第2代测序技术在甲基丙二酸尿症以及苯丙酮尿症诊断中的应用

目的 探讨第2代测序技术在儿童常见遗传代谢病诊断中的价值, 提出遗传代谢病诊断的新策略。方法 采用目标区序列捕获及第2代高通量测序技术对临床诊断的3例甲基丙二酸尿症、2例苯丙酮尿症患儿进行检测, 同时采用Sanger测序技术对患者突变进行验证。结果 3例甲基丙二酸尿症患儿检测发现均为MMACHC基因突变, 其中1例为c.80A > G(P.Q27R)和c.609 G > A (P.W203X)复合杂合突变, 1例为c.394C > T(P.R132X)和c.567dupT(P.I190fs)复合杂合突变, 另1例为c.80A > G(P.Q27R)和c.271dupA(P.R91fs)复合杂合突变。2例苯丙酮尿症患儿检测发现PAH基因突变, 其中1例为c.158G > A(P.R53H)和c.838G > A(P.E280K)复合杂合突变, 另1例为c.158G > A(P.R53H)和c.1238 G > C (P.R413P)复合杂合突变, 上述突变均为已知致病突变位点杂合突变;Sanger测序结果与第2代测序结果相符合。结论 本研究提示第2代测序技术具有低成本、高通量、高敏感度以及可灵活设计的特点, 可作为儿科临床常见遗传代谢病基因诊断的首选工具。     

一代二代联合测序快速鉴定肝豆状核变性及家系溯源研究

目的：探索二代测序筛选和一代测序验证的快速准确诊断罕见遗传病肝豆状核变性的检测方法和流程。方法：提取先证者DNA并构建高通量测序文库后通过二代测序鉴定其可能致病位点;再提取包括先证者在内的该家系13位成员DNA,设计引物并对目标片段PCR扩增后进行双相一代测序验证。结果：先证者的ATP7B基因外显子8中检测出1个杂合错义突变（rs121907990;chr13:51937570）;家系成员共查出3位携带同一杂合错义突变者,先证者ATP7B突变来源于母系。结论：本研究设计的联合二代测序检测与一代测序验证的肝豆状核变性基因突变位点的快速鉴定技术和流程图,可能为罕见遗传病基因突变致病位点提供可借鉴的检测模式,为早期高效精准确诊罕见遗传病提供帮助。     

多种方法结合对一个肾单位肾痨患者家系的基因筛查验证

目的:探讨少年型肾单位肾痨1型(NPHP1)的临床特点基因诊断方法,采用多种方法对其家系进行筛查验证。方法:2018年7月我院基因诊断中心收入1例男性肾衰患儿(14岁),收集分析其临床资料,利用二代测序技术对其进行基因检测。确诊后扩增患儿及其父母弟弟的NPHP1基因内多个微卫星标记以及内参标记位点,同时采用琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳技术,对患儿弟弟进行筛查验证。结果:二代测序结果显示该患儿样本NPHP1基因整体纯合缺失,该变异为致病性变异,结合临床表现确诊为NPHP1。琼脂糖凝胶电泳结果显示该患儿NPHP1基因前后内参标记D2S1896,RanBP11/12阳性,微卫星标记del-2,del-5-(5)2,del-9,del-10,del-16均为阴性;该患儿父母和弟弟NPHP1基因内参和微卫星标记均为阳性。内参及微卫星序列的毛细管电泳结果显示该患儿弟弟NPHP1基因同时存在来自于父亲和母亲的序列片段,排除该致病基因的纯合或杂合缺失。结论:利用毛细管电泳技术检测NPHP1基因微卫星标记,判断该位点纯合或杂合性缺失,简单易行,可作为常规筛查手段辅助肾单位肾痨的诊断。     

假肥大型肌营养不良一个核心家系DMD基因分析

目的 对临床诊断的假肥大型肌营养不良1例患儿进行基因诊断,同时进行携带者筛查.方法 采用目标区序列捕获及第2代高通量测序技术对假肥大型肌营养不良患儿进行检测,同时采用Sanger测序技术对患者及其父母的基因型进行验证.结果 发现患儿DMD基因第45外显子存在1个纯合无义突变c.6589A＞T（P.Lys2197X）,患儿母亲为杂合突变携带者.结论 本研究发现了一个尚未报道的致病性基因突变位点,同时发现第2代测序技术可以快速准确检测出DMD基因的点突变,具有一定的临床应用价值,为遗传咨询提供准确信息.     

宏基因组二代测序技术辅助肺部肿瘤诊断的临床病例分析

目的 回顾性分析肺癌患者临床资料,探讨宏基因组二代测序技术利用人源序列在辅助临床肺部肿瘤诊断中的应用价值。方法 回顾性分析2021年8月26日—12月18日期间4例疑似肺部感染住院患者支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）的宏基因组二代测序结果、常规临床检测结果及其临床诊疗信息。结果 患者1的胸部CT检查初步诊断为肺癌,另外3例患者的胸部X线或CT检查分别显示双肺团块样及片状高密度影（患者2）、双肺团块样及片状高密度影（患者3）和肺部肿物性质待查（患者4）。4例患者BALF标本的肿瘤宏基因组二代测序结果均提示肿瘤信号预警。此外,患者3 BALF标本的依据人源序列的宏基因组二代测序结果同时检出与BALF临床培养结果一致的白色假丝酵母,患者4的宏基因组二代测序结果同时检出临床未鉴定出的A型鼻病毒。结论 依据人源序列的基因组二代测序技术既可以辅助临床进行感染鉴别诊断,也可以辅助临床进行肿瘤早期诊断。     

二代测序技术在脓毒症病原学诊断中应用进展

脓毒症是一种由感染所致生理、病理和生化异常的临床综合征,常危及生命,近年来其发生率和病死率均有增多趋势。脓毒症的早期诊断和治疗能有效降低病死率。当前,病原菌培养是脓毒症病原学诊断的主要方法,但是病原菌培养需要数天至数周的时间,使得在临床上无法及时应用针对性的抗菌药物,从而延缓了有效治疗。目前,二代测序技术不断成熟,它检测病原体的速度快、范围广,现已成为感染性疾病中病原学诊断的有效手段,本文就二代测序技术的概念、功能以及二代测序技术在脓毒症病原学诊断中的作用展开论述。     

一例GNB1基因突变致神经发育障碍患儿的临床及基因突变分析

目的：应用全外显子测序技术（whole exome sequencing, WES）对患有语言运动发育迟缓及严重智力障碍的患儿及其父母进行分析,探讨基因水平的遗传学病因并明确临床诊断,进一步指导妊娠。方法：提取患儿及其父母外周血DNA,采用外显子捕获结合高通量测序技术进行检测。根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG, 2015）标准对患儿及父母检测出的变异进行致病性判定,结合患儿表型寻找致病基因及位点。利用Sanger测序法对致病位点进行验证。结果：患儿GNB1基因第7号外显子c.346 G>A (p.G116S)位点杂合错义突变为致病位点,患儿父母该位点均为野生型,此变异为患儿的新发突变。Sanger测序验证结果与外显子捕获测序结果一致。患儿为常染色体显性智力低下42型（Autosomal dominant mental retardation-42, MRD42）患者。结论：应用全外显子测序技术可对语言运动发育迟缓伴严重智力低下的患儿进行诊断,明确了该患儿的致病原因,有助于家系的遗传咨询并为再生育提供指导。     

GNB1基因突变致神经发育障碍患儿的临床及基因突变分析

目的：应用全外显子测序技术（whole exome sequencing,WES）对患有语言运动发育迟缓及严重智力障碍的患儿及其父母进行分析,探讨基因水平的遗传学病因并明确临床诊断,进一步指导妊娠。方法：提取患儿及其父母外周血DNA,采用外显子捕获结合高通量测序技术进行检测。根据美国医学遗传学与基因组学学会标准对患儿及父母检测出的变异进行致病性判定,结合患儿表型寻找致病基因及位点。利用Sanger测序法对致病位点进行验证。结果：患儿GNB1基因第7号外显子c.346 G>A（p.G116S）位点杂合错义突变为致病位点,患儿父母该位点均为野生型,此变异为患儿的新发突变。Sanger测序验证结果与外显子捕获测序结果一致。患儿为常染色体显性智力低下42型（autosomal dominant mental retardation?42,MRD42）患者。结论：应用全外显子测序技术对语言运动发育迟缓伴严重智力低下的患儿进行诊断,可明确患儿的致病原因,有助于家系的遗传咨询并为再生育提供指导。     

宏基因二代测序与传统检测方法在中枢神经系统感染中的对比观察

目的：探讨宏基因二代测序技术对中枢神经系统感染精准诊疗的价值。方法：分析选取2019年5月～2021年5月在河北北方学院附属第一医院神经内科住院,且临床诊断为中枢神经系统感染60例病例,收集患者的脑脊液（cerebro-spinal fluid,CSF）和宏基因二代测序法（metagenomics next-generation sequencing,mNGS）相关资料。结果：所选病例包括细菌感染42例,病毒感染16例,寄生虫感染2例。脑脊液mNGS对细菌性感染的诊断阳性率为95.24%,对病毒性感染的诊断阳性率为68.75%,寄生虫感染的诊断阳性率为50%。mNGS的曲线下面积（areaunder the curve,AUC）为0.705,诊断价值中等,与AUC=0.5的诊断参考线比较,P<0.05,差异有统计学意义。结论：宏基因二代测序技术对中枢神经系统感染的诊断较敏感,在中枢神经系统感染的精准化诊断方面具有独特优势。     

宏基因二代测序在儿童血流感染中的应用

目的 分析宏基因二代测序(metagenomics next-generation sequencing,mNGS)技术在儿童发热血流感染中的诊断价值,并为临床合理调整治疗方案提供依据.方法 选择2019年1月-2020年3月在海口市人民医院儿科住院治疗的25例临床疑似血流感染的患儿,分别留取标本进行血培养和mNGS病...     

一例TSC2基因新发突变导致结节性硬化症病例分析

对1例散发性结节性硬化症(Tuberous sclerosis complex,TSC)患儿进行TSC1及TSC2基因检测,探讨其可能的发病机制。采集患儿及其父母外周血提取基因组DNA,通过二代测序(Next generation sequencing,NGS)技术对患儿TSCl和TSC2基因的全部外显子及其侧翼序列进行测序,对其父母行Sanger测序验证,采用多重连接探针扩增技术（multiplexligation-dependent probe amplification,MLPA）检测患儿TSC1和TSC2基因大片段缺失,分析TSC的发病机制、临床特点和基因突变特征。本例患儿,男性,8个月龄,临床表现为癫痫发作及皮肤损害,查体：颜面部、左上、下肢皮肤可见4处牛奶咖啡斑,直径均大于5 mm。头颅磁共振成像示脑内多发异常信号及脑室内异常结节。NGS测序提示TSC2基因c.340G>T杂合突变,Sanger测序验证其父母均无上述变异,MLPA检测未发现患儿TSC1、TSC2基因存在大片段变异。TSC2基因c.340G>T点突变可能是该患儿结节性硬化症的致病突变。     

Ⅰ型神经纤维瘤一家系的基因检测及产前诊断

目的: 对一个Ⅰ型神经纤维瘤家系进行遗传学病因分析及产前诊断。方法: 应用目标捕获高通量测序和Sanger测序技术,对一个散发的Ⅰ型神经纤维瘤家系进行基因突变分析。提取先证者及其父母外周血淋巴细胞RNA,行RT-PCR及扩增产物测序分析。明确突变致病性后,抽取羊水标本对胎儿行产前基因诊断。结果: 先证者NF1基因存在c.1260+4A>T杂合剪接突变,为新发突变。RNA剪接分析提示先证者NF1基因发生转录时,11号外显子3'端发生相邻内含子区13个碱基的插入,理论上可导致蛋白编码提前终止,产生截短蛋白,影响蛋白功能。产前基因检测结果显示胎儿未携带该突变。结论: NF1：c.1260+4A>T杂合剪接突变是该Ⅰ型神经纤维瘤患者的致病原因,本研究结果为该家系遗传咨询和产前诊断提供了理论依据。     

肾上腺皮质癌患儿TP53基因的一个新生殖系突变

目的 研究1例肾上腺皮质癌患儿TP53基因突变情况,为该病的基因诊断与遗传咨询提供依据.方法 提取1例肾上腺皮质癌患儿及父母外周血基因组DNA,针对TP53基因设计特异性引物,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增基因的全部编码及侧翼序列,对扩增产物进行直接测序.结果 PCR结合DNA测序发现患者TP53基因第5外显子存在异常:第522与523位核苷酸间插入一个鸟嘌呤(c.522-523insG),导致P53蛋白DNA结合域第175位密码子由精氨酸(R)变为丙氨酸(A),并从突变位置起发生移码,产生移码突变(p.R175AfsX6).患者父亲带有相同的突变,而母亲未发现此突变.结论 TP53基因p.R175AfsX6生殖系突变是导致该例患者肾上腺皮质癌的特异突变.     

Drop-off微滴式数字PCR检测急性髓系白血病NRAS基因突变及其临床应用

目的： 建立检测急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）神经母细胞瘤RAS病毒癌基因同源物（NRAS）基因突变的drop-off微滴式数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）方法,并评价该方法的临床应用价值。方法: 针对NRAS G12和G13突变位点设计特异性drop-off ddPCR引物和探针,建立最佳反应体系,并对该方法进行性能验证。应用该方法对140例临床样本进行初筛,其检测结果与Sanger测序进行比较,并用二代测序（next generation sequencing,NGS）进行验证。结果:建立drop-off ddPCR检测NRAS基因G12/G13突变的方法,灵敏度达0.158%,重复性、线性良好,其空白限为5.40拷贝数/μL,最低检测下限为15.84拷贝数/μL。在140例初诊AML患者中,drop off ddPCR检出NRAS突变28例（20%）,其突变负荷为0.26%~52.85%（中位2.14%）;而Sanger测序仅检出7例（5%）阳性,为进一步验证,将21例Sanger测序结果阴性而drop off ddPCR检测阳性的样本进行NRAS基因NGS,检出14例阳性,而另外7例NGS阴性的样本,其drop-off ddPCR检测突变频率为0.53%~1.50%（中位1.10%）。结论: 建立了drop-off ddPCR技术检测AML患者中NRAS基因突变的方法,该方法灵敏度高,可用于对NRAS基因G12/G13突变进行定量检测,有望可用于AML患者预后判断和疾病监测。     

联合氧化磷酸化缺陷症1型一家系临床表型及GFM1基因突变分析

目的: 分析一个联合氧化磷酸化缺陷症1型家系的临床表型及遗传学特点,明确其遗传学病因。方法: 对先证者父母外周血DNA行全外显子组测序,对先证者（已故）干血斑标本、胎儿（先证者弟弟）羊水和先证者父母亲外周血行Sanger验证。结果: 全外显子组测序和Sanger测序显示,先证者及其弟弟均为GFM1基因c.688G>A（p.G230S）与c.1576C>T（p.R526X）复合杂合突变,其中c.1576C>T系首次报道。先证者及其弟弟出生后均出现代谢性酸中毒、高乳酸血症、肝功能异常、喂养困难、小头畸形、生长发育落后、癫痫等临床表现,均在婴儿早期死亡。结论: GFM1基因c.688G>A与c.1576C>T复合杂合突变是导致该家系联合氧化磷酸化缺陷症1型的遗传学原因。     

一例β-地中海贫血病例中罕见基因突变的鉴定

目的 对海口市人民医院血液科一例47岁男性经临床检查存在贫血、脾大等症状的疑似β地中海贫血的先证者进行病因确诊,并对其家系成员进一步研究分析。方法 采用血常规、脾脏B超、血红蛋白电泳、跨越断点PCR （Gap-PCR）和高通量测序（next generation sequencing, NGS）技术对先证者和5名家系成员进行检测,评估他们贫血、脾脏肿大和基因突变等方面的情况,采用Sanger测序法对高通量测序所检测出的基因突变进行验证,并通过家系连锁分析确定所检测基因突变的遗传方式。结果 先证者同时检测出HBB:c.2T>G和HBB:c.-113A>G两种突变,其中HBB:c.2T>G为常见β突变,HBB:c.-113A>G为新的突变,其母亲及儿子均检出HBB:c.-113A>G杂合突变,其女儿检出HBB:c.2T>G杂合突变,除先证者外其他家系成员并未表现出明显的地贫症状。结论 HBB:c.2T>G杂合复合HBB:c.-113A>G杂合突变会加重β地贫的临床表现,进而表现出脾大症状,该基因突变的发现,丰富了地贫基因突变数据库。全面的检测技术应用于地贫常规检测对临床病人的病因确诊、治疗和遗传咨询都具有重要意义。     

Exome sequencing identifies compound heterozygous PKHD1 mutations as a cause of autosomal recessive polycystic kidney disease

Background  Autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) is a rare inherited disease, which is a disorder with multiple organ involvement, mainly the kidney and liver. It is caused by mutations in the PKHD1 gene. Here, we reported the clinical characteristics of a case with ARPKD and analyze the genetic features of this patient as well as of his father using targeted exome sequencing and Sanger sequencing.

Methods  Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes obtained from a patient with ARPKD. The mutations were identified using exome sequencing and confirmed by Sanger sequencing.

Results  The patient was diagnosed as ARPKD based on ultrasonography and abdominal computed tomography which showed polycystic changes, multiple calcinosis of both kidneys, and multiple dilated bile ducts of the liver. Compound heterozygous PKHD1 gene mutations A979G and G5935A, which lead to substitution of an asparagine for an aspartate at amino acid 327 (N327D) and a glycine for an arginine at amino acid 1979 (G1979R) respectively, were identified using targeted exome sequencing and confirmed by Sanger sequencing for the patient. In addition, the father of the patient was identified to be a carrier of heterozygous A979G mutation of this gene.

Conclusions  We identified that the compound heterozygous PKHD1 gene mutations are the molecular basis of the patient with ARPKD. Targeted exome sequencing is suitable for genetic diagnosis of single-gene inherited diseases like ARPKD in which the pathogenic gene is a large.     

Rett综合征致病基因突变与临床表型的研究

目的 分析Rett综合征的临床特征、分子遗传学特点、扩展表型和报道新发突变,提高对本病的早期鉴别和诊断。方法 收集2017年1月至2019年12月于安徽医科大学第一附属医院儿科就诊的5例Rett综合征患儿临床资料,采用全外显子测序及一代验证方法明确Rett综合征相关突变基因。结果 5例患儿中4例为典型Rett综合征,1例为非典型Rett综合征;其中肾源性血尿等表型既往未见报道;所有患儿均发现MECP2基因的杂合突变,其中4例为点突变,1例为插入突变,该插入突变位点为首次报道,且为罕见男性患儿,其突变遗传自具有表型的母亲;余均为新发的女性患儿,父母表型正常。结论 Rett综合征具有阶段性发展特征,其临床个体差异性较大,基因检测有助于早期确诊。     

一例TSC2基因低比例突变嵌合体基因学分析

目的: 对一例临床表现不典型的结节性硬化症（TSC）患者进行基因突变分析以明确诊断。方法: 收集一例临床上拟诊TSC的患者及其父母的外周血,通过全外显子组测序技术对先证者TSC1和TSC2基因的全部外显子及其侧翼序列进行测序,确定候选致病突变位点,同时对先证者及其父母的外周血DNA进行Sanger测序验证,并用液滴数字PCR技术确定先证者体细胞中该突变嵌合比例。结果: 先证者的TSC2基因第11号外显子存在c.1096G>T（p.E366*）杂合无义突变,为微小突变峰,突变比例未高于其突变阈值,不排除嵌合体的可能。液滴数字PCR结果提示,先证者为c.1096G>T点突变嵌合体,嵌合比例为14%。结论: 先证者TSC2基因发生体细胞镶嵌突变,c.1096G>T可能是该TSC患者的致病原因。液滴数字PCR有助于体细胞镶嵌突变嵌合体的确诊。