新型靶向光敏剂Ⅰ对Hep-2细胞的光动力抑瘤活性

 目的　评价新型靶向性光敏剂Ⅰ（PSⅠ）对喉癌Hep-2细胞的靶向性和光动力活性。方法　采用bleaching实验评价PSⅠ的稳定性; 荧光测定法观察Hep-2细胞对PSⅠ的摄取能力; 四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测PSⅠ浓度、光照剂量及光照时间点对Hep-2细胞存活率的影响。结果　在光照50 min后,PSⅠ的吸光度（A）值仅降低了11 %,表明其稳定性可满足光动力治疗的需要;Hep-2细胞对PSⅠ的摄取随PSⅠ浓度的增加而增加,但过量叶酸的存在可明显抑制Hep-2细胞对PSⅠ的摄取（t值分别为5.96,4.89,均P＜0.01）;MTT实验结果表明Hep-2细胞的存活率与PSⅠ浓度和光照剂量呈负相关（r＝-0.763,P＝0.017; r＝-0.946,P＝0.001）。当PSⅠ浓度为14 μmol／L、光照剂量为18 J／cm2时,Hep-2细胞的存活率仅为34 %,而在无光照时即使光敏剂浓度升至110 μmol／L,Hep-2细胞的存活率仍为100 %;给予PSⅠ 24 h后再进行光动力治疗（PDT）可有效地抑制Hep-2细胞的生长,其存活率只有32 %。结论　PSⅠ拥有满意的光稳定性和低的暗毒性,对Hep-2细胞有很好的靶向性和光动力活性。     

新型靶向光敏剂光动力诱导HeLa细胞凋亡的实验研究

[目的]研究新型靶向光敏剂Ⅰ光动力诱导HeLa细胞死亡的方式。[方法]用流式细胞仪分析照射剂量和光敏剂浓度对HeLa细胞凋亡的影响,细胞凋亡和坏死的比例;并采用激光共聚焦观察细胞F-actin和核的变化;透射电镜观察细胞超微结构的改变。[结果]光敏剂Ⅰ介导的光动力治疗可诱导HeLa细胞的凋亡和坏死,但凋亡的比例明显大于坏死（P=0.0053）,且细胞凋亡的量分别与光照剂量（r=0.987,P〈0.001）和光敏剂浓度（r=0.995,P〈0.001）呈正相关;光动力诱导后,细胞的F-actin结构破坏,细胞皱缩,透射电镜下可见凋亡小体的形成。[结论]光敏剂Ⅰ介导的光动力治疗主要通过凋亡途径导致HeLa细胞的死亡。     

SEA诱导Hep-2细胞凋亡的机制研究

目的:观察葡萄球菌肠毒素ASEA对Hep-2细胞株诱导凋亡机制.方法:应用MTT比色法和流式细胞术检测SEA对Hep-2细胞增殖抑制率和对细胞增殖周期的影响,同时应用同位素法检测Hep-2细胞内CAMP水平.结果:SEA对Hep-2细胞株有明显的抑制作用,且呈剂量依赖性.流式细胞术分析,SEA能阻止G1期细胞向S期的过程,G1期细胞堆积.同位素分析,Hep-2细胞内CAMP水平下降.结论:SEA能诱导Hep-2细胞凋亡,抑制Hep-2细胞增殖,具有细胞毒性效应.     

SEA诱导Hep-2细胞凋亡的机制研究

目的：观察葡萄球菌肠毒素ASEA对Hep－2细胞株诱导凋亡机制。方法：应用MTT比色法和流式细胞术检测SEA对Hep－2细胞增殖抑制率和对细胞增殖周期的影响,同时应用同位素法检测Hep－2细胞内CAMP水平。结果：SEA对Hep－2细胞株有明显的抑制作用,且呈剂量依赖性。流式细胞术分析,SEA能阻止G1期细胞向S期的过程,G1期细胞堆积。同位素分析,Hep－2细胞内CAMP水平下降。结论：SEA能诱导Hep－2细胞凋亡,抑制Hep－2细胞增殖,具有细胞毒性效应。     

新型光敏剂CPD4对人乳腺癌细胞体外光动力杀伤效应

目的:研究新型光敏剂叶绿素衍生物4(chlorophyll derivative,CPD4)对人乳腺癌细胞系T47D和MCF-7体外光动力杀伤效应,并对机理进行初步探讨.方法:采用激光共聚焦荧光显微镜结合荧光探针标记技术观察光敏剂在细胞内分布及亚细胞定位;将终浓度分别为2.5、2.0、1.5、1.0、0.5 μg/mL的CPD4加入到T47D及MCF-7细胞培养皿中,孵育2h后用670nm半导体激光治疗仪照射,光剂量为10J/cm2,照毕,继续培养24h后采用染料排斥实验测定细胞的存活率.流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞死亡方式和凋亡率.实验分为四组:空白对照组、单纯光敏剂组、单纯细胞光照组,光敏剂-细胞光照组.结果:光敏剂CPD4可穿过T47D及MCF-7细胞膜进入细胞,分布在细胞膜及胞浆中,线粒体是其亚细胞分布的主要位点之一.光动力组中光敏剂浓度分别为2.5、2.0、1.5、1.0、0.5μg/mL,T47D及MCF-7细胞死亡率分别为(76.77±6.41)%、(40.51±7.28)%、(38.4±5.35)%、(17.08±0.52)%、(11.16±0.28)%、(81.67±1.53)%、(69.67±4.51)%、(45.33±4.73)%、(17.67±2.52)%、(12.00±2.00)%.Annexin V-FITC/PI法检测PDT作用24h后凋亡率分别可达36.80%及40.90%.结论:新型光敏剂CPD4分布在人乳腺癌细胞T47D及MCF-7的细胞膜及细胞浆中,线粒体是其亚细胞分布主要位点之一;光敏剂CPD4对人乳腺癌细胞T47D和MCF-7具有良好的光动力杀伤效应,呈现量效关系,诱导细胞凋亡是其主要杀伤方式.线粒体途径促进细胞凋亡可能是其光动力杀伤机制.     

鸦胆子油乳对Hep-2细胞增殖与凋亡诱导作用的研究

目的：探讨鸦胆子油乳注射液对喉癌Hep-2细胞的增殖抑制及调亡诱导作用。方法：利用MTT比色法检测5个不同药物浓度（0.1、0.2、0.4、0.6和0.8g/L）对细胞的抑制率;采用倒置显微镜观察细胞的形态变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率;实时荧光定量PCR检测凋亡基因Bcl-2和Bax的表达。结果：MTT显示,鸦胆子油乳对Hep-2细胞的生长抑制作用呈剂量和时间依赖性。倒置显微镜下可见细胞凋亡的形态学改变,显示加药组细胞染色体固缩,聚集呈块状、新月状,出现凋亡小体。流式细胞仪检测显示,0.2、0.4和0.6g/L药物作用48h后凋亡率分别为（42.58±4.36）%、（57.71±3.07）%和（75.50±3.93）%,显著高于对照组（0.96±0.17）%,差异有统计学意义,F=8.82,P=0.003;实时荧光定量PCR结果显示,随着鸦胆子油乳注射液的浓度增加,Bcl-2mRNA的表达减少,Bax mRNA的表达量逐渐上升,与对照组比较差异有统计学意义,P〈0.01。结论：鸦胆子油乳能够抑制Hep-2细胞的增殖并诱导其凋亡,作用呈剂量和时间依赖性。     

天佛参口服液诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡及机制探讨

目的 :探讨天佛参口服液诱导人喉癌 Hep- 2细胞凋亡及其机制。方法 :采用体外细胞培养实验方法。应用 MTT、透射电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪检测、原位末端标记等技术 ,观察药物对细胞的抑制率及凋亡形态 ,检测凋亡率及胞内 [Ca2 ]变化。结果 :MTT测得细胞抑制率随时间、剂量而增大 ,透射电镜下见到凋亡细胞及凋亡小体形成 ,DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示清晰的 DNA梯状条带 ,原位末端标记检测出细胞凋亡率亦有时间、剂量依赖性 ,细胞内 [Ca2 ]随药物浓度的增加而升高 ,且具有统计学意义。结论 :天佛参口服液确有诱导 Hep- 2细胞凋亡的作用 ,其机制可能与胞内 [Ca2 ]变化有关。     

TPA诱发Hep-2和原代喉癌细胞凋亡的对比研究

目的　为初步探讨TPA用于喉癌治疗的可行性 ,对TPA分别诱发Hep 2和原代喉癌细胞的凋亡作用进行了对比观察。方法　应用琼脂糖凝胶电泳及FCM技术分别对两种细胞中的凋亡细胞进行定性、定量及细胞周期检测。结果　① 1nMTPA作用 12h ,Hep 2和原代喉癌细胞的凋亡率分别是 11.8%和 10 .14 %(P >0 .0 5 ) ;10 0nMTPA作用 2 4h ,凋亡率达峰值 ,分别为 2 7.80 %和 2 5 %(P >0 .0 5 ) ,细胞周期阻滞于G1期 ,DNA琼脂糖凝胶电泳可检出梯状带。②TPA诱发两种细胞的凋亡率具有明显的正相关 (r =0 .9674,P <0 .0 1)。结论　TPA在体外对Hep 2和原代喉癌细胞均可诱发凋亡 ,两者的凋亡率具有较好的相关性     

mTOR siRNA对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞生物学行为的影响

目的观察mTOR siRNA对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖能力的影响。方法选取45例喉鳞状细胞癌组织和45例正常喉黏膜组织,采用免疫组织化学法检测mTOR蛋白的表达;将喉鳞状细胞癌Hep-2细胞分为空白对照组、空载体组和mTOR siRNA组,及正常对照组、溶剂对照组和雷帕霉素组,分别利用mTOR siRNA和雷帕霉素进行治疗,采用Western bloting法检测不同浓度的mTOR siRNA和雷帕霉素分别处理细胞后对mTOR蛋白表达的影响,并采用CCK-8试剂盒分析mTOR蛋白表达下调对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖能力的影响。结果 mTOR蛋白在喉鳞状细胞癌组织中表达的阳性率显著高于正常喉黏膜组织(P<0.05)。3种不同浓度mTOR siRNA分别转染Hep-2细胞24、48、72 h,各组与空白对照组、空载体组相比,mTOR蛋白表达均有所降低(P<0.05),且mTOR蛋白表达随mTOR siRNA浓度的增加、作用时间的延长而降低(P<0.05)。3种不同浓度雷帕霉素处理Hep-2细胞24、48、72 h,各组与溶剂对照组及正常对照组相比,mTOR蛋白表达量均有所降低(P<0.05);且mTOR蛋白表达随雷帕霉素浓度的增加、处理时间的延长而降低(P<0.05)。与空白对照组、空载体组相比,各mTOR siRNA组的Hep-2细胞增殖在转染后24、48、72 h均受到明显抑制(P<0.05)。结论 mTOR siRNA均能降低喉鳞状细胞癌Hep-2细胞中mTOR蛋白的表达,有效抑制细胞的生长,为喉鳞状细胞癌的分子治疗提供了理论依据。     

酞菁类光敏剂对小鼠肝癌的光动力治疗和作用机理的研究

“光敏疗法”现多用血卟琳衍生物(HPD)加激光,在治疗某些肿瘤上已收到确实疗效,有希望成为一种新的治疗方法。但是,HPD具有以下一些缺点:它是一混合物,其有效成分至今还未确定;在不同的制备条件下,不同批号HPD所含各组分的比例有所差别,使效果不一致;HPD主要光吸收峰在400nm左右,而临床应用630nm红光激发,未能充分发挥其光敏效     

K-ras基因在人喉鳞状细胞癌细胞株(Hep-2)中的表达及其意义

目的 K-ras基因的突变激活,最常见于胰腺癌、结肠癌和肺癌等肿瘤。国外有人报道人喉鳞状细胞癌的发生与K-ras基因的突变激活没有相关性。本文旨在探讨K-ras基因在喉鳞状癌细胞株Hep-2中的表达及其意义,为喉癌发生与K-ras点突变的相关性研究奠定坚实的基础。方法采用RT-PCR技术检测K-ras基因mRNA在喉癌细胞株Hep-2和胰腺癌细胞株MIAPaCa-2中的表达。结果人胰腺癌细胞株MIAPaCa-2和人喉鳞状癌细胞株Hep-2中K-ras mRNA表达均为强阳性。结论人喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2中K-ras基因表达阳性,喉癌的发生可能与其点突变引起的激活有关。     

藻红蛋白应用于肿瘤光动力治疗的研究

目的 :探讨藻红蛋白介导的光敏反应对肿瘤细胞S180生长抑制作用 ,研究新型光动力药物。方法 :将不同浓度的藻红蛋白加入到细胞培养基中 ,随之以激光辐照 ,MTT法测定细胞存活率。结果 :激光能量恒定于 2 5.6J/cm2 时 ,S180细胞生存率随着藻红蛋白的浓度的增加而降低。说明藻红蛋白的激光光敏反应对S180瘤细胞有很强的杀伤、破坏作用 ,这种效应在一定的激光能量范围内 ,与藻红蛋白本身的浓度相关。而单用藻红蛋白或激光处理 ,均不对细胞造成显著杀伤。结论 :藻红蛋白是一种毒性较小 ,很有前景的光敏剂 ,可望应用于肿瘤光动力治疗。     

K-ras基因在人喉鳞状细胞癌细胞株(Hep-2)中的表达及其意义

Objective： To investigate the expression of K-ras in human laryngeal squamous cell carcinoma cell lines （Hep-2） and its significance for establishing a solid foundation for further study of the relationship between human laryngeal squamous cell carcinoma and K-ras gene point mutations. Methods： The expression of K-ras in human laryngeal squamous cell carcinoma cell lines （Hep-2） and human pancreatic carcinoma cell lines （MIAPaCa-2） was detected by using RT-PCR. Results： The expression of K-ras mRNA in Hep-2 and MIAPaCa-2 was strong and positive. Conclusion： The expression of K-ras mRNA in human laryngeal squamous cell carcinoma cell lines （Hep-2） is positive. Development of laryngeal carcinoma might be related to the activation of K-ras gene point mutation.     

RNAi沉默Cyr61基因对喉癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响

目的:观察RNA干扰技术沉默Cyr61基因表达对人喉癌Hep-2细胞生物学行为的影响.方法: 针对Cyr61 mRNA的序列设计合成小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建pRNAT- Cyr61重组质粒,转染人喉癌Hep-2细胞; RT-PCR和Western blot检测其对Hep-2细胞内源性Cyr61表达的影响;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察Hep-2细胞体外增殖活性变化;Transwell小室法检测Hep-2细胞体外侵袭能力的改变;流式细胞仪检测Hep-2细胞凋亡.结果: pRNAT-Cyr61重组质粒在mRNA及蛋白水平分别显著抑制Cyr61基因表达,抑制率分别最高达到74.62%和78.43%;Hep-2细胞的体外生长抑制率最高达68.22%,侵袭细胞数下降至(44.00±2.35)个;Hep-2细胞凋亡率最高达52.98%.结论: pRNAT- Cyr61可抑制Cyr61在喉癌Hep-2细胞中的表达,并抑制细胞的增殖活性和侵袭能力,促进细胞凋亡.     

RNA干扰抑制Hep-2细胞人端粒酶逆转录酶基因表达对放射敏感性的影响

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因特异性短发夹样RNA(shRNA)真核表达载体,观察其联合射线对人喉癌Hep-2细胞端粒酶活性和细胞存活的影响,研究hTERT基因在放射增敏中的作用。方法根据hTERT mRNA编码序列设计RNA干扰(RNAi)靶点,构建重组表达质粒pshRNA-hTERT,构建成功后,转染Hep-2细胞并作射线处理,用端粒重复序列扩增方法(TRAP-PCR- EHSA)检测端粒酶活性的动态变化,采用克隆形成分析方法观察质粒pshRNA-hTERT对Hep-2细胞放射敏感性的影响,计算放射增敏比SER_(SF2)。结果转染质粒pshRNA-hTERT后,Hep-2细胞的hTERT mRNA表达抑制率为60.8%,质粒pshRNA-hTERT不仅能够抑制Hep-2细胞的端粒酶活性(P<0.05),而且还可以抑制辐射诱导的端粒酶活性上升(P<0.05)。照射前经pshRNA-hTERT处理24h,明显降低了2Gy照射后Hep-2细胞的存活分数(85.7%),与单纯放射组(67.7%)相比,差异有统计学意义(P<0.05),pshRNA-hTERT的放射增敏比SER~(SF2)为1.27。结论RNAi显著抑制了靶基因hTERT的表达,质粒pshRNA-hTERT能明显抑制2Gy照射诱导的Hep-2细胞端粒酶活性升高,并显著提高其体外放射敏感性;质粒pshRNA-hTERT的放射增敏作用可能与端粒酶活性受抑制有关。     

1,4-二（2-苄硒乙氧基）蒽诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡的研究

背景与目的：硒是人类生命活动中必不可少的微量元素之一,对人类健康的巨大作用是其他物质无法替代的。硒的小分子化合物1,4-二(2-苄硒乙氧基)蒽{1,4-bis[2-(benzylselanyl)ethoxy] anthracene, BSEA}具有杀菌消炎的作用,但BSEA的抗癌作用尚未见报道。该研究旨在探讨BSEA诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡及其作用机制。方法：不同浓度的BSEA处理人喉癌Hep-2细胞24 h后,采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞生长抑制率;在荧光显微镜下观察细胞形态;Annexin Ⅴ-FITC法检测细胞凋亡;JC-1检测线粒体膜电位;酶标分析仪检测caspase-3和caspase-8活性;实时荧光定量聚合酶链反应(real-time flu-orescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白[质]印迹法(Western blot)分别检测Bax、XIAP mRNA和蛋白表达水平。结果：BSEA处理人喉癌Hep-2细胞24 h后,BSEA对其生长抑制呈剂量依赖性,IC50为35.74μmol/L;80μmol/L BSEA处理的Hep-2细胞在荧光显微镜下可观察到明显的凋亡小体;磷脂酰丝氨酸外翻加剧;线粒体膜电位开始下降;caspase-3活性的影响呈剂量依赖趋势,而caspase-8活性未见显著变化;Bax的mRNA和蛋白表达水平上升,XIAP的mRNA和蛋白表达水平下降。结论：BSEA对人喉癌Hep-2细胞生长有明显的抑制作用,并能通过线粒体途径诱导细胞凋亡。     

华卟啉钠介导的光动力疗法在体外和体内对肿瘤生长的抑制作用

目的： 观察华卟啉钠 (sinoporphyrin sodium,DVDMS-2)介导的光动力疗法 (DVDMS-2-PDT)在体内外对肿瘤生长的抑制作用及其强度。方法：用噻唑蓝(MTT)法检测DVDMS-2在体外对4种肿瘤细胞 (人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞H460、人胃癌细胞BGC823和人肾癌细胞Ketr-3)的生长抑制作用。采用小鼠肉瘤S180移植性肿瘤模型,按2 mg/kg单次尾静脉注射给予DVDMS-2,给药24 h后进行光动力治疗,分别设低、中、高剂量照射组 (分别为38、76、152 J/cm2),另设生理盐水阴性对照组和阳性对照组 (给予10 mg/kg Photofrin,按76 J/cm2进行光照射),实验结束后,称瘤质量,计算各组肿瘤生长抑制率。采用裸鼠H460细胞荷瘤动物模型,设DVDMS-2低、中、高剂量组 (分别为0.5、1.0、2.0 mg/kg),另设生理盐水阴性对照组和阳性对照组 (给予10 mg/kg Photofrin),激光照射条件为76 J/cm2 ,试验结束后,计算各组肿瘤质量、肿瘤体积、相对肿瘤增殖率T/C (%)等指标。利用SPSS 13.0对数据进行统计分析。结果：DVDMS-2对HepG2、H460、BGC823和Ketr-3细胞均有明显的生长抑制作用,MTT法测定其IC50值为0.207～0.584 μg/mL。小鼠肉瘤S180移植性肿瘤模型抑制实验中,低、中、高剂量照射组的平均肿瘤抑制率分别为82.83%、88.56%、95.59%,与阴性对照组比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。裸鼠H460细胞荷瘤动物模型中,DVDMS-2 0.5、1.0和2.0 mg/kg对裸鼠异体移植瘤的抑制率分别为38.8% 、47.9%和53.9%,与阴性对照组比较,差异均具有统计学意义(P <0.05)。结论：DVDMS-2体内外应用对肿瘤生长均有明显的抑制作用。     

miR-3195对人喉癌Hep-2细胞增殖的抑制作用及其机制

目的：探讨miR-3195对喉癌Hep2细胞增殖的影响及其分子机制。方法：选取2008年1月至2012年8月期间在南华大学教学医院郴州市第一人民医院耳鼻喉科收治的29例喉癌患者的喉癌组织及其相应的癌旁组织标本,采用qPCR检测miR-3195在喉癌和癌旁组织中的表达;构建miR-3195在喉癌Hep-2细胞中稳定高表达的细胞株,采用MTT法观察miR-3195稳定高表达组和对照组的增殖情况;建立裸鼠移植瘤模型,观察miR-3195稳定高表达的人喉癌细胞株Hep-2在裸鼠体内增殖的情况。利用生物信息学预测 miR-3195 的靶基因,构建 TBX1 3''UTR 的荧光素酶载体,双荧光素酶检测系统检测其荧光素酶活性;Western blotting检测稳定高表达miR-3195组和对照组细胞株的TBX1蛋白表达水平。结果：miR-3195在喉癌组织中的表达明显低于癌旁组织（P<0.01）;miR-3195上调可抑制Hep-2细胞的增殖（P<0.01）,且可明显抑制裸鼠移植瘤瘤体的生长（P<0.05）;双荧光素酶报告基因检测结果表明miR-3195可能与TBX1靶向结合（P<0.05）,同时Western blotting法验证了miR-3195能够抑制TBX1蛋白的表达（P<0.05）。结论：miR-3195对Hep2细胞有明显的增殖抑制作用,其分子机制可能与负性调控TBX1的表达有关。