重组腺相关病毒载体在中枢神经系统转基因研究中的应用

重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus,rAAV）作为转基因载体具有无神经毒性和低免疫原性等优点,因此在基因治疗的基础研究和临床应用领域倍受重视.在中枢神经系统（central nervous system,CNS）,以rAAV为载体已经成功转导了脑和脊髓的多个部位.随着国内外对rAAV载体研究的日趋深入,其优势已为学术界所公认,现已应用于数项CNS疾病临床前期的基因治疗,其有可能成为转基因治疗CNS疾病的最佳载体.     

不同血清型的重组腺相关病毒载体对成熟肌纤维转导的研究

目的探讨不同血清型对成熟肌纤维的转导效率.方法我们用不同的血清型AAV（rAAV-1,rAAV-2,rAAV-3和rAAV-5）表达LacZ和GDNF基因研究在小鼠骨骼肌转导效率,转基因表达用组化方法或ELISA来评定. 结果在3周龄的小鼠中,LacZ组化染色显示rAAV5在慢和快的肌纤维中都有效的转导,而rAAV2和rAAV3优先在慢纤维中转导.在8周龄的小鼠（成年鼠）中,rAAV3和rAAV5在慢纤维和快纤维中都有效的转导.用rAAV3-LacZ或rAAV5-LacZ优先转导的慢纤维与rAAV2相比没有显著性差异.用8周龄的小鼠肌肉注射不同血清型的rAAV-GDNF后,结果显示rAAVl-GDNF表达最高;rAAV2、rAAV3和rAAV5在骨骼肌的表达也有效.结论在肌肉基因转导中,rAAV3和rAAV5介导的载体都是有效的,能克服rAAV2所受到的限制.     

重组腺相关病毒对中枢神经系统特异性转染的基础研究

中枢神经系统(CNS)疾病的基因治疗研究中,基因转染载体的选择非常重要。在现有的病毒载体中,重组腺相关病毒(recombined adeno—associated virus,rAAV)安全性好,无致突变性和免疫原性,可以重复多次使用;同腺病毒相比,rAAV的弥散性更强;同单纯疱疹病毒相比,rAAV无神经毒性;rAAV     

携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒的包装

背景：细胞分裂周期2(cell division cycle 2, cdc2)在神经变性疾病如阿尔茨海默病的神经元变性过程中扮演了重要角色。以腺相关病毒为载体对cdc2基因进行沉默,可能对神经变性疾病的神经元起保护作用。 目的：包装携带cdc2-siRNA的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)。 设计、时间及地点：空白对照实验,于2007-10/2008-08在武汉同济医院神经科实验室完成。 材料：Helper Free 腺相关病毒系统(pAAV-MCS-EGFP、p-RC、p-Helper)及AAV-293细胞为Stratagene公司产品。 方法：应用分子生物学方法构建生成pAAV-MCS-U6-cdc2-siRNA-EGFP表达质粒;用磷酸钙法将该质粒和p-RC、p-Helper质粒共转染AAV-293细胞,包装生成携带cdc2-siRNA的重组腺相关病毒 (rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP)。病毒感染AAV-293细胞后行Western Blot 检测cdc2-siRNA对细胞内cdc2基因的沉默效果,并用斑点杂交方法测定该病毒的滴度。 主要观察指标：pAAV-MCS-U6-cdc2-siRNA-EGFP质粒中插入片段U6-cdc2-siRNA的测序;3质粒pAAV- MCS-U6-cdc2-siRNA-EGFP、p-RC、p-Helper共转染AAV-293细胞; rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP感染AAV-293细胞后cdc2的表达。 结果：①DNA测序证明U6-cdc2-siRNA已成功构建到表达质粒pAAV-MCS-EGFP中。②AAV-293细胞表达绿色荧光蛋白,共转染成功。③包装得到的重组腺相关病毒 (rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP)感染AAV-293细胞后能显著下调 AAV-293细胞cdc2基因的表达量。④rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP的滴度为1x1012 v.g/mL。 结论：携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒的包装获得成功,它具有沉默cdc2基因表达的功能。     

表达大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)腺相关病毒的构建及体外表达分析

目的构建携带大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因的重组腺相关病毒(AAV)载体,并检测体外表达目的基因的能力。方法应用基因克隆技术将大鼠BDNF的cDNA基因序列克隆入腺病毒质粒pAAV-MCS,PCR酶切测序鉴定序列。与AAV病毒包装质粒pAAV-RC、pHelper用磷酸钙法共转染HEK293细胞,包装得到含转基因过表达BDNF的病毒载体(rAAV-BDNF)。重组病毒感染体外培养的Hela细胞后,用RT-PCR和Western Blot方法检测细胞BDNF基因及蛋白表达情况,用ELISA法测定培养液中表达产物浓度。结果证实BDNFcDNA片段插入到病毒基因组内,并整合到宿主基因组后稳定表达,病毒滴度可以达到1.29×108PFU/mL。重组病毒感染Hela细胞后能高水平表达BDNF,ELISA结果表明,Hela细胞从病毒感染后第2天到第10天表达BDNF水平呈上升趋势,第10天达到2253pg/mL。结论成功地构建了表达BDNF基因的腺相关病毒载体,并可在体外高水平表达其所携带的目的基因,为将其进一步应用于神经系统损伤性疾病治疗的研究奠定了方法学基础。     

病毒载体在神经系统疾病基因治疗中的作用

本文综述了以病毒为载体的基因治疗的一般方法、治疗策略,病毒载体类型及其特征和在神经系统疾病中的应用前景。     

利用Helper-Free系统构建cdk5-siRNA腺相关病毒载体并鉴定

目的构建能表达CDK5特异性小干扰RNA(siRNA)(cdk5-siRNA)的重组腺相关病毒(AAV)载体,体外观察其对CDK5基因的沉默作用。方法采用基因克隆技术将合成的特异性cdk5 RNA干扰寡核苷酸序列克隆至AAV Helper-Free System中的表达质粒pAAV-MCS,构建出质粒pAAV-MCS-cdk5-siRNA,通过酶切测序鉴定重组质粒;将该质粒与系统中的控制质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper用磷酸钙法共转染HEK293细胞,包装得到表达cdk5-siRNA的重组腺相关病毒载体(rAAV-cdk5-siRNA);用斑点杂交法测定重组病毒的滴度,重组病毒感染体外培养的PC12细胞,W estern b lot检测其抑制cdk5表达的效果。结果成功构建并包装出重组腺相关病毒载体rAAV-cdk5-siRNA,病毒滴度达4×1013/m l,重组病毒感染后的PC12细胞cdk5表达明显下调。结论构建的重组腺相关病毒载体rAAV-cdk5-siRNA能明显干扰cdk5的表达,为将其进一步应用于神经变性疾病的治疗研究奠定了基础。     

腺相关病毒在中枢神经系统的转导与表达特性

正腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)由于自身独特的安全、高效、靶向性且可持续表达等优势在中枢神经系统(central nervous system,CNS)疾病治疗的应用上备受瞩目,本文主要讨论注射途径及时期、病毒类型、受体分布、启动子类型等对AAVs在CNS转导效率与表达的影响,安全性和免疫问题,旨在为AAV介导的中枢神经系统疾病的治疗提供较优的     

重组腺相关病毒（rAAV）介导基因SMCKA3999对Duchenne肌营养不良病理和功能的影响

目的　 研究重组腺相关病毒 (rAAV)载体介导的dystrophin小基因SMCKA3999治疗DMD模型鼠mdx ,从病理和功能观察rAAVSMCKA3999治疗对DMD模型小鼠mdx的疗效。方法　以dystrophin小基因SMCK A3999为目的基因 ,将SMCKA3999克隆至rAAV并包装成rAAVSMCKA3999,以 5× 10 10 病毒颗粒单点注射于DMD模型鼠mdx腓肠肌 ,基因治疗后 4个月及 7个月 ,采用免疫荧光、光镜组织病理、肌电图等方法 ,从形态和功能观察rAAVSMCKA3999治疗对DMD模型小鼠mdx的疗效。 结果　rAAVSMCKA3999使肌膜缺失的dys trophin恢复并稳定表达持续 7个月以上 ,肌肉组织病理改变好转 ,肌病肌电图改变明显改善 ,疗效持续 4个月以上。 结论　rAAVSMCKA3999能改善mdx小鼠骨骼肌的病理及功能 ,采用rAAV介导的dystrophin小基因SMC KA3999对Duchenne肌营养不良基因治疗是有希望的治疗方法。     

重组腺相关病毒载体介导的小基因SMCKA3999治疗对Duchenne肌营养不良肌力的影响

目的研究重组腺相关病毒载体(rAAV)介导的人dystrophin小基因SMCKA3999对DMD病理、肌力改变的治疗作用.方法将dystrophin小基因SMCKA3999克隆至rAAV并包装成rAAVSMCKA3999病毒,以5×109病毒颗粒多点注射于DMD模型鼠mdx腓肠肌,基因治疗4月后免疫荧光法检测肌膜dystrophin基因表达,治疗5月后采用肌肉离体灌注电刺激测定腓肠肌肌力,观察rAAVSMCKA3999对mdx鼠肌力的疗效.结果rAAVSMCKA3999有效稳定表达并使肌膜缺失的dystrophin恢复,明显改善mdx鼠肌力.结论rAAVSMCKA3999对DMD治疗有效,能显著改善mdx鼠肌肉功能,应用重组腺相关病毒载体介导的dystrophin小基因SMCKA3999是治疗DMD有希望的方法.     

重组腺伴随病毒载体在肿瘤基因治疗中的作用

腺伴随病毒(adeno-associated virus,AAV)是一种辅助依赖型的微小病毒。在基因治疗研究中,重组逆转录病毒和重组腺伴随病毒在基因转移载体中一直占主导地位,特别是用AAV作为基因转移载体已成为基因治疗研究的热点。本文仅就重组腺伴随病毒载体在肿瘤基因治疗中的作用的相关研究     

通用腺相关病毒载体构建及表达报告基因GFP的研究

目的　构建基因治疗通用型 AAV载体并检测它转导外源基因作用。方法　使用限制性内切酶切出p SSV9int-质粒中的 AAV病毒 Rep和 Cap基因元件后 ,插入了重组腺病毒专用穿梭质粒 -p ACCMVp L p A的含有CMV启动子、多克隆位点 (MCS)和多聚腺苷酸信号 (Poly A)的表达盒 ,构建了重组 AAV通用载体质粒 p SSHG-CMV。在该质粒 MCS插入 GFP基因后 ,我们使用 p SSHG-CMV-GFP、p GF14 0和 p AAV/Ad 3种质粒共转染 2 93包装细胞 ,制备 GFP重组 AAV,应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度度 ,并将该病毒感染新生大鼠星形胶质细胞 ,荧光显微镜观察 GFP表达。结果　重组 AAV的滴度在浓缩前可达 2× 10 11,浓缩后可达 2× 10 13 ,表明成功的构建了重组 AAV载体 ,插入外源基因 GFP后 ,在包装病毒和辅助质粒的联合作用下 ,能产生具有感染性的重组AAV。感染了重组 GFP-AAV的大鼠星形胶质细胞表达了明显的 GFP荧光。结论　本文构建的重组 AAV通用载体 p SSHG-CMV,可转导外源基因 ,用于基因治疗的研究     

低氧特异性重组腺相关病毒VEGF165的构建与表达

目的构建VEGF165低氧启动rAAV载体,用于缺血性脑血管病的治疗.方法通过分子生物学的方法,构建VEGF165低氧启动rAAV载体,采用磷酸钙和氯仿-PEG8000/NaCl-氯仿法构建低氧启动rAAV病毒.通过体内外低氧诱导,验证VEGF165低氧启动rAAV对低氧的特异性.结果体内外实验证实,VEGF165低氧启动rAAV仅在低氧诱导后表达具有生物活性的VEGF蛋白,对低氧具有特异性.结论VEGF165低氧启动rAAV构建成功,可望用于缺血性疾病的基因治疗.     

表达hVEGF165重组腺相关病毒对脊髓损伤的作用

血管内皮细胞因子曾经被认为是具有促血管生成作用的血管生长因子,如今,更多的研究将其应用于神经细胞缺血损伤的保护中。然而,一些研究却认为VEGF的应用使得脊髓损伤后脊髓的二次打击更加严重。为了探讨VEGF是否能够有效保护损伤的脊髓,我们在大鼠脊髓损伤模型中应用了表达hVEGF165的重组腺相关病毒。我们将大鼠随机分为假手术组,单纯脊髓损伤对照组,AAV-GFP组及AAV-VEGF 组。在相应时间点评估完神经功能后,我们将脊髓组织迅速取出。我们通过透射电子显微镜观察及TUNEl凋亡组织学染色观察在形态学角度评估凋亡的发生。应用免疫组化及Western blot评估凋亡蛋白Bax 和Bcl-2的表达。通过水通道蛋白-4（AQP-4）的免疫组化染色观察VEGF表达与脊髓损伤的相关性。实验结果显示,AAV-VEGF 组神经功能较对照组及AAV-GFP组有显著差异。(P < 0.05). VEGF能够明显抑制神经细胞的凋亡,减少运动神经元的损伤和丢失,减少细胞凋亡率。VEGF治疗组BAX蛋白表达减弱,Bcl-2蛋白表达加强,AQP-4表达减弱。所有结果表明VEGF具有对脊髓损伤神经的保护效应。     

重组腺相关病毒介导的Dystrophin小基因载体构建及在mdx鼠中表达

目的 :研究重组腺相关病毒载体 (rAAV)介导的人Dystrophin小基因 (SMCKA3 999)载体构建及在DMD模型鼠 (mdx鼠 )的表达。方法 :将SMCKA3 999质粒 ,包装质粒pXX2、腺病毒成分辅助质粒pXX6共转染 2 93细胞 ,包装重组腺相关病毒载体介导的SMCKA3 999基因 (rAAVSMCKA3 999) ,以斑点杂交法测定病毒滴度 ,将rAAVSMCKA3 999单点注射到mdx鼠腓肠肌 ,于注射后 7个月取肌肉提取蛋白质行Westernblot检测。结果 :经三质粒共转染法构建的rAAVSMCKA3 999病毒滴度为 5 0× 10 10 ,在mdx鼠骨骼肌表达持续 7个月以上。结论 :构建的rAAVSMCKA3 999载体为进一步DMD基因治疗研究奠定了基础。     

中枢神经系统基因治疗中病毒载体的研究进展

基因治疗关键在于选择或构建合适的载体。常用于中枢神经系统基因治疗的病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒载体等。不同病毒载体有各自优势和劣势。安全性、靶向性、高效性及神经细胞特异性是目前病毒载体的研究方向。     

人骨形成蛋白4基因腺相关病毒及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒体外诱导成骨的比较

背景：由于骨形成蛋白的释放速度与新骨生长速度不匹配,单纯应用骨形成蛋白的效果尚不理想,因此,应有合适的载体来调节骨形成蛋白的释放速度。目的：观察重组人骨形成蛋白4基因腺相关病毒及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的作用。方法：全骨髓法培养兔骨髓间充质干细胞,分别应用人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒载体及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒转染兔骨髓间充质干细胞,设定感染复数值为5×104,观察两组细胞形态改变,分别行碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色、茜素红染色及碱性磷酸酶含量测定,比较两组成骨活性差异。结果与结论：人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒组转染骨髓间充质干细胞后,细胞形态呈现典型的成骨改变,碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色、茜素红染色均出现成骨的特征性改变。绿色荧光蛋白基因腺相关病毒组未观察到上述改变。人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒组碱性磷酸酶含量高于绿色荧光蛋白基因腺相关病毒组(P < 0.01)。提示人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞表现出更加明显的成骨活性改变。     

腺相关病毒介导绿色荧光蛋白基因体外转染人羊膜上皮细胞☆

背景：人羊膜上皮细胞易于获得,采集简单,是细胞移植和组织修复的理想种子细胞,目前国内外尚无关于标记、示踪体外培养的人羊膜上皮细胞的报道。目的：探讨腺相关病毒载体介导绿色荧光蛋白基因对体外培养的人羊膜上皮细胞的转染效果。方法：取人羊膜标本,以胰蛋白酶消化法分离培养人羊膜上皮细胞,采用含绿色荧光蛋白的腺相关病毒进行转染,检测其转染效率。结果与结论：人羊膜上皮细胞可成功地在体外进行原代和传代培养,经含绿色荧光蛋白的腺相关病毒颗粒转染后,可稳定高效表达绿色荧光蛋白,转染效率达58%。     

低氧启动重组腺相关病毒的构建

目的构建低氧启动rAAV,介导目的基因仅在低氧时特异性高效表达.方法通过分子生物学的方法,分别构建pGL3-6 HRE-CMV-mp和pGL3-6 HRE-CMV-mp-WPRE载体,比较2种低氧启动子的特异性和在低氧时的启动能力.选择最佳的低氧启动子构建低氧启动rAAV载体.采用磷酸钙和氯仿-PEG8000/NaCl-氯仿法构建低氧启动rAAV病毒.rAAV病毒蛋白电泳和EGFP报告基因验证低氧启动rAAV病毒的构建和介导目的基因在低氧时的表达. 结果HRE-CMV-mp-WPRE是最佳的低氧启动子,在低氧时高效、特异的表达目的基因.低氧启动rAAV仅在低氧时介导报告基因EGFP的表达.采用6 HRE-CMV-mp-WPRE启动子的rAAV具有良好的低氧特异性和高效启动能力.结论采用最佳的低氧启动子,本研究实现了低氧启动rAAV的构建.     

人类免疫缺陷病毒相关神经系统疾病研究进展

自联合抗逆转录病毒疗法应用后,人类免疫缺陷病毒(HIV)相关神经系统疾病的流行病学和疾病谱发生较大变化.较常见的是HIV相关神经综合征,包括原发感染、机会性感染、免疫重建炎症综合征、抗逆转录病毒药物相关神经毒性作用等;以及老龄化相关疾病,包括HIV相关神经认知障碍、HIV相关脑血管病、HIV相关周围神经病等.本文综述H...