人用SARS病毒灭活疫苗的研究

[目的]研制出安全、有效、质量可控的人用SARS病毒灭活疫苗。[方法]建立了生产疫苗用的Vero细胞库并进行了检定，分离培养可稳定传代的SARS病毒，对其生物学特性进行了研究；建立了适用于SARS疫苗生产的细胞库和可用于疫苗生产的病毒种子批；优化确定SARS疫苗的灭活工艺和纯化工艺；通过动物实验，对其安全性、有效性进行了研究。[结果]建立了符合SARS病毒灭活疫苗生产使用的细胞库；分离获得了可稳定传代的用于疫苗生产的SARS病毒株；建立了适用于产业化的SARS病毒的灭活工艺和纯化工艺；制备的人用SARS灭活疫苗经小鼠、豚鼠、家兔、恒河猴不同种动物试验，免疫后动物可产生较高SARS病毒中和抗体，可以有效防护SARS病毒对动物的攻击。安全性实验表明，该疫苗未见毒副反应。[结论]试验研制的人用SARS病毒灭活疫苗具有较强的免疫原性，设计的灭活疫苗的生产工艺是可行的，并获得了国家食品药品监督管理局颁发的临床研究批文，待进一步研究后，可望进行规模化生产。     

Vero-E6、MDCK、293细胞对SARS冠状病毒敏感性的研究

目的 研究Vero—E6、MDCK、293细胞对SARS冠状病毒的敏感性，为该病的病原学研究、诊断和疫苗制备奠定基础。方法 用Vero—E6、MDCK及293细胞对广东省部分SARS病人的咽拭子标本进行分离培养，并对分离物使用电镜、间接免疫荧光(IFA)及荧光定量聚合酶链反应(FQ—PCR)的方法分别检测细胞和(或)培养上清波中的病毒含量。结果 感染SARS病人的咽拭子标本后，Vero—E6细胞出现病变(CPE)最早，电镜中可观察到Vero—E6细胞中大量的病毒颗粒，IFA试验感染病毒的Vero—E6细胞与SAPS病人的恢复期血清呈强阳性反应，FQ—PCR结果显示Vero—E6感染细胞内的病毒含量10^8拷贝／ml，高于293细胞(10^6拷贝／ml)及：MDCK(104拷贝／ml)。结论 三种细胞对SARS相关病毒的敏感性不同，Vero—E6是SARS相关病毒最敏感的宿主细胞。     

肾综合征出血热Vero传代细胞疫苗的研究

目的研究肾综合征出血热(HFRS)Vero传代细胞疫苗。方法将HFRS双价沙鼠肾细胞灭活疫苗的生产疫苗株Z10(Ⅰ型)、Z37(Ⅱ型)适应到Vero细胞上进行连续传代，并用不同代次的Vero细胞适应株制备Vero传代细胞疫苗。结果Z10、Z37，株感染Vero细胞后第1代即可达到较高病毒滴度，并且在Vero细胞中持续传代适应，病毒滴度分别维持在6．25～6．75和6．50～7．00logTCID50／ml之间，较为稳定。用不同代次的Vero细胞适应株制备而成的HFRS Vero细胞灭活疫苗抗原效价和疫苗的病毒滴度有较大提高，反向间接血凝效价从Z10 Cp1 Vero细胞疫苗的阴性上升到Z10 Cp10 Vero细胞疫苗的1：64，从Z37 Cp1 Vero细胞疫苗的1：2上升到Z37 Cp10 Vero细胞疫苗的1：64；疫苗病毒滴度(logTCID50／ml)从Z10 Cp1 Vero细胞疫苗的4．25上升到Z10 Cp10 Vero细胞疫苗的6．50，从Z37 Cp1 Vero细胞疫苗的6．25上升到Z37 Cp10 Vero细胞疫苗的7．50。疫苗在抗原量和病毒滴度上基本符合中国生物制品的要求。结论HFRS Vero传代细胞疫苗的生产，疫苗株在Vero细胞中的连续传代适应起关键性作用。     

福建省2株麻疹病毒的分离与鉴定

[目的] 了解福建省目前流行的麻疹野病毒的型别与抗原性。[方法]细胞培养分离病毒;PT-PCR扩增病毒N基因碳末端450个核苷酸,并对其产物测定基因序列以定型;细胞中和试验进行抗原性分析。[结果]B95a细胞分离到了2株麻疹野病毒,Vero细胞未分离到,表明B95a细胞敏感性较高;分离到的病毒经PT-PCR及基因序列测定证实为麻疹野病毒H1基因型(中国流行的优势株);分离的野病毒株与疫苗株同时进行血清中和试验显示：目前使用的疫苗产生的抗体对流行的野病毒仍具有中和作用,但中和滴度低于疫苗株。[结论]在保证生物安全的前提下,B95a细胞是目前分离麻疹病毒的首选细胞;新变异来的麻疹H1基因型也在我省流行,且目前使用的疫苗所产生的抗体,在体外中和野毒株的滴度低于疫苗株。     

新型冠状病毒肺炎患者粪便中新型冠状病毒的分离鉴定

目的分离鉴定新型冠状病毒肺炎（COVID?19）患者粪便标本中的新型冠状病毒（SARS?CoV?2）,并进行生物学特性分析。方法利用Vero E6细胞对收集到的SARS?CoV?2核酸阳性粪便标本开展病毒分离,对产生细胞病变的培养物进行病毒核酸检测、免疫荧光抗原检测、病毒含量测定及全基因组测序分型。收集每代细胞培养物后进行半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）实验。结果8份粪便标本经处理后分别接种Vero E6细胞,培养48 h,1份标本在Vero E6细胞上发现明显细胞病变。8例COVID?19患者粪便病毒核酸阳性标本中分离到1株SARS?CoV?2,阳性分离率为12.5%。病毒能稳定传至第3代,P1代病毒TCID₅₀为104.0/0.2 mL,P2代病毒TCID₅₀为104.5/0.2 mL,P3代病毒TCID₅₀为104.75/0.2 mL。8份粪便样本中仅1份有SARS?CoV?2活毒的复制扩增,传代培养的核酸检测Ct值约为10。该分离株的序列与Wuhan?Hu?1株序列（GenBank MN908947）的同源性>99.99%。结论从COVID?19患者粪便中分离到SARS?CoV?2活毒株,COVID?19患者中不仅存在粪便排毒的现象,且有活病毒存在。     

SARS病毒分离与病原学研究

目的 从浙江省首发的3例临床诊断SARS患者样本中分离SAPS病毒，并进行病毒核酸、免疫学检测和形态学观察。方法 采集3例SARS患者发病期的含漱液，接种Veto、Veto-E6、RD、Hep-2、MK单层细胞，观察细胞病变、免疫荧光法检测病毒抗原和RT-PCR法检测病毒核酸。抗原阳性的培养物作电镜形态学观察。结果 从3例患者的2份含漱液中分离到2株SAPS病毒，并发现Vero和RD两种细胞对SARS病毒敏感。在接种病毒后的3天左右可出现典型的细胞病变，两株病毒已在Vero和RD细胞上传代5代；在电镜下观察到SAPS病毒颗粒。结论 分离的2株病毒确定为SARS冠状病毒。并能在Veto细胞上稳定传代；建立的间接免疫荧光技术可用于SAPS实验室诊断及流行病学调查等。     

汉坦病毒Vero细胞灭活疫苗候选毒种筛选

目的将肾综合征出血热疫苗后备筛选毒株适应于Vero细胞，并对其抗原性和免疫原性进行研究。方法将新分离的4株汉坦病毒接种敏感动物，在乳沙鼠脑内连续传代。比较脑内病毒抗原的含量以及乳鼠的发病情况；在Vero细胞中传代，比较培养液中的病毒滴度和抗原滴度以及细胞的病变情况；利用筛选出的毒株研制Veto细胞灭活疫苗。研究疫苗的免疫原性。结果4株病毒经乳沙鼠脑内传代，鼠脑悬液的病毒滴度和抗原滴度分别达7．00～7．75LgCCID50／ml和1：3201：1280；4株毒株经Vero细胞连续传5代，培养液病毒滴度和抗原滴度分别达6．50～7．50LgCID50／ml和1：160～1：768；疫苗免疫家兔2针后，其中出血热病毒株Z34与ZJ5株疫苗免疫血清对同型毒株的中和效价达到1：10。结论ZJ4与ZJ5两毒株已适应于Vero细胞，且具有病毒滴度高和免疫原性良好的特性，适合用作Vero细胞肾综合征出血热疫苗理想的候选毒株。     

传染性非典型肺炎患者排泄物中SARS病毒生存和抵抗能力的研究

世界卫生组织 (WHO)已经确认 ,严重急性呼吸综合征(SARS)是由新型冠状病毒感染导致的急性呼吸系统传染病 ,掌握病毒在SARS患者排泄物中的生存消亡规律 ,是认识这种新出现传染病的传播途径、流行规律以及制订切实有效的消毒防护措施的基础 ,为此我们用模拟标本研究了新型冠状病毒在人体排泄物中的生存和抵抗能力。1 .材料与方法 :(1 )病毒 :SARS病毒 BJ0 1株 ,分离自北京SARS患者的尸体肺组织 ,滴度 1 0 8TCID50 。(2 )细胞 :Vero E6细胞 ,用含 1 0 %胎牛血清的DMEM培养液培养和传代。(3)人体排泄物和血液标本 :用 1 0ml洁净离…     

上海市SARS可疑病例主要呼吸道病毒培养检测

[目的]检测主要上呼吸道病毒，对上海市可疑SABS病例进行诊断排除。[方法]用MDCK、HEP-2、LLC三种定量混合细胞分离培养以及荧光抗体染色检测标本中主要呼吸道病毒。[结果]上海市24例SARS可疑病例检出甲3型流感病毒2例、乙型流感病毒5例、呼吸道合胞病毒1例、副流感病毒1例。[结论]采用流行病学、临床表现进行初步诊断，SARS可疑病例中有一部分患者是由常见呼吸道病毒引起的。     

HFRS病毒Z37株在绿猴肾传代细胞的病变作用和传代适应

[目的]研究肾综合征出血热（HFRS）病毒39疫苗株在绿猴肾传代细胞（vero,vero-E6)上的病变和传代适应增殖情况,为应用vero细胞研制出血热疫苗提供科学依据。[方法]将肾综合征出血热疫苗株Z37适应在绿猴肾传代细胞（vero,vero-E6)上,对细胞进行细胞病变（CPE）的动态观察,并于不同的时间取样,测定病毒滴度,比较静置培养、转瓶培养滴度的差异情况。[结果]Z37株不使vero-E6细胞产生病变,用HEPES诱导,3d可见明显病变现象。Z37株不使vero细胞产生病变,用HEPES诱导病变现象未获成功,Z37株在vero细胞中可高滴度繁殖,滴度达到10^7/ml,转瓶培养病毒滴度略高于静置培养。[结论]应用vero细胞研制HFRS疫苗是可行的。     

上海地区SARS患者冠状病毒样颗粒培养与分离

目的 对上海地区SARS患进行病原体的培养10分离。方法 复旦大学公共卫生学院与上海市疾病预防控制中心合作,对上海地区第1例、第2例SARS确诊病例咽拭标本接种多种细胞,进行病原分离、观察。结果 在第1例SARS确诊病例咽拭标本感染的Vero E6细胞观察到CPE;经超速离心、电镜负染观察见到了直径在60～100nm的冠状病毒样颗粒;感染的VeroE6细胞和病人血清间接荧光抗体显示阳性。此株冠状病毒样颗粒暂时命名为SARS—CoV—Fudan I株。结论 在上海市的第1例确诊SARS病例的咽试培养中,见到新型冠状病毒样的颗粒。     

应用柱层析法纯化狂犬病毒的初步研究

根据WHO规程要求，传代细胞制备的人用生物制品须经纯化。因此．我们应用超滤浓缩和柱层析技术，按WHO对Vero细胞狂犬疫苗的指标要求，对Vero细胞狂犬疫苗制备的下游纯化工艺进行了初步研究。1材料与方法1．1细胞与病毒培养Vero细胞源于ATCC株，由卫生部药品生物制品检定所提供。细胞培养采用10L转瓶常规培养、细胞代次控制在150代以内。种毒后7、11、14天收获培养液。1．2毒种使用CTN－V2狂犬病毒固定毒，Vero细胞适应株，由卫生部药品生物制品检定所提供。1．3检测指标及方法病毒毒力滴定及效力试验，均参照《中国生物制品规程》…     

严重急性呼吸综合征流行病学研究进展

自 2 0 0 2年 11月中旬我国广东省出现首例严重急性呼吸综合征 (SARS)病例 ,至 2 0 0 3年 6月 9日 ,全球共有 32个国家和地区出现SARS病例 ,确诊 84 2 1例 ,死亡 784例 ,治愈出院 6 2 80例[1] 。在世界卫生组织 (WHO)的协调下 ,全球 9个国家 13个实验室共同努力 ,仅用 3周时间就分离出SARS病毒 ,并完成全基因组测序 ,为诊断试剂和疫苗研制、药物筛选、新药开发等奠定了基础[2 6] 。现将近期有关SARS的流行病学研究进展综述如下。1.全球SARS的流行情况 :2 0 0 2年 11月 16日我国广东省佛山市发现首例SARS ,2 0 0 3年 1月本病开始…     

用Vero细胞从病人痰液中分离呼吸道合胞病毒的实验研究

目的：证实本次暴发流行的病原和Vero细胞分离RSV的效果，获得可用于疫苗研制的RSV毒株。方法：用Vero细胞从患儿痰标本中分离RSV并对分离到的毒株进行生物学特性研究。结果：从13例患儿痰标本中分离到3株可稳定传代的病毒株，经RSV单克隆抗体、RT-PCR扩增产物的核酸序列测定及CPE特征等证实为RSV。结论：本次婴幼儿呼吸道疾病暴发是由RSVA型所引起，Vero细胞分离RSV阳性率为23．1％。     

精制Vero细胞狂犬病疫苗的研制及免疫学效果观察

目的　以Vero细胞为基质，研制新一代精制Vero细胞狂犬病疫苗。方法　以CTN-1V10为生产毒株，以＜150代Vero细胞为培养基质，采用转瓶旋转培养，按不同时间收获病毒液，经过澄清、浓缩、纯化、灭活制成精制Vero细胞狂犬病疫苗。从以此工艺制备的疫苗中选取一批做为免疫学效果观察的受试疫苗。按暴露后免疫程序接种63人，其中受试疫苗接种33人，法国维尔博狂犬病疫苗接种30人，观察不良反应和测定中和抗体。结果　新研制的精制Vero细胞狂犬病疫苗各项指标完全符合WHO的有关质量要求。两种疫苗全程免疫后中和抗体阳转率均为100%，中和抗体受试组为11.94IU/ml;维尔博疫苗对照组为11.69IU/ml。结论　精制Vero细胞狂犬病疫苗不但制造工艺合理，而且副反应轻微，免疫原性良好。     

山东省急性弛缓性麻痹病例非脊髓灰质炎肠道病毒感染监测分析

[目的 ]了解山东省急性弛缓性麻痹 (AFP)病例非脊灰肠道病毒 (NPEV)的感染情况。 [方法 ]按照WHO规定的方法 ,对山东省 1 998～2 0 0 1年所有AFP病例的大便标本均采用RD、Hep 2和L2 0B细胞进行病毒分离鉴定。 [结果 ]共分离出 1 4 6株NPEV ,其中艾柯 (Echo)病毒占 56 1 6 % ,病毒型别分布广泛 ,夏秋季为NPEV流行高峰 ;5岁以下儿童分离率最高 ;多数NPEV感染者麻痹前均伴有发热、腹泻、颈项强直和肌肉疼痛 ,麻痹部位以单下肢、双下肢、四肢麻痹为主 ,发病60d后随访 2 7 40 %的病例仍残留麻痹 ;1 4 6例NPEV阳性的AFP病例中 ,疫苗相关病例 (VAPP) 1例 ,格林巴利综合征(GBS) 60例 ,脑脊髓炎 1 0例 ,其他非脊灰病例 75例 ;RD细胞对NPEV的分离率高于Hep 2细胞的分离率。 [结论 ]NPEV在山东省AFP病例中具有较高的感染率 ,今后应加强NPEV感染与AFP病因学的研究     

河南省一株SARS冠状病毒的分离与鉴定报告

目的细胞培养分离新型“SARS冠状病毒变异株”。方法采用Vero细胞组织培养方法获得河南一株SARS冠状病毒分离株,应用核糖核酸(RNA)和逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行病毒鉴定。结果在5个PCR扩增物中出现强阳性反映带;该毒株与北京SARS—CoVBJO1株进行DNA序列比较,在相应区域共2170bp的DNA序列比较,序列同源性为99.5%。结论证实该病毒是我省首次成功分离到一株新型SARS冠状病毒变异株。     

一种检测HFRS病毒滴度的新方法——微孔培养细胞IFA

检测出血热肾病综合症（HFRS）病毒滴度,以往一般采用乳小白鼠接种或Vero E6细胞培养瓶培养,然后冰冻切片或刮片,再免疫荧光法（IFA）测定。前一种方法虽较敏感,但必须具备特殊的饲养条件和冰冻切片机。Vero E6细胞容易培养,但检测多个滴度需要大量细胞,工作量较大,我们利用微孔培养细胞简便的特点,建立了直接在微孔板上进行IFA检测HFRS病毒滴度的方法,并与细胞培养瓶方法比较。 材料和方法 一、病毒:HFRS病毒Z_（10）株Ⅰ型,本文所测为4批疫苗病毒;Z_（37）株本室从HFRS患者血清中分离,经中国药品生物制品检定所疫苗一室（以下简称中检所）鉴定为Ⅱ型,76—118和UR株,分别为Ⅰ型和Ⅱ型国际标准株,由中检所惠赠。 二、Vero E6细胞:从中检所引进,本室传代。 三、抗流行性出血热病毒荧光抗体（抗-EHFV荧光抗体）:本室标记。 四、微孔培养细胞IFA（简称微孔法）:在96孔细胞培养板上制备Vero E6细胞单层;将病毒按10倍系列稀释,各取10ul病毒悬液接种入微孔中,每个稀释度4孔;置板于5%CO_2、37℃培养箱吸附1.5小时后,加MEM培养液继续培养6     

谈谈研制与开发SARS疫苗的几个阶段

众所周知 ,接种SARS疫苗是预防和控制SARS流行最有效的方法。最近 ,有人说SARS疫苗在3个月之内就能研制成功 ,但这种说法是不科学的。综观疫苗发展的历史 ,要研制成功一种新的疫苗 ,并不是一件很容易的事 ,长则8至10年 ,短则3至5年。现就研制SARS疫苗的几个阶段简述如下。1疫苗研制阶段我国学者已经成功分离出SARS病原体新型冠状病毒 ,这为研制SARS疫苗提供了必不可少的先决条件。研制阶段的研究内容包括 :(1)用人工方法大量培养SARS病原体新型冠状病毒 ,为SARS疫苗提供原料。 (2)确定SARS病原体新型冠状病毒的解毒方法 ,去…     

冻干精制Vero细胞流行性乙型脑炎灭活疫苗在流行区的人体反应及免疫效果

为了进一步观察冻干精制Vero细胞流行性乙型脑炎 (乙脑 )灭活疫苗 (Vero细胞乙脑疫苗 )的接种反应及免疫效果 ,在乙脑流行区江苏省苏州市吴中区选择 6～ 18月龄未接种过乙脑疫苗的健康婴幼儿为观察对象 ,分别接种Vero细胞乙脑疫苗、原代地鼠肾细胞 (PHK)乙脑灭活疫苗和乙脑减毒活疫苗。结果显示 :接种Vero细胞乙脑疫苗第 1剂后体温中、强反应率为 12 4 % ,未见局部及其它不良反应 ;接种第 2剂后无发热反应。用Vero细胞乙脑疫苗免疫 2针后 1个月 ,血清中和抗体阳转率和几何平均滴度 (GMT)分别为 10 0 0 %和 1∶2 7 7,显著高于PHK乙脑灭活疫苗和乙脑减毒活疫苗的免疫后血清学效果。用Vero细胞乙脑疫苗初免的儿童 ,1年后抗体阳性率与GMT分别为 88 3%和 1∶2 6 4 ,用同一种疫苗加强免疫后抗体阳性率与GMT分别为 10 0 0 %和 1∶2 80 1。此外 ,用Vero细胞乙脑疫苗对该区的 1～ 6岁已接种过乙脑疫苗的儿童进行加强免疫 ,结果显示 :免疫前阳性率与GMT分别为 6 8 2 %和 1∶10 2 ,免疫后阳性率为 10 0 0 % ,GMT达 1∶2 32 4 ,≥ 4倍增长率为 98 5 % ,加强免疫前后差异显著。由此可见 ,用Vero细胞乙脑疫苗对儿童进行初免或加强免疫 ,除初免第 1针有一过性发热外 ,无其它不良反应 ,血清学效果明显优于PHK乙