人巨细胞病毒AD169株引起小鼠脑部畸形的初步探讨

目的 :探讨人巨细胞病毒 (humancytomegalovirus ,HCMV)感染昆明小鼠的敏感性 ,建立HCMV致畸的动物模型。方法 :昆明系小鼠 4 0只 ,随机分为两组 :对照组 (8只 )和接种病毒组 (32只 ) ,病毒感染途径为脑内注射。在接种病毒 7,1 5 ,30 ,6 0d后不同时期分别以病理学方法观察动物脑部发育特点 ,以免疫组织化学方法检查病毒抗原 ,PCR方法检测动物脑组织中HCMV基因。结果 :接种HCMVAD1 69株的小鼠脑组织在不同时期发生了病理改变和脑部发育畸形 ,用免疫组织化学方法和PCR方法在脑组织细胞内检获HCMV抗原和基因。结论 :HCMVAD1 69株可引起小鼠脑部发育畸形 ,这对研究HCMV感染致畸的机制提供了有价值的参考依据     

人巨细胞病毒感染对小鼠脑组织同源盒基因表达的影响

目的研究小鼠脑组织同源盒基因（homeobox gene,Hox）的表达状态及人类巨细胞病毒（human cytomegalovims,HCMV）感染对小鼠脑组织Hox基因表达的影响,以探讨HCMV致畸的分子机制。方法昆明系小鼠48只,随机分为实验对照组（16只）和病毒感染组（32只）,病毒感染为脑内注射。在感染后7、15、30、60d分别以病理学方法观察病理损伤,以免疫组化方法检查HCMV—LA（1ateantigen）,PCR检测小鼠脑组织中HCMV—DNA。在建立HCMV脑部感染的小鼠模型基础上,用RT-PCR测定Hox基因在病毒感染组和实验对照组小鼠脑组织中的表达,并用同位素标记的cDNA探针进行Northern-blot检测相应的表达状况。结果（1）接种HCMVAD169株的小鼠脑组织发生了病理改变,免疫组化和PCR方法在神经细胞内查到了HCMV-LA和DNA;（2）RT-PCR和Northern-blot发现：对照组的小鼠脑组织表达Hox-A9、Hox-A11、Hox-A12和Hox-A13,但不表达Hox-B13;HCMV感染后,小鼠脑组织被诱导表达Hox-B13,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.01）,且于感染后的30d达到高峰,而Hox—A9、Hox—A11的表达下调（P〈0.05）;Hox—A10和Hox—A13的表达增强。结论HCMVAD169株可感染小鼠神经系统。HCMV感染可诱导小鼠神经系统发育基因Hox表达改变,这对研究HCMV感染致畸的分子机制提供了有价值的理论依据。     

HCMV感染小鼠脑组织的蛋白质组学研究

目的建立人类巨细胞病毒(HCMV)感染小鼠脑组织前后的比较蛋白质组学双向电泳技术研究体系。方法昆明系小鼠40只,随机分为两组:实验对照组(20只)和病毒感染组(20只),在接种HCMVAD169株30d后,取小鼠脑组织,研磨、超声裂解、抽提蛋白,采用双向凝胶电泳分离,进行染色,Image Master 2D Platinum软件分析、识别差异表达蛋白质,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到相应肽质量指纹图谱,搜索数据库鉴定部分差异蛋白质点,并对其中部分蛋白质的表达进行免疫印迹的验证。结果从双向电泳图谱上获得蛋白质斑点:实验对照组(1096±82)个,感染HCMV组(1210±101)个,发现显著差异点36个,对其中6个点进行了筛选鉴定;免疫印迹实验结果也较为吻合。结论利用蛋白质组学技术,检测正常小鼠脑组织及HCMV感染的小鼠脑组织的差异蛋白质,为疾病的早期诊断、致病机制及有效药物靶点的发现提供实验和理论依据。     

人巨细胞病毒感染Balb/c小鼠椎间盘的相关检测

目的 建立人巨细胞病毒(HCMV)感染Balb/c小鼠模型,探索HCMV感染椎间盘的依据.方法 取不同剂量组HCMV AD169株腹腔注射6～8周SPF级Balb/c小鼠♀♂各6只,同时设立灭活病毒对照组6只和细胞对照组6只.取各组小鼠椎间盘组织进行病毒分离与鉴定;采用PCR和RT-PCR分别检测HCMV UIJ83基因和UL154基因及其相应基因的转录;取椎间盘组织行HE染色病理并观察.结果 2×106和2×105 PFLJ/ml病毒组♀小鼠病毒分离、PCR及RT-PCR均为阳性;HE染色可见椎间盘组织局部灶性淋巴细胞浸润等慢性炎症反应,纤维环板层结构紊乱,关节软骨钙化层增厚,大量黏液及泡沫细胞,软骨下血管明显减少.♂小鼠、其它剂量病毒组、灭活病毒组和HF对照组均为阴性.结论 HCMV可以感染小鼠椎间盘组织,并与感染病毒剂量有关;人巨细胞病毒感染与椎间盘变性有相关性,可能是椎间盘退变的一个重要危险因素.     

HCMV体外感染小鼠胚胎成纤维细胞的研究

目的 观察人巨细胞病毒(HCMV)AD169株体外感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的生物学特征,为探讨HCMV AD169株能跨种属感染MEF提供依据.方法 将100 TCID50 HCMV AD169株病毒悬液接种至MEF和人胚胎成纤维细胞(HF)上,逐日观察HCMV特征性细胞病变效应(CPE);分别收集感染后1、3、5 d 的MEF和HF培养物,提取细胞DNA,采用实时荧光定量PCR检测HCMV立即早期基因(IE)拷贝数变化;分别采用HCMV立即早期基因(IE-1)、主要衣壳蛋白(MCP)和包膜糖蛋白(gB)单克隆抗体进行间接免疫荧光实验检测感染后的1、3、5 d MEF和HF中相应病毒蛋白的表达.结果 观察到HCMV AD169株接种MEF出现病毒所致CPE,与HF出现的CPE相似;实时荧光定量PCR检测HCMV IE基因拷贝数发现,MEF在HCMV AD169感染后的1、3、5 d,病毒基因拷贝数呈增长趋势,但均低于相同时间点的HF中病毒拷贝数;间接免疫荧光检测HCMV感染MEF和HF后1、3、5 d HCMV IE-1、MCP和gB蛋白表达情况时发现,在MEF上HCMV IE-1、MCP和gB蛋白表达随时间延长呈增强趋势.结论 HCMV AD169株可以体外感染MEF,并在其中复制增殖.     

HCMV感染动物生殖细胞的实验研究

目的 探讨HCMV感染是否引起大鼠和家兔的睾丸、卵巢组织的损伤。方法 将人巨细胞病毒AD169毒株经静脉接种50只大鼠和30只新西兰兔，30d后以原位杂交和免疫组化方法检验病毒感染动物组织的证据，以组织病理学方法检查动物睾丸、卵巢组织的病理变化。结果 接种病毒之动物睾丸、卵巢组织内可查到病毒抗原或基因，睾丸组织多见生精细胞变性、坏死，精细胞减少甚至消失。结论 HCMV感染可以导致动物睾丸组织生精细胞损伤和生精功能下降。     

人巨细胞病毒感染Balb/c小鼠椎间盘的相关检测

目的建立人巨细胞病毒(HCMV)感染Balb/c小鼠模型,探索HCMV感染椎间盘的依据。方法取不同剂量组HCMV AD169株腹腔注射6~8周SPF级Balb/c小鼠♀♂各6只,同时设立灭活病毒对照组6只和细胞对照组6只。取各组小鼠椎间盘组织进行病毒分离与鉴定;采用PCR和RT-PCR分别检测HCMV UL83基因和UL54基因及其相应基因的转录;取椎间盘组织行HE染色病理并观察。结果2×106和2×105PFU/m l病毒组♀小鼠病毒分离、PCR及RT-PCR均为阳性;HE染色可见椎间盘组织局部灶性淋巴细胞浸润等慢性炎症反应,纤维环板层结构紊乱,关节软骨钙化层增厚,大量黏液及泡沫细胞,软骨下血管明显减少。♂小鼠、其它剂量病毒组、灭活病毒组和HF对照组均为阴性。结论HCMV可以感染小鼠椎间盘组织,并与感染病毒剂量有关;人巨细胞病毒感染与椎间盘变性有相关性,可能是椎间盘退变的一个重要危险因素。     

人胚肺成纤维细胞感染人巨细胞病毒不同时间病毒载量的分析

目的:检测人巨细胞病毒(HCMV)感染人胚肺成纤维细胞(HELF)后不同时间点HCMV DNA载量,以明确HCMV感染HELF的时效性.方法:将HCMV接种HELF细胞,收集感染后3,5,8,10,15,20,30,60,120 min时间点细胞,提取病毒DNA,以即刻早期1基因(IE-1)为靶基因进行荧光定量PCR检...     

HCMV急性间质性肺炎小鼠模型的建立

目的建立人巨细胞病毒( HCMV)急性间质性肺炎的小鼠模型。方法用5.5×105 PFU的HCMV AD169株尾静脉注射6~8周SPF级BALB/c小鼠作为实验组,同时设立正常细胞作为对照组,分别于接种后第5天和第30天处死小鼠,无菌取小鼠肺组织,通过病毒分离、PCR检测病毒特定保守基因、免疫组化、Western blot和HE染色的方法,观察检测小鼠肺组织中HCMV及其组织病理变化。结果在感染后第5天和第30天实验组小鼠的肺组织中分离出了HC-MV病毒;PCR检测到HCMV 特异性早晚期基因IE和UL55 DNA;Western blot、免疫组化检测到HCMV特异性早晚期蛋白IE和gB;HE染色证实肺组织有明显急性间质性肺炎的病理改变;对照组对应结果全为阴性。结论通过尾静脉注射HCMV AD169株病毒,在感染后第5天成功构建了HCMV急性间质性肺炎小鼠模型,该模型的建立有利于该种疾病的发病机制研究及相关抗病毒疫苗和药物的研发。     

MCMV感染同种异型皮肤移植小鼠间质性肺炎模型的建立

目的 建立小鼠巨细胞病毒(MCMV)经鼻腔急性感染同种异型皮肤移植BALB/c小鼠间质性肺炎模型.方法 ① 25只供体C57BL/6雌鼠与100只受体BALB/c雌鼠背部皮肤移植后,每只小鼠腹腔注射环孢素A(CsA,12 mg/kg),连续14 d.② 移植受体小鼠随机分为5组,其中4组每只鼻腔接种30 μl不同剂量MCMV悬液(102、103、104、105 PFU/只),另一组为正常对照组,小鼠鼻腔接种原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)悬液30 μl/只.在接种后第5、9、14、21天处死小鼠,无菌取肺组织分别做HE染色、透射电镜、PCR、RT-PCR检测MCMV Smith毒株的即刻早期(IE)和晚期基因糖蛋白B(gB)基因转录产物,并进行原位杂交和免疫组织化学实验.结果 104、105 PFU实验组小鼠肺组织有局灶性的病理损害,并发现感染后第14天肺组织病理改变最明显;透射电镜检测到疱疹样病毒颗粒;PCR、RT-PCR检测实验组MCMV IE和gB基因及其转录产物均为阳性;两组原位杂交和免疫组织化学检测均可见肺间质上皮细胞中存在病毒核酸和蛋白;并在感染后的21 d内,105 PFU组小鼠相比对照组有明显的临床表现.结论 成功建立同种异型皮肤移植后MCMV急性感染所致的小鼠间质性肺炎模型.     

HCMV大小鼠眼组织损伤模型的初步研究

为探讨低温技术在胎羊体外循环中的应用,将12头孕齿120－140d的白山羊随机分为常温组（37℃,n=6)和低温组（28℃,n=6),建立胎羊体外循环模型,体外转流1h,监测胎羊和母羊的体温、血压、心率和血气值。结果显示,低温转流中胎羊心率减慢,血液PH值下降明显。转流后低温组胎羊较常温组出现更为严重的低氧,高碳酸血症和酸中毒（P＜0．05）,血压下降明显,心率减慢,其中2头胎羊心脏停跳。表明胎羊体外循环中低温对胎儿－胎盘单元更为不利。     

H CM V 兔胚肺细胞体外感染模型的建立

为探讨人巨细胞病毒（ＨｕｍａｎＣｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ,ＨＣＭＷ）ＡＤ１６９毒株体外感染兔胚肺细胞（ＲａｂｂｉｔＥｍｂｒｙｏＬｕｎｇｃｅｌ,ＲＥＬ）的敏感性,建立ＨＣＭＶＡＤ１６９毒株感染模型,将ＨＣＭＶＡＤ１６９毒株定量接种于ＲＥＬ,观察细胞病理变化;用单克隆抗体－免疫组化方法检测细胞内ＨＣＭＶ抗原;电镜检测细胞内病毒颗粒,用ＥＬＩＳＡ方法检测经ＲＥＬ增殖病毒培养物ＨＣＭＶ抗原滴度,用人胚肺细胞（ＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏＬｕｎｇｃｅｌ,ＨＥＬ）滴定病毒毒力变化。结果表明,接种病毒后,ＲＥＬ于４８ｈ出现细胞肿胀,胞浆内出现折光性颗粒,逐渐变圆、脱落,其病变特征与该病毒在ＨＥＬ增殖出现的病变一致;用免疫组化法在胞浆及其核内查到ＨＣＭＶ抗原;用透射电镜观察,在细胞核内查到大量病毒颗粒;用ＥＬＩＳＡ方法在ＲＥＬ病毒培养物中查到ＨＣＭＶ抗原,抗原滴度与ＨＥＬ增殖的病毒一致;与ＨＥＬ增殖物比较,经ＲＥＬ增殖的病毒培养物毒力降低１００ＴＣＩＤ５０。表明ＲＥＬ是ＨＣＭＶＡＤ１６９毒株的敏感宿主细胞。     

人NSCs分化的Astrocyte系中HCMV感染的建立

目的研究HCMV能否感染体外培养的由人海马神经干细胞（NSCs）分化成的星形胶质细胞（astrocyte）。方法体外分离、培养人NSCs,诱导其定向分化为星形胶质细胞,观察细胞的形态学特点并分别进行免疫荧光鉴定。然后用HCMVAD169株感染分化细胞,观察细胞形态变化,检测胞内病毒蛋白表达,并收集感染细胞的培养液,添加到正常人胚肺细胞中,观察有无典型细胞病变出现。结果体外原代培养的人NSCs绝大多数都表达巢蛋白（nestin）,诱导其分化为星形胶质细胞后,细胞高表达神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。HCMVAD169感染细胞7d后,细胞出现肿胀、变大变圆等典型病变,胞核内检测到HCMV即刻早期基因表达产物-IE蛋白,添加感染细胞的培养液到人胚肺细胞中,细胞也出现典型病变。结论上述结果说明：在体外培养的由人NSCs分化成的星形胶质细胞中,HCMVAD169能够建立增殖性感染,这可能与先天性感染导致脑发育异常有关。     

两种不同属源巨细胞病毒对树鼩肝细胞易感性的研究

目的研究不同属源巨细胞病毒（cytomegalovirus,CMV）株对树鼩原代肝细胞的易感性。方法分离培养树鼩原代肝细胞,利用感染剂量MOI为1的小鼠CMV（MCMV）Smith和人源性CMV（HCMV）AD169病毒株感染肝细胞,同时设立非病毒感染组（即空白对照组）,间接免疫荧光法检测肝细胞内及周边PP65蛋白表达。RT-PCR法检测培养肝细胞内MCMVSmithM152和HCMVAD169UL49mRNA。结果间接免疫荧光法可以观察到HCMVAD169组肝细胞内外均有PP65蛋白表达,提示病毒复制旺盛,而MCMVSmith组和非病毒感染组则显示PP65抗原不表达,RT-PCR结果确证树鼩肝细胞内有HCMVAD169UL49mRNA表达,未显示MCMVSmithM152mRNA表达,而非病毒感染组UL49和M152mRNA均不表达。结论HCMVAD169能感染体外培养的树鼩原代肝细胞,而MCMVSmith则不能。     

Effect of Human Cytomegalovirus Infection on Nerve Growth Factor Expression in Human Glioma U251 Cells

Objective To explore the change of endogenic nerve growth factor （NGF） expression in human glioma cells infected with human cytomegalovirus （HCMV）. Methods U251 cells were cultured in RPMI 1640 culture medium and infected with HCMV AD 169 strain in vitro to establish a cell model of viral infection. Morphologic changes of U251 cells were observed under inverted microscope before and after infection with HCMV. Expression of NGF gene and protein of cells was detected by RT-PCR and Western blotting before and after infection with HCMV. Results The cytopathic effects of HCMV-infected cells appeared on day 5 after infection. However, differential NGF expression was evident on day 7. NGF expression was decreased significantly in U251 cells on day 7 after infection in comparison with control group （P〈0.05）. Conclusion HCMV can down-regulate endogenous NGF levels in human glioma cell line U251.     

Experimental Study of Mouse Cytomegalovirus Infected Mice

In order to investigate the human cytomegalovirus (HCMV) infection,the mouse cytomegalovirus(MCMV) infected mice were experimentally studied 6 to 8 week old female BALB/C mice with immunosuppression were selected to undergo the MCMV inoculations:intracranial inoculation and peritoneal inoculation. MCMV of the infected mice in various organs and tissues were detected by usingβ-gal staining and in situ nucleic acid hybridization assay.The pathological changes were observed in HE staining and in situ nucleic acid hybridization assay.The pathological changes were observed in HE staining paraffin-embedded sections.It was found that all the MCMV infected mice showed the retardation of growth and development,and feather looseness.Both intracranial inoculation of 10^4 PFU viruses or peritoneal inoculation of 10^6PFU viruses resultedin the pathological changes,to some extent,of various organs and tissues in the mice,The pathological changes in liver were consistent with the amount ofβ-gal staining positive the viruses in the immunosuppressed mice subjected to intracranial inoculation could spread to whole body organs,while the viruses in the immunosuppressed mice subjected to intrapeitoneal inoculation couldn‘t spread to the brain,suggesting blood-brain barrier could prevent the virus from spreading to the brain.     

不同感染状态下人巨细胞病毒基因活性的实验研究

目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)潜伏和活动性感染状态下病毒基因复制特点。方法选择两种不同滴度HCMV感染传代培养的人胚肺成纤维细胞,建立持续稳定感染和活动感染细胞模型。在感染不同时段,分别采用FQ-PCR和RT-PCR法监测HCMVDNA复制及其主要衣壳蛋白(MCP)mRNA转录情况,光镜观察致细胞病变作用(CPE)、电镜检查细胞超微结构改变。结果两组细胞内均检测到HCMVDNA复制,但活动性感染的B组细胞内HCMVDNA负荷量显著高于A组(P<0.05),其复制速度也较快,并且检测到了水平逐渐升高的MCPmRNA转录,细胞出现进行性加重的CPE和超微结构改变;而潜伏感染的A组未检到MCPmRNA,亦未发现细胞病变。结论高负荷量HCMVDNA复制和晚期蛋白MCPmRNA转录是HCMV活动性感染的重要特点。