miR-196a在肝癌细胞中的表达及其促增殖作用

目的: 探讨miR-196a在肝癌组织的表达水平和对肝癌Hep3B细胞增殖的影响,阐明其促进肝癌细胞增殖的可能机制。方法: 收集20例肝癌组织及对应癌旁组织,培养人正常肝细胞株L02及肝癌细胞株SMMC-7721、HepG2和Hep3B,采用qRT-PCR法检测miR-196a mRNA在肝癌组织和对应癌旁组织及肝癌细胞株中的表达水平。取处于对数生长期人肝癌Hep3B细胞随机分为对照组、miR-196a mimics转染组和miR-196a inhibitors转染组,MTT法检测各组Hep3B细胞增殖活力,qRT-PCR法检测各组Hep3B细胞miR-196a的表达,流式细胞术检测各组Hep3B细胞周期变化,qRT-PCR和Western blotting法检测各组Hep3B细胞miR-196a潜在靶点叉头转录因子(FOXO1)的表达水平。结果: 肝癌组织中miR-196a mRNA表达水平明显高于相应癌旁组织(P<0.05);miR-196a mRNA在人肝癌SMMC-7721、HepG2和Hep3B细胞中的表达水平明显高于人正常肝L02细胞(P<0.05)。与对照组比较,miR-196a mimics转染组Hep3B细胞中miR-196a mRNA表达水平明显升高(P<0.05),而miR-196a inhibitors转染组Hep3B细胞中miR-196a mRNA的表达水平明显降低(P<0.05)。与对照组比较,miR-196a mimics转染组Hep3B细胞增殖率明显升高(P<0.05), miR-196a inhibitors转染组Hep3B细胞增殖率明显降低(P<0.05),且呈时间依赖性。与对照组比较,转染24 h时,miR-196a inhibitors转染组Hep3B细胞G₀/G₁期细胞百分率明显升高(P<0.05),S期细胞百分率明显降低(P<0.05)。与对照组比较, miR-196a mimics转染组FOXO1 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论: miR-196a可能通过FOXO1促进肝癌细胞的增殖,提示miR-196a可能成为肝癌诊断和治疗的新靶点。     

miR-214通过靶向调控E2F3抑制肝癌细胞的增殖

目的探讨miR-214通过靶向调控E2F转录因子3(E2F3)抑制肝癌细胞的增殖。方法 RT-PCR法检测细胞株SMMC-7721、Hep G2、SK-Hep-1和Huh 7中miR-214的表达量,并利用脂质体转染miR-214 NC及miR-214 mimics。采用MTT法检测miR-214对肝癌细胞活力的影响;Hoechst染色试剂盒检测miR-214对细胞凋亡的影响,流式细胞术检测miR-214对细胞周期的影响;Western blot及RT-PCR法检测miR-214对肝癌细胞中E2F3蛋白及mRNA表达量的影响,并通过荧光素酶报告基因进行验证。结果 SMMC-7721、SK-Hep-1、Huh 7及Hep G2中miR-214的表达量分别为(0.83±0.08)、(0.32±0.03)、(0.33±0.03)、(0.08±0.01),其中Hep G2中miR-214表达量最低,因此选用Hep G2作为后续实验细胞株。Hep G2细胞转染miR-214 NC及miR-214 mimics、miR-214mimics组中miR-214表达量(0.65±0.06)明显高于miR-214 NC组(0.14±0.01),miR-214 mimics组细胞活力(0.35±0.03)明显低于miR-214 NC组(0.69±0.06),miR-214 mimics组细胞凋亡率(36.37±3.43)%明显高于miR-214 NC组(3.74±0.34)%,miR-214 mimics组G1期明(57.79±5.78)显长于miR-214 NC组(45.319±4.53),miR-214 mimics组中E2F3蛋白[(0.23±0.02)、(0.24±0.02)]及mRNA表达量明显低于miR-214 NC组[(0.98±0.09)、(0.99±0.10)],差异均具有统计学意义(P0.01)。结论 miR-214过表达能通过下调E2F3表达抑制肝癌细胞的增殖。     

MicroRNA-124对喉鳞状细胞癌细胞自噬、侵袭和迁移的影响

目的探讨microRNA-124(miR-124)在人喉鳞状细胞癌(LSCC)组织中的表达及其对LSCC细胞自噬、侵袭和迁移的影响。方法选取2016年1月至2018年9月新乡医学院第一附属医院手术切除的LSCC组织及癌旁组织(距离肿瘤边缘1～2 cm)标本各12例,采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测LSCC组织和癌旁组织中miR-124表达;体外培养人Hep-2细胞,将其分为miR-124类似物(miR-124 mimics)组、miR-124抑制剂(miR-124inhibitor)组、类似物阴性对照(mimics NC)组、抑制剂阴性对照(inhibitor NC)组、mimics+西罗莫司组和inhibitor+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组,进行细胞转染;采用qRT-PCR检测miR-124 mimics组、miR-124 inhibitor组、mimics NC组、inhibitor NC组细胞中miR-124的表达水平,Western blot法检测LSCC组织、癌旁组织和mimics NC组、miR-124 mimics组、inhibitor NC组、miR-124 inhibitor组细胞中自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ的表达,Transwell小室法检测miR-124 mimics组、miR-124 inhibitor组、mimics NC组、inhibitor NC组、mimics+西罗莫司组和inhibitor+3-MA组细胞的侵袭能力,细胞划痕实验检测miR-124 mimics组、miR-124 inhibitor组、mimics NC组、inhibitor NC组、mimics+西罗莫司组和inhibitor+3-MA组细胞的迁移能力。结果 LSCC组织中miR-124相对表达量显著低于癌旁组织(P <0. 05)。LSCC组织中LC3B-Ⅱ蛋白表达显著高于癌旁组织(P <0. 05)。miR-124 mimics组细胞中miR-124相对表达量显著高于mimics NC组(P <0. 05),miR-124 inhibitor组细胞中miR-124相对表达量显著低于inhibitor NC组(P <0. 05)。miR-124 mimics组细胞LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量显著低于mimics NC组(P <0. 05),miR-124 inhibitor组细胞LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量显著高于inhibitor NC组(P <0. 05)。miR-124 mimics组侵袭细胞数显著少于mimics NC组和mimics+西罗莫司组(P <0. 05),miR-124 inhibitor组侵袭细胞数显著多于inhibitor NC组和inhibitor+3-MA组(P <0. 05)。划痕培养72 h后,inhibitor NC组和inhibitor+3-MA组细胞的划痕愈合率低于miR-124 inhibitor组(P <0. 05);培养96 h后,mimics NC组和mimics+西罗莫司组细胞的划痕愈合率高于miR-124 mimics组(P <0. 05)。结论人LSCC组织中miR-124表达显著下调,人LSCC组织和miR-124过表达细胞中自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ表达显著上调,miR-124可能通过抑制自噬而抑制LSCC细胞的侵袭和迁移能力。     

miR-144通过影响TLR/MyD88通路抑制肝癌SMMC-7721细胞侵袭

目的 探讨miR-144基因过表达对肝癌SMMC-7721细胞侵袭及Toll样受体（TLR）/髓样分化因子88（MyD88）免疫通路的影响。方法 培养人正常肝细胞HL-7702,肝癌细胞系SMMC-7721,采用荧光实时定量PCR法检测两组细胞miR-144基因表达差异,将SMMC-7721细胞分为空白组、miR-144 NC组、miR-144 mimics组,倒置荧光显微镜检测转染效率,qRT-PCR法检测转染后各组miR-144基因表达情况,通过细胞计数试剂盒（CCK8）法各组SMMC-7721细胞存活情况,通过Transwell法检测各组SMMC-7721细胞侵袭情况,应用免疫印迹法检测各组侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）以及TLR/MyD88通路相关蛋白表达情况,观察添加40 μmol/L MyD88抑制剂TJ-M2010-2组对SMMC-7721细胞TLR/MyD88通路相关蛋白表达情况。结果 与正常组相比,SMMC-7721组miR-144基因相对表达量显著降低（P<0.05）;与空白组、miR-144 NC组相比,miR-144 mimics组miR-144基因表达显著升高（P<0.05）;CCK-8实验显示,与对照组、miR-144 NC组相比,miR-144 mimics组转染48、72、96 h后细胞存活率显著降低（P<0.05）;与空白组、miR-144 NC组相比,miR-144 mimics组侵袭细胞数、MMP-2、MMP-9蛋白表达显著降低（P<0.05）;与空白组、miR-144 NC组相比,miR-144 mimics组、TJ-M2010-2组Toll样受体4（TLR4）、MyD88、磷酸化核因子-κB（p-NF-κB）/核因子-κB（NF-κB）蛋白表达显著降低（P<0.05）,miR-144 mimics组与TJ-M2010-2组TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。结论 miR-144过表达可能通过抑制TLR/MyD88通路转导降低SMMC-7721细胞存活、抑制SMMC-7721细胞侵袭。     

miR-143调控DNMT3B表达对肝细胞癌耐阿霉素敏感性的影响

目的:构建耐药细胞株SMMC-7721/ADM,探讨miR-143在调控肝细胞癌耐阿霉素中的作用机制。方法:采用逐步递增阿霉素浓度法构建耐阿霉素细胞株SMMC-7721/ADM,评估其IC₅₀值;采用荧光定量PCR技术检测miR-143、DNA甲基转移酶3B （DNMT3B）、多耐药基因1（MDR1）变化、Bax和Bcl-2 mRNA表达水平;Western blotting检测DNMT3B蛋白表达;通过转染miR-143 mimics上调耐药细胞株SMMC-7721/ADM中miR-143表达水平后,检测耐药细胞IC₅₀、侵袭能力、细胞凋亡、DNMT3B、MDR1变化。应用脂质体-2000瞬时转染miR-143 mimics于耐药细胞株,观察上述指标变化。结果:成功构建耐药细胞株SMMC-7721/ADM,IC₅₀值升高78.97倍（P<0.01）,miR-143表达量降低,DNMT3B、MDR1、Bax、Bcl-2表达量升高（P<0.05~P<0.01）。转染miR-143 mimics后耐药细胞株IC₅₀值降低57%,侵袭能力下降,细胞凋亡增加,DNMT3B表达减少,MDR1 mRNA表达减少（P<0.01）。结论:miR-143可能通过降低DNMT3B表达提高肝细胞癌对阿霉素的敏感性。     

miR-486-5p通过负向调控AMPK/Sirt1信号通路参与肝细胞性肝癌细胞增殖

目的:探究miR-486-5p在肝细胞性肝癌(HCC)中的变化及其调节HCC细胞系增殖的可能机制。方法:q-PCR法检测98例健康人血浆和87例HCC患者组织与血浆miR-486-5p含量,并采用Pearson相关性分析其与甲胎蛋白(AFP)升高的相关性,同时检测人HCC癌细胞系SMMC-7721、Bel-7402、MHCC97、HepG2、Hep3B、Huh-7、MS751和正常肝细胞LO2细胞及转染0,25,50,100μmol/L miR-486-5p类似物(miR-486-5p mimic) 24 h后LO2、MHCC97、HepG2和Huh-7细胞的miR-486-5p含量;CCK-8法检测转染miR-486-5p类似物2,12,24,48,72 h的LO2、MHCC97、HepG2和Huh-7细胞的增殖率;Western Blot检测Cyclin D1、Cyclin E1、CDK4、CDK6、p-AMPK、AMPK和Sirt1蛋白表达量;qPCR检测转染CCND1、CCNE、CDK4、CDK6 mRNA表达量。结果:HCC患者癌组织miR-486-5p含量明显低于癌旁组织,血浆中miR-486-5p含量明显低于正常人;HCC患者癌组织和血浆中miR-486-5p含量与血浆AFP含量呈显著负相关性,相关系数分别为-0. 1554和-0. 2228(P<0. 001);除Huh-7细胞外,人HCC癌细胞系SMMC-7721、Bel-7402、MHCC97、HepG2、Hep3B和MS751细胞中miR-486-5p含量明显低于LO2细胞(P<0. 05);相比于阴性对照类似物(NC)处理组,0至100μmol/L的miR-486-5p类似物处理LO2和Huh-7细胞24 h组的miR-486-5p水平均没有明显的变化(P>0. 05),50μmol/L和100μmol/L的miR-486-5p类似物处理24 h的MHCC97和HepG2细胞,相比于NC处理组,其miR-486-5p水平均显著增加(P<0. 05);miR-486-5p类似物处理LO2组的增殖率相比于NC和Control组无明显的变化。相比于NC和Control组,miR-486-5p类似物处理HepG2和MHCC97细胞24 h的增殖率相比于2 h的显著降低,分别为(77. 70±7. 53)%和(86. 61±1. 08)%。且具有时间依赖性。而miR-486-5p类似物处理Huh-7细胞48 h组增殖率为(84. 79±2. 33)%,明显低于2 h组;miR-486-5p类似物转染HepG2和MHCC97细胞24 h的Cyclin D1、Cyclin E、CDK6蛋白与mRNA表达量明显低于NC组(P<0. 05),HepG2的miR-486-5p类似物处理CDK4相比于NC组无明显变化(P>0. 05),MHCC97的miR-486-5p类似物组CDK4相比于NC组明显降低(P<0. 05)。p-AMPK与Sirt1蛋白水平均明显低于NC组。结论:过表达miR-486-5p通过下调p-AMPK/Sirt1通路阻断HCC肿瘤细胞细胞周期,并抑制癌细胞增殖。     

microRNA-616在肝细胞癌侵袭转移中的作用机制研究

目的探讨microRNA-616（miR-616）在肝细胞癌（HCC）中的表达及其在HCC侵袭转移中的作用机制。方法通过qRT-PCR检测miR-616在60例HCC及癌旁组织中的表达,同时检测miR-616在不同肝癌细胞系中的表达情况;免疫组织化学染色检测miR-616在HCC及癌旁组织中波形蛋白（vimentin）、上皮型钙黏素（E-cadherin）及同源性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）的表达情况;qRT-PCR检测miR-616在人正常永生化肝细胞（LO2）及5种不同肝癌细胞系（HepG2、SMMC-7721、Hep3B、Hu7）中的表达水平;使用miR-616抑制物作用Hep3B细胞,TranswellTM实验检测miR-616抑制后Hep3B细胞侵袭能力变化;应用miR-616抑制物及PTENsiRNA转染Hep3B细胞,qRT-PCR检测Hep3B中miR-616、vimentin、PTEN、E-cadherin的mRNA水平,Westernblot法检测癌细胞中vimentin、PTEN、E-cadherin的蛋白水平。结果miR-616在HCC组织中表达水平高于对应癌旁组织;miR-616在不同肝癌细胞系中表达均高于LO2细胞;miR-616高表达与低表达在血管侵犯、Edmonson-Steiner分级、TNM分期比较差异均有统计学意义(均P＜0.05);miR-616高表达肝癌组PTEN及E-cadherin水平低于miR-616低表达肝癌组,而vimentin水平高于miR-616低表达肝癌组,相关性分析结果显示HCC组织中miR-616与E-cadherin、PTEN水平呈负相关,与vimentin水平呈正相关;在肝癌细胞中抑制miR-616后PTEN及E-cadherin表达水平上调,而vimentin表达降低,Hep3B细胞的侵袭能力明显降低。结论miR-616在HCC组织中表达上调,其表达与HCC恶性临床病理特征有关,miR-616促进肝癌细胞侵袭转移的作用可能与其抑制PTEN表达及诱导上皮间质转化有关。     

Lin28与肝癌细胞紫杉醇耐药关系的研究

[目的]Lin28是一种重编程因子和保守的RNA结合蛋白,存在Lin28A和Lin28B两种同源基因,两者结构和功能类似。本研究旨在探讨Lin28与肝癌细胞对紫杉醇耐药的关系。[方法]MTT法检测紫杉醇对HepG2、Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞的IC50;用荧光定量PCR法（简称RTPCR）在RNA水平检测Lin28A和Lin28B在Hep3B、HepG2、SMMC-7721中的表达,蛋白质印迹法分析Lin28A和Lin28B蛋白在Hep3B、HepG2、SMMC-7721细胞中的表达情况。[结果]Hep3B、HepG2、SMMC-7721细胞株对紫杉醇的IC50分别为：Hep3B为0.194μM、HepG2为19.54μM、SMMC-7721为0.444μM。HepG2、SMMC-7721细胞株中的Lin28A基因表达量分别是Hep3B的5.06、3.10倍;HepG2、SMMC-7721细胞株中的Lin28B基因表达量分别是Hep3B的7.16、3.16倍。Hep3B、HepG2、SMMC-7721细胞株中Lin28A和Lin28B蛋白的表达量与从荧光定量数据显示的趋势一致。[结论]Lin28与肝癌细胞对紫杉醇耐药密切相关,肝癌细胞中Lin28表达与肝癌细胞对紫杉醇的耐药性成正比,暗示Lin28表达可能是肝癌细胞紫杉醇耐药的潜在机制并有望成为逆转肝癌紫杉醇耐药的靶点。     

miR-483在视网膜母细胞瘤细胞中的表达及其作用机制

目的探讨miR-483在视网膜母细胞瘤(RB)细胞中的表达及其分子机制。方法取正常视网膜细胞ARPE-19及对数生长期、生长状态良好的RB细胞Y79,通过反转录聚合酶链反应检测miR-483在Y79细胞及ARPE-19细胞中的表达。采用miR-483 minics及miR-483 inhibitors转染Y79细胞,双染法流式细胞术检测Y79细胞凋亡情况,流式细胞术检测Y79细胞周期。结果 miR-483在Y79细胞和ARPE-19细胞中的相对表达量分别为1. 83±0. 73、1. 29±0. 32,miR-483在Y79细胞中的相对表达量高于ARPE-19细胞(P <0. 01)。转染miR-483 minics后,Y79细胞凋亡率降低(P <0. 05),G1期延长(P <0. 05);转染miR-483 inhibitors后,Y79细胞凋亡率增加(P <0. 05),G1期缩短(P <0. 05)。结论 miR-483在RB细胞中呈高表达,下调miR-483的表达可能对RB细胞的增殖有抑制作用。     

MicroRNA-340在肝细胞肝癌中抑制细胞增殖并促进凋亡

目的 探讨微RNA-340(miR-340)在肝细胞肝癌中的表达特点及其对细胞生物学行为的影响.方法 收集重庆医科大学附属第一医院肝胆外科2015年3月至2016年9月收治的40例肝细胞肝癌患者手术后切除的癌组织和癌旁组织标本.通过qPCR检测组织标本中miR-340的表达,并分析miR-340表达与临床病理学指标的关系.分别培养肝癌细胞株Hep3B、Bel-7402、HepG2和SMMC-7721以及正常肝细胞株HL-7702,48 h后使用qPCR检测5种细胞中miR-340的表达水平.通过转染增加或抑制SMMC-7721细胞中miR-340的表达,然后分别于细胞培养24、48、72 h后采用CCK-8法检测SMMC-7721细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡.通过生物信息学软件预测miR-340的靶基因,并使用qPCR和蛋白质印迹法进一步验证miR-340对靶基因的作用.结果 癌组织中miR-340的表达低于癌旁组织(P＜0.01),并且miR-340的表达与乙肝表面抗原、HBV DNA载量、肿瘤大小以及临床TNM分期有关(P＜0.01).正常肝细胞HL-7702内miR-340的表达高于4种肝癌细胞Hep3B、Bel-7402、HepG2和SMMC-7721(P＜0.05,P＜0.01).增加miR-340表达可抑制SMMC-7721细胞的增殖(P＜0.05,P＜0.01),而抑制miR-340的表达则促进SMMC-7721细胞的增殖(P＜0.05,P＜0.01);增加miR-340的表达可促进SMMC-7721细胞的凋亡(P＜0.01),而抑制miR-340则减少凋亡(P＜0.01).生物信息学分析显示S期激酶相关蛋白2(SKP2)基因是miR-340下游的一个靶基因.qPCR和蛋白质印迹分析结果显示增加SMMC-7721细胞中miR-340的表达可抑制SKP2的mRNA和蛋白表达,抑制miR-340表达则增加SKP2的mRNA和蛋白表达.结论 miR-340的异常表达可能与乙肝病毒的感染有关,其异常表达有助于评价病情以及预后.在肝癌细胞系SMMC-7721细胞中,miR-340能够抑制细胞增殖并促进凋亡,这一作用结果可能是通过miR-340对SKP2的抑制而实现的.