新生大鼠耳蜗K?lliker器在体凋亡的研究

目的：了解不同天龄新生大鼠耳蜗K?lliker器的形态变化,研究凋亡相关因子的mRNA及蛋白的表达水平,探讨K?lliker器在听觉功能发育过程中凋亡的机制。方法选取出生后不同天龄的Sprague－Dawley大鼠共192只,其中出生后1天（P1）、5天（P5）、12天（P12）各6只大鼠耳蜗冰冻切片后,通过苏木精－伊红染色及免疫荧光染色等方法,观察耳蜗K?lliker器的形态结构变化;取 P1大鼠6只行耳蜗基底膜免疫荧光观察;提取出生后1、3、5、7、10、12及14天（P1、P3、P5、P7、P10、P12和P14）大鼠耳蜗基底膜mRNA（各6只）及蛋白（各18只）,运用real－time PCR及蛋白质印迹的方法,观察出生后各天龄组大鼠耳蜗基底膜 K?lliker 器凋亡过程中 bcl－2、caspase－3、caspase－8及caspase－9的表达规律。结果出生后大鼠听力出现之前其耳蜗K?lliker器支持细胞的形态自顶回向底回从高柱状向矮柱状变化,同时支持细胞的数量逐渐减少。出生后不同天龄大鼠耳蜗基底膜的caspase－3、caspase－8、caspase－9及bcl－2的mRNA和蛋白的表达水平均呈明显的时间依赖性。结论在大鼠出生后、听力出现前耳蜗发育的整个阶段,K?lliker器自底回向顶回逐渐发生退化;caspase－3、caspase－8、caspase－9及bcl－2的mRNA和蛋白的表达表现为时间依赖性。     

新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞释放ATP的机制

目的 证实体外培养的新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞能够释放ATP,并进一步探讨缘细胞释放ATP的机制.方法 分离、培养新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞,采用生物发光法分别检测巴佛洛霉素A1、己二酸二癸酯( didecyl adipate,DDA)、细胞外K+、毒胡萝卜素、细胞外Ca2、U73122及马兜铃酸钠对细胞外液中缘细胞ATP释放的影响.结果 随着巴佛洛霉素A1浓度的增加,细胞外液中ATP的浓度明显下降;当DDA浓度增加时,细胞外液中ATP的浓度几乎呈线性增加.随着细胞外液中的K+浓度的增高,缘细胞释放的ATP浓度呈现上升趋势,当细胞外液中的K+浓度为9.15 mmol/L时,ATP的释放量达到峰值,之后随着K+浓度的继续升高ATP的释放量呈下降趋势.随着毒胡萝卜素浓度的增加,缘细胞释放的ATP浓度呈现明显下降的趋势.当细胞外Ca2+浓度为0 mmol/L时,缘细胞仍然释放ATP;Ca2+浓度增加与ATP的释放呈负相关,但当细胞外的Ca2+浓度达到1.25 mmol/L以上时,ATP的释放量维持在一个较稳定的水平.U73122的浓度在0.25～1.25 μmol/L时,其与缘细胞释放的ATP浓度呈负相关.当马兜铃酸钠的浓度为12.5 ～ 100.0 μmol/L,缘细胞ATP释放呈明显下降的趋势;当其浓度＞100.0 μmol/L时,ATP释放浓度趋于平稳.结论 体外培养的新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞能够释放ATP,其释放量与钙泵、K+通道状态以及细胞内信号传导通路相关酶的活性有关.     

新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞中ATP存在的证据

目的:研究体外培养的新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞中存在ATP的证据,即细胞中是否存在ATP囊泡,体外培养液中能否检测到所释放的ATP。方法:采用出生1～3 d的Sprague-Dawley大鼠,进行体外血管纹缘细胞培养、纯化、鉴定。特异性标记ATP囊泡的喹丫因染色后在荧光显微镜下观察缘细胞中的ATP囊泡。采用生物发光法检测缘细胞细胞外液中所释放的ATP的浓度。结果:体外培养的新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞,经流式细胞法检测上皮细胞标志性的角蛋白和波形蛋白的纯度,证实培养所获得的细胞为缘细胞。经喹丫因染色后在荧光显微镜下可见缘细胞细胞质中存在大量的绿色星点状染色。采用生物发光法检测缘细胞细胞外液中ATP的浓度,通过细胞荧光值可计算出ATP的浓度。结论:新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞中存在ATP囊泡,并能分泌ATP。     

耳蜗血管纹缘细胞三磷酸腺苷释放机制

三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）被认为是耳蜗中一种重要的信号分子,可以作为共同递质和（或）神经调节物质发挥耳蜗的各种生理功能。目前已证实新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞内的ATP囊泡为溶酶体,可以释放ATP。然而,缘细胞释放ATP的机制还未完全阐明,本文结合国内外文献就耳蜗缘细胞中ATP释放机制的研究现状做一综述。     

豚鼠耳蜗单离Hensen细胞钾电流特性及三磷酸腺苷对其影响

目的 研究豚鼠耳蜗单离Hensen细胞的钾离子电流及其特性以及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)对Hensen细胞电生理特性的影响。方法 采用传统全细胞膜片钳技术，对单离Hensen细胞进行记录。ATP通过压力注射仪对单离Hensen细胞给药。结果 Hensen细胞的钾电流呈明显的外向整流性，只有延迟整流性钾电流(delayed rectification potassiu mcurrent，IK)，没有瞬间外向性钾电流(transient outward potassium current，IA)。低浓度(0．1μmol/L，1μmol／L，10μmol／L)ATP可以使Hensen细胞的钾电流的幅度明显降低，且呈浓度依赖性，浓度越高，降幅越大。高浓度ATP(100μmol／L，1mmoL／L，10mmol／L)可以引起Hensen细胞的内向离子流，呈浓度依赖性，浓度越高，升幅越大。ATP的这两种作用均可被ATP受体拮抗剂(100μmol／L舒拉明)所逆转。结论 对Hensen细胞不同电压的刺激可以诱发出延迟整流性钾电流，低浓度ATP对Hensen细胞的钾电流有明显抑制作用，且呈浓度依赖性。高浓度ATP可以引起Hensen细胞的非选择性内向离子流，为钾离子依赖性，而且是通过ATP受体起作用。     

新生大鼠Klliker器支持细胞体外凋亡及增殖的研究

目的:研究体外Klliker器支持细胞的增殖及凋亡情况,并探讨促进Klliker器支持细胞在体凋亡的可能因素。方法:采用机械分离和酶消化结合的方法提取新生大鼠Klliker器支持细胞并体外培养,通过流式细胞仪检测细胞纯度、凋亡率及凋亡周期,通过MTT法检测该细胞的生长曲线,并运用Realtime PCR及Western blot方法观察不同时间点Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及Bcl-2的表达规律;改变体外培养Klliker器支持细胞培养液中Ca2+、K+及谷氨酸浓度,采用MTT法检测Klliker器支持细胞的存活率。结果:Klliker器支持细胞纯度高达96.56%,呈明显的线性增长;各组细胞的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及Bcl-2的mRNA及蛋白的表达稳定。提高Klliker器支持细胞外液中Ca2+浓度导致细胞活性降低,而细胞外K+对Klliker器支持细胞活性的影响表现为浓度依赖性,高浓度的谷氨酸对Klliker器支持细胞有一定的保护作用。结论:大鼠Klliker器支持细胞在体外无明显凋亡,呈线性增长趋势。高浓度的Ca2+可能是引起在体Klliker器支持细胞逐渐凋亡的因素,而高浓度的K+及谷氨酸对在体Klliker器支持细胞有一定的保护作用。     

三磷酸腺苷在新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞中的释放机制

目的探究新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞中ATP释放的机制。方法原代培养新生SD大鼠血管纹缘细胞,利用钙离子荧光探针、生物发光法测定ATP浓度和β-氨基己糖苷酶释放率测定法来研究ATP和GPN与P2YR-PLC-IP3通路诱导的内质网钙库反应之间的关系,以及内质网钙库与细胞外ATP浓度和β-氨基己糖苷酶释放率的关系。结果 ATP和GPN可通过P2YR-PLC-IP3通路诱发内质网钙库释放,可被P2YR-PLC-IP3通路拮抗剂抑制。缘细胞外ATP浓度和β-氨基己糖苷酶释放率与细胞内钙离子浓度呈正相关。结论缘细胞外ATP作用于P2Y嘌呤能信号系统触发内质网钙库释放,胞内钙离子诱导溶酶体胞吐作用释放ATP至胞外,从而发挥其生物学作用。     

ATP对离体耳蜗外毛细胞内游离钙浓度的影响

为探讨三磷酸腺苷（ＡＴＰ）对耳蜗外毛细胞内游离钙（Ｃａ２＋）浓度的影响，利用荧光染色法，以５７０型粘附式细胞仪对ＡＴＰ引起的豚鼠耳蜗外毛细胞Ｃａ２＋浓度的变化进行动态观察。加入ＡＴＰ使Ｃａ２＋浓度明显升高，升高后迅速下降，高峰处无延迟，再次加入ＡＴＰ，出现类似反应。说明ＡＴＰ是以一种神经递质的作用影响外毛细胞的生理活动     

ATP对离体耳蜗外毛细胞内游离钙浓度的影响

为探讨三磷酸腺苷对耳蜗外毛细胞内游离下浓度的影响，利用荧光染色法５７０型粘附式细胞仪对ＡＴＰ引起的豚鼠耳蜗外毛细胞Ｃａ＾２＋浓度的变化进行动态观察。加入ＡＴＰ使Ｃａ＾２＋浓度明显升高，升高后迅速下降，高峰处无延迟，再次加入ＡＴＰ，出现类似反应。说明ＡＴＰ是以一种神经递质的作用影响外毛细胞的生理活动。     

利诺吡啶对豚鼠耳蜗外毛细胞和支持细胞钾电流的影响

目的 观察KCNQ家族钾通道特异性阻滞剂利诺吡啶(linopirdine)对豚鼠耳蜗单离外毛细胞和Deiters细胞(支持细胞)总钾电流的影响，初步探讨KCNQ家族钾通道在耳蜗外毛细胞和Deiters细胞的分布。方法 运用膜片钳技术，在全细胞模式下记录正常细胞外液中8个外毛细胞和5个Deiters细胞的总钾电流，并观察100μmol／L利诺吡啶对外毛细胞和Deiters细胞总钾电流的影响。结果 在正常细胞外液中，单离外毛细胞可记录到四乙基二乙胺敏感的外向性钾电流和静息膜电位附近激活的内向性钾电流(the K^ current activated at negative potential，IKn)两种钾电流，而单离Deiters细胞中只记录到外向整流性钾电流。加入100μmol／L利诺吡啶后，外毛细胞中的四乙基二乙胺敏感的钾电流减小，IKn被完全抑制；而Deiters细胞中的外向整流性钾电流大小无变化。结论 KCNQ家族钾通道存在于豚鼠耳蜗外毛细胞，其介导的钾电流是四乙基二乙胺敏感的钾电流的组成部分，并构成全部的IKn；但KCNQ家族钾通道不存在于豚鼠耳蜗Deiters细胞。     

豚鼠耳蜗单离Hensen细胞钾电流特性及三磷酸腺苷对其影响

目的　研究豚鼠耳蜗单离Hensen细胞的钾离子电流及其特性以及三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate ,ATP)对Hensen细胞电生理特性的影响。 方法　采用传统全细胞膜片钳技术 ,对单离Hensen细胞进行记录。ATP通过压力注射仪对单离Hensen细胞给药。结果　Hensen细胞的钾电流呈明显的外向整流性 ,只有延迟整流性钾电流 (delayedrectificationpotassiumcurrent,IK) ,没有瞬间外向性钾电流 (transientoutwardpotassiumcurrent ,IA)。低浓度 ( 0 1 μmol/L ,1 μmol/L ,1 0μmol/L)ATP可以使Hensen细胞的钾电流的幅度明显降低 ,且呈浓度依赖性 ,浓度越高 ,降幅越大。高浓度ATP( 1 0 0 μmol/L ,1mmol/L ,1 0mmol/L)可以引起Hensen细胞的内向离子流 ,呈浓度依赖性 ,浓度越高 ,升幅越大。ATP的这两种作用均可被ATP受体拮抗剂 ( 1 0 0 μmol/L舒拉明 )所逆转。结论对Hensen细胞不同电压的刺激可以诱发出延迟整流性钾电流 ,低浓度ATP对Hensen细胞的钾电流有明显抑制作用 ,且呈浓度依赖性。高浓度ATP可以引起Hensen细胞的非选择性内向离子流 ,为钾离子依赖性 ,而且是通过ATP受体起作用     

支持细胞在哺乳动物耳蜗发育及功能中的作用

耳蜗的感觉上皮细胞有毛细胞和支持细胞两种类型.许多研究旨在探讨听力损失的基本机制,重点针对毛细胞和螺旋神经元,较少关注支持细胞.目前对支持细胞作用的了解已从单纯的结构支持扩展到耳蜗毛细胞分化发育、耳蜗离子稳态、毛细胞感音功能的调节以及突触发生发育、毛细胞损伤修复的多个方面.本文对支持细胞在哺乳动物耳蜗发育及功能中的关键作用做一综述.     

小鼠耳蜗毛细胞体外培养研究方法

目的建立耳蜗Corti器体外培养模型.方法取刚出生2～3天小鼠耳蜗,采用鼠尾胶表面平铺培养并结合荧光染色方法观察耳蜗毛细胞的生长情况.结果耳蜗基底膜经1～5天培养,内、外毛细胞和支持细胞生长良好,排列有序,无任何衰亡和缺损.结论耳蜗Corti器可以在体外培养环境存活一定时间并健康生长.     

豚鼠耳蜗部分外支持细胞的分离法

目的 :探讨豚鼠耳蜗部分外支持细胞 (Deiter细胞、Hensen细胞和外柱细胞 )的分离方法 ,并建立细胞活性的鉴别标准。方法 :选取健康杂色豚鼠 5只 ,解剖出耳蜗基底膜 ,采用酶解加机械吹打法分离Deiter细胞、Hensen细胞和外柱细胞。结果 :可以获得较多数量、活性良好、长短不一的Deiter细胞和Hensen细胞 ,8h内细胞活性较好 ;但外柱细胞数量较少 ,存活时间较短。评价Deiter细胞、Hensen细胞和外柱细胞的活性标准 :①细胞膜无膨胀或扭曲 ;②细胞核无肿胀、移位 ;③在相差显微镜下细胞呈半透明状态 ,存在双折射现象 ;④细胞内无呈布朗运动的颗粒。结论 :熟悉耳蜗的解剖特性、分离出完整的基底膜 ,增加酶的浓度和加大机械吹打力度是获取活性良好的Deiter细胞、Hensen细胞和外柱细胞的关键 ;评价外毛细胞活性的 4项标准同样可用于判断Deiter细胞、Hensen细胞和外柱细胞的活性     

豚鼠柯替氏器支持细胞的分离和鉴定

目的：建立豚鼠柯替氏器支持细胞的分离方法，并观察活性支持细胞的形态特征。方法：对豚鼠基底膜用Ⅳ型胶原酶(1mg/ml)消化和微机械分离法获得柯替氏器单离支持细胞，在倒置显微镜下观察细胞的活性和形态特征并记数。结果：不同支持细胞在倒置显微镜下各有其形态特征，第一、二排Deiters细胞为逗点状，第三排为弓状：Hensen细胞为长圆形，半透明的胞质内含有数个脂质样颗粒；外柱细胞呈哑铃状，两端对称性圆球形，中间可见清晰的微管；内柱细胞呈“长勺形”，底部为圆球状，顶部逐渐向外侧弯曲成杯口样结构。每个豚鼠耳蜗可分离出单离Dieters细胞1～4个，Hensen细胞10～20个，内柱细胞和外柱细胞分别约80～100个。结论：Ⅳ型胶原酶消化和微机械分离法可分离出豚鼠柯替氏器的Deiters细胞、Hensen细胞和内、外柱细胞，可为在细胞和分子水平对单离活性支持细胞进行形态和功能变化的研究提供一种简便实用的方法。     

新生大鼠耳蜗增殖细胞的培养鉴定及超微结构观察

目的 研究新生大鼠耳蜗内是否存在增殖细胞,以及该增殖细胞能分化为何种细胞.方法 分离新生SD大鼠耳蜗细胞并进行培养,加入5-溴-2-脱氧尿嘧啶(5-bromo-2-demoxyuridine,BrdU)检测细胞的增殖状态,通过免疫荧光鉴定细胞球及分化细胞的性质.分离48个耳蜗Corti器,采用数字表格法随机分成4组进行细胞培养:对照组、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)组、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)组和EGF+bFGF组,每组12个,定量计数单个耳蜗培养细胞球的数量,结果进行方差分析.采用透射和扫描电镜观察细胞球的超微结构.结果 耳蜗Corti器细胞培养可见细胞球形成,90.1%球内细胞BrdU表达阳性,且大部分细胞巢蛋白表达阳性.分化细胞表达毛细胞标志物肌球蛋白7A、espin及鬼笔环肽阳性,神经元标志物神经丝蛋白(neurofilament M,NF-M)表达阳性,并且可见肌球蛋白7A和BrdU,espin和BrdU,以及NF-M和BedU双标阳性的分化细胞.对照组平均((-x)±s,以下同)每个耳蜗Corti器的增殖细胞数量为(45.3±23.0)个,EGF组(86.2±34.1)个,bFGF组(96.5±33.6)个,EGF+bFGF组(131.2±47.0)个.除EGF组和bFGF组之间P＞0.05外,其余各组之间P值均＜0.05,差异具有统计学意义.扫描和透射电镜下细胞球内细胞呈圆球形,大小均匀一致,表面具有众多微绒毛.胞质内有丰富的内质网、微管、微丝和线粒体等细胞骨架结构和细胞器,相邻细胞之间可见紧密连接、桥粒与缝隙连接.结论 大鼠耳蜗内存在增殖细胞,可分化为具有纤毛样结构的毛细胞及神经元.EGF和bFGF均可诱导增殖细胞分裂增殖.该增殖细胞的超微结构显示其具有早期幼稚细胞发育的特征.     

利诺吡啶对豚鼠耳蜗外毛细胞和支持细胞钾电流的影响

目的　观察KCNQ家族钾通道特异性阻滞剂利诺吡啶 (linopirdine)对豚鼠耳蜗单离外毛细胞和Deiters细胞 (支持细胞 )总钾电流的影响 ,初步探讨KCNQ家族钾通道在耳蜗外毛细胞和Deiters细胞的分布。方法　运用膜片钳技术 ,在全细胞模式下记录正常细胞外液中 8个外毛细胞和5个Deiters细胞的总钾电流 ,并观察 10 0 μmol/L利诺吡啶对外毛细胞和Deiters细胞总钾电流的影响。结果　在正常细胞外液中 ,单离外毛细胞可记录到四乙基二乙胺敏感的外向性钾电流和静息膜电位附近激活的内向性钾电流 (theK+ currentactivatedatnegativepotential,IKn)两种钾电流 ,而单离Deiters细胞中只记录到外向整流性钾电流。加入 10 0 μmol/L利诺吡啶后 ,外毛细胞中的四乙基二乙胺敏感的钾电流减小 ,IKn被完全抑制 ;而Deiters细胞中的外向整流性钾电流大小无变化。结论KCNQ家族钾通道存在于豚鼠耳蜗外毛细胞 ,其介导的钾电流是四乙基二乙胺敏感的钾电流的组成部分 ,并构成全部的IKn;但KCNQ家族钾通道不存在于豚鼠耳蜗Deiters细胞。