方法：采用PCR和overlap PCR方法构建抗CD3／抗CD20微型双功能抗体,并用双脱氧终止法测定DNA序列;采用亲和层析法纯化该产物,并用Western blot和分了排阻层析鉴定纯化产物;采用FACS法和玫瑰花环试验鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性。结果：DNA序列测定结果表明：抗CD3／抗CD20微型双功能抗体已构建成功,表达可溶性产物的产量达1mg/ml以上,纯化产物中二聚体的比例达90％,具有与Jurkat(CD3^ 0和Daudi细胞（CD20^ ）结合的活性,且能同时与Jurkat和Daudi细胞结合形成玫瑰花环。结论：利用Diabody形式,首次成功地构建了抗CD3／抗CD20微型双功能抗体,并获得较高表达,表达产物具有与相应2个靶抗原结合的活性。     

单克隆的抗-HBs在同系鼠体内诱导抗-HBs的观察

作者采用BALB/c鼠的抗-HBs单克隆抗体(Ab_1)作为抗原,免疫同系BALB/c小鼠,使其在自身体内产生Ab_2,观察了由Ab_2诱导的Ab_3的消长情况。经测定其血清,免疫小鼠在第7天出现Ab_2,随后第9天、第19天出现Ab_2的显著增高。Ab_3的出现是在第9天,随后在第11天,第17天和第21天出现增高现象。Ab_2与Ab_3的量的变化,呈周期性消长。一般说来,当Ab_2增高时,Ab_3减低;若Ab_2降低,则Ab_3增高。实验过程中,还发现Ab_3能与外界进入体内的HBsAg结合。上述实验中出现的Ab_2和Ab_3之间的相互刺激和相互中和的现象,表明是小鼠体内自身的抗个体型抗体的调节作用的结果,因而出现了上述周期性的动态变化,支持体内存在着一个个体型——抗个体型免疫网络的理论,本文依据实验事实,认为传统的被动免疫方法,在一定条件下,也能诱导出主动免疫。     

抗IgE抗体的诱导及其对血清IgE水平的抑制

用ＩｇＥＦｃε片段和钥孔血蓝蛋白聚合物（ＫＬＨ－ＩｇＥ）免疫小鼠，产生了内源性抗ＩｇＥ抗体，同时伴有血清ＩｇＥ含量下降。这种状况在新生小鼠可保持１２周，而在同剂量ＫＬＨ－ＩｇＥ免疫的成年小鼠体内只能保持４周。以５倍剂量免疫成年小鼠，诱导出较高水平的抗ＩｇＥ抗体，ＩｇＥ水平也显著被抑制，并保持１２周，同时，ＩｇＥ分泌细胞数也显著减少。提示诱导产生的内源性抗ＩｇＥ抗体既可加速体内ＩｇＥ抗体的清除，也可抑制ＩｇＥ抗体的产生。     

反复自然流产的免疫因素分析探讨

为分析探讨反复自然流产的免疫性因素，应用补体微量淋巴细胞毒实验方法检测女性反复自然流产的封闭抗体，用ELISA法检测女性反复自然流产的抗心磷脂抗体(ACA)、抗精子抗体(ASA)共752例。结果显示，封闭抗体与反复自然流产明显相关，抗心磷脂抗体与反复自然流产有一定关系，抗精子抗体与反复自然流产无明显相关。研究表明，封闭抗体、抗心磷脂抗体是造成反复自然流产的重要免疫因素。