PRR11调节肺癌细胞系A549侵袭迁移的分子机制研究

目的：PRR11（proline rich protein 11）是近年来发现的一个肿瘤相关基因,前期研究结果显示其高表达对于肺癌等恶性肿瘤细胞的侵袭迁移具有重要作用,本研究为了更进一步研究其促进肺癌细胞侵袭转移的分子机制。方法：综合利用siRNA敲减、划痕及迁移实验、Western blot及免疫荧光等方法分析人肺癌细胞系A549沉默PRR11表达后细胞侵袭迁移能力下降的分子机制。结果：PRR11沉默后,划痕及Transwell实验结果表明,PRR11沉默明显减弱了A549细胞运动、侵袭及迁移能力。进一步定量qRT-PCR及Western blot检测发现,PRR11稳定沉默导致上皮细胞标志分子E-cadherin明显上调、而EMT上游关键转录因子Twist1及间质细胞标志分子N-cadherin表达下调,另外免疫荧光染色结果同样显示Twist1及N-cadherin下调明显。结论：肺癌细胞系A549中PRR11可能通过调节Twist1等EMT关键分子的表达在细胞侵袭转移过程中起关键作用,为进一步探索PRR11在肺癌中的作用机制奠定了基础。     

沉默APE1对非小细胞肺癌细胞的放射敏感性的影响研究

目的 研究脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶-1（APE1）对非小细胞肺癌细胞放射敏感性的影响。方法 采用免疫组化染色检测手术标本切片（非小细胞肺癌组织20例及癌旁组织5例）中APE1的表达,Western blot与实时荧光定量（qRT）-PCR检测非小细胞肺癌细胞系（A549,H460,H1299）及肺正常上皮细胞系中APE1的表达;Western blot检测辐照A549与H460细胞0~6 Gy后APE1的表达;构建沉默APE1的A549与H460稳定细胞株后,Western blot检测其辐照6 Gy后APE1的蛋白表达;细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成率;CCK-8检测细胞增殖;细胞术流式检测细胞凋亡。结果 非小细胞肺癌组织及细胞系中APE1的表达明显上调;辐照能诱导非小细胞肺癌细胞APE1的表达,且表达随辐照剂量增高而上调;沉默APE1能有效地抑制辐照诱导A549与H460细胞中APE1的表达;成功构建沉默APE1的A459、H460稳定细胞株;沉默APE1联合辐照进一步抑制了非小细胞肺癌细胞克隆形成率、细胞增殖率,同时促进细胞凋亡（ PAPE1可增强非小细胞肺癌细胞的放射敏感性。     

铁转运蛋白影响非小细胞肺癌增殖迁移的研究

目的 观察铁转运蛋白(FPN)在非小细胞肺癌(NSCLC)中差异表达及探讨FPN作用NSCLC细胞迁移与增殖的机制.方法 免疫组化(IHC)检测肺癌标本(60例)及正常肺组织标本(20例)FPN表达水平.蛋白免疫印迹(Western blot)检测细胞系中FPN表达水平.分别构建FPN过表达体系(PCDH-FPN-F)和敲低体系(shFPN),通过West-emn blot和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证.划痕实验检测FPN对肺癌细胞迁移的影响.生长曲线法检测FPN对肺癌细胞增殖能力的影响.结果 相比于正常肺组织,肺癌组织标本中FPN表达显著降低(P = 0.000);相比于正常肺细胞系,肺癌细胞系中FPN表达量显著降低(P＜0.000 1).与对照组比较,过表达组FPN表达量显著升高(Western blot:P＜0.01,qRT-PCR:P＜0.000 1);与对照组比较,敲低组 FPN 表达量显著降低(Western blot:P＜0.001,qRT-PCR:P＜0.001).过表达FPN后,细胞划痕间伤口愈合距离在18 h和36 h明显低于对照组;细胞数目在第2天和第4天明显低于对照组.而敲低FPN后,细胞划痕间伤口愈合距离在18 h和36 h明显高于对照组;细胞数目在第2天和第4天明显高于对照组.结论 低表达FPN后,肺癌细胞迁移及增殖能力增强,这可能是肺癌中FPN差异表达的原因.     

染色质重塑因子1在肺癌中过表达并促进肺癌增殖能力

目的 检测染色质重塑因子1(Rsf-1)对肺癌增殖能力的影响,初步探讨Rsf-1促进肺癌增殖的分子机制.方法 应用Western blot方法筛选Rsf-1高表达人肺癌H1299、H460细胞系,通过小干扰RNA (siRNA)方法干扰内源性Rsf-1表达,并检测干扰效率.应用集落形成、流式细胞术检测Rsf-1干扰前后肺癌细胞增殖能力的变化.应用Western blot检测干扰内源性Rsf-1表达前后肺癌细胞中增殖相关因子的变化.结果 Western blot结果显示:肺癌细胞中Rsf-1蛋白表达水平明显高于正常支气管上皮HBE细胞系,其中H1299、H460细胞中存在非常明显的Rsf-1高表达.转染Rsf-1特异的siRNA于高表达Rsf-1的H1299和H460细胞后,其克隆形成明显少于对照组(H1299细胞中对照组和干扰组分别为123±15和83±9; H460细胞中对照组和干扰组分别为218±18和112±17)(P＜0.05).流式细胞术结果显示:干扰内源性Rsf-1表达后,H1299和H460细胞中Gt期细胞比例增多(H1299细胞中对照组和干扰组分别为56％±5％和71％±7％;H460细胞中对照组和干扰组分别为53％±4％和70％±6％),S期细胞比例减少(H1299细胞中对照组和干扰组分别为17％±2％和11％±5％;H460细胞中对照组和干扰组分别为19％±2％和10％±5％).细胞周期相关蛋白检测结果:干扰内源性Rsf-1表达后,H1299和H460细胞中cyclinD1和磷酸化细胞外调节蛋白激酶(pERK)水平明显下调.干扰Rsf-1在下调H1299和H460细胞pERK蛋白表达的作用结果与应用细胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂U0126相似.结论 Rsf-1可通过cyclinD1/ERK相关通路促进肺癌细胞的增殖.     

不同肺癌细胞系趋化因子受体CXCR4蛋白及mRNA的表达

目的 了解不同组织来源的肺癌细胞系中趋化因子受体CXCR4蛋白水平和mRNA水平表达情况.方法 选取不同组织来源的四株肺癌细胞系A549、H460、95D和GLC80,用Western blot法和RT-PCR法检测CXCR4蛋白和mRNA的表达.结果 不同组织来源的肺癌细胞系A549、H460、95D和GLC80中均表达CXCR4蛋白,表达水平依次减低且差异明显(P＜0.05);四种肺癌细胞中CXCR4 mRNA的表达也表现为依次降低,且CXCR4在蛋白水平和mRNA水平的表达差异呈现一致.结论 CXCR4在不同组织来源的肺癌细胞中都有表达,但表达水平不同,CXCR4的表达可能与肺癌细胞组织来源、恶性程度以及转移性有关.     

臭椿酮对人非小细胞肺癌H460细胞的抑制机制研究

目的探究臭椿酮抗非小细胞肺癌H460细胞的作用及分子机制。方法 CCK8法检测臭椿酮对非小细胞肺癌H460细胞增殖的影响;Cultrex细胞迁移和侵袭法检测臭椿酮对细胞迁移和侵袭的作用;细胞免疫荧光检测臭椿酮对细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表达的影响;Western blot检测臭椿酮对细胞蛋白激酶B(Akt)、蛋白酪氨酸激酶Src(Src)磷酸化和Cyclin D1蛋白表达的影响。结果 CCK8结果表明,与0μM浓度(100.00±6.02)%比较,不同浓度(0.2μM,0.4μM,0.6μM,0.8μM,1.0μM)臭椿酮处理下H460细胞活力下降[(75.00±2.88)%,P0.05;(55.33±1.40)%,(42.33±3.52)%,(32.33±1.45)%,(27.00±1.15)%,P0.01];Cultrex 96孔细胞迁移法检测结果显示,与二甲基亚砜(DMSO)组(100.00±7.21)%比较,臭椿酮组(35.25±3.46)%H460细胞迁移率降低(P0.01);Cultrex BME细胞侵袭法显示,与DMSO组(100.00±7.00)%比较,臭椿酮组(27.00±4.07)%细胞侵袭率降低(P0.01);细胞免疫荧光实验显示,与DMSO组(50.00±1.73)%比较,臭椿酮组(14.67±1.20)%Cyclin D1阳性细胞比例明显下降(P0.01);Western blot结果显示,H460细胞在臭椿酮处理后Akt和Src的磷酸化明显降低,同时Cyclin D1表达明显下降。结论臭椿酮抑制非小细胞肺癌H460细胞的增殖、迁移和侵袭,其作用机制可能是抑制Akt磷酸化抑制细胞迁移和侵袭,同时抑制Src磷酸化抑制细胞周期相关蛋白Cyclin D1表达。     

沉默HMGA基因对非小细胞肺癌A549细胞增殖和转移的影响及机制

目的：研究沉默HMGA1 和HMGA2 基因的表达对非小细胞肺癌细胞A549恶性增殖和转移的影响及其机制。方法：通过MTT实验测定HMGA1和HMGA2基因沉默之后,A549细胞的增殖能力;通过流式细胞术测定HMGA1和HMGA2基因沉默之后,A549细胞凋亡的情况;利用划痕实验测定分别沉默HMGA1和HMGA2基因的表达之后,A549细胞的转移能力;用Q-PCR和Western blot分析HMGA1和HMGA2基因沉默后,抑制A549细胞增殖和转移的分子机制。结果：siRNA-HMGA1和siRNA-HMGA2 干扰A549 细胞48 h后,A549 细胞的生长活力降低（P ＜0.05）。Q-PCR结果显示,siRNA-HMGA1 干扰A549 细胞48 h之后,导致细胞凋亡相关基因FOXM1和c-Myc的相对表达量降低（P ＜0.05）,但对细胞侵袭转移相关基因E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin的表达没有影响（P ＞0.05）。Western blot实验结果进一步证实siRNA-HMGA1干扰A549细胞后,可抑制FOXM1和c-Myc蛋白水平的表达（P ＜0.05）。Q-PCR结果显示,siRNA-HMGA2不仅可以导致FOXM1和c-Myc的表达量降低（P ＜0.05）,还可促进细胞侵袭转移相关基因E-Cadherin的表达,并抑制N-Cadherin和Vimentin的表达（P ＜0.05）。Western blot结果进一步证实,沉默HMGA2在A549细胞内的表达后,会导致FOXM1和c-Myc表达量的降低（P ＜0.05）,E-Cadherin表达量的增加（P ＜0.05）,同时引起N-Cadherin和Vimentin表达量的降低（P ＜0.05）。结论：HMGA1和HMGA2基因沉默后,通过下调FOXM1和c-Myc的表达诱导A549细胞凋亡;HMGA2表达的沉默通过下调N-Cadherin和Vimentin的表达,上调E-Cadherin的表达抑制A549细胞的转移。     

DOT1L对骨肉瘤MG63细胞生物学行为的影响及其作用机制

目的 探讨抑制组蛋白H3赖氨酸79（H3K79）甲基转移酶DOT1L基因对骨肉瘤MG63细胞增殖、迁移、DNA损伤的影响及可能的作用机制。方法将hDOT1L-shRNA质粒转染至骨肉瘤MG63细胞（hDOT1L-shRNA组）,同时设置shRNA阴性对照组（Scramble组）。采用实时荧光定量PCR检测DOT1L mRNA的表达水平,MTT法检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,TUNEL法和彗星实验检测细胞DNA损伤。Western blot检测MG63细胞中DOT1L、H3K79me2、Histone H3、Sirt1、XPA蛋白的表达水平。结果转染后,与Scramble组相比,hDOT1L-shRNA组MG63细胞中DOT1L mRNA及蛋白表达水平下调（P<0.05）,细胞增殖能力降低（P<0.05）,细胞迁移率降低（P<0.05）,DNA损伤程度加剧（P<0.05）。Western blot检测结果显示,与Scramble组相比,hDOT1L-shRNA组MG63细胞中细胞Histone H3总量差异无统计学意义(P>0.05),其他DOT1L、H3K79me2、Sirt1、XPA蛋白表达水平均降低。结论DOT1L可能通过DOT1L/H3K79me2-SIRT1-XPA信号通路抑制骨肉瘤MG63细胞增殖、迁移并诱导其DNA损伤。     

TFF1在肺癌中的表达及作用研究

目的 研究三叶因子1（TFF1）在肺癌组织及肺癌细胞株中的表达、甲基化状态及其功能。方法 选取98 例非小细胞肺癌患者手术切除的肺癌组织,采用RT-PCR、MSP 检测TFF1 在肺癌组织中的表达与甲基化状态,分析其与患者临床特点的相关性,以及检测肺癌细胞株H23、H1299、L78、H446、H157 及95D 中TFF1 的表达和甲基化状态以及5-aza-2''-deoxycytidine（DAC）处理后细胞株中TFF1 表达的变化。TFF1 转染H23 细胞株,MTT 法及克隆形成实验检测其增殖能力和克隆能力的变化,细胞凋亡实验及Western blot 检测凋亡相关蛋白Caspase3 表达水平。结果 TFF1 在肺癌组织中的甲基化率为56.1%（55/98）。TFF1 甲基化与肺癌患者的TNM 分期和淋巴结转移显著相关（P＜0.001）。TFF1 在H23 和H157 中无表达,在H1299、H446 及95D 中表达较低,在L78 中表达较高。DAC 处理后,细胞株TFF1 表达的变化分别为表达恢复（H23、H157）,表达增强（H1299,H446,95D）和无明显改变（L78）。恢复表达TFF1 后,H23 细胞株的增殖及克隆形成能力明显减弱（P＜0.05）,细胞凋亡率和凋亡相关蛋白Caspase3 活性片段的表达明显增加。结论 TFF1 在肺癌组织中的甲基化状态与肺癌的TNM 分期和转移密切相关。TFF1 在肺癌细胞中的表达受DNA 甲基化的调控。肺癌细胞株H23 中恢复表达TFF1 可以抑制其增殖和克隆能力,促进其凋亡。     

RIP1在肝癌组织中的表达意义及其对细胞侵袭、迁移的影响

探讨受体相互作用蛋白激酶-1(RIP1)在肝癌组织及癌旁组织中的表达情况,并探索其对肝癌细胞侵袭和迁移的分子调控机制。收集肝癌和癌旁组织,免疫组化检测RIP1蛋白的表达,筛选高表达RIP1的肝癌细胞系。对肝癌细胞系进行RIP1沉默处理并设置阴性对照。采用western blot及RT-PCR法检测RIP1的表达量;Tranwell观察细胞侵袭能力;细胞划痕观察细胞迁移能力。结果显示, 48例肝癌组织中,22例存在RIP1蛋白阳性表达,阳性率为45.83%,其中,强阳性患者为15例,中等及弱阳性7例,该研究中有6例复发患者。RIP1在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P＜0.05),高表达RIP1患者的总生存率和无复发生存率显著低于低表达RIP1的患者(均P＜0.05)。抑制RIP1基因后其相对表达量、细胞侵袭、迁移能力均下降(P＜0.05)。RIP1在肝癌中存在高表达,可能参与肝癌细胞侵袭与迁移过程。     

miR-203通过靶向FABP4抑制肺癌细胞的转移

目的探讨脂肪酸转运蛋白4（FABP4）对肺癌细胞转移能力的影响并研究靶向FABP4 的miRNA。方法通过ELISA 和western blot 检测不同转移能力的肺癌细胞FABP4 表达情况。通过shRNA减少FABP4 表达或慢病毒过表达FABP4,观察 其对肺癌细胞转移能力的影响。通过miRNA数据网站预测靶向FABP4 的miRNA,并用Q-PCR检测其在不同转移能力的肺 癌细胞的表达情况。结果高转移能力的NL9980、H661、95C肺癌细胞中FABP4 的表达较低转移能力的L9981、A549、PC13 显著增加（P<0.05）。降低NL9980 细胞中FABP4 的表达,其转移能力被显著抑制（P<0.05）;而过表FABP4 后,A549 转移能 力显著增强（P<0.05）。miR-203、miR-361 和miR-539 在高转移能力的肺癌细胞中表达较低转移的显著减少（P<0.05）,并且 miR-203 抑制NL9980 细胞FABP4 表达的作用最强。过表达靶向FABP4 位点突变的FABP4 蛋白,可以显著减少miR-203 对 NL9980 细胞转移能力的抑制（P<0.05）。结论FABP4 可以促进肺癌细胞的转移;而miR-203 可靶向抑制FABP4 表达,进而 抑制肺癌细胞的转移。     

FOXC2在非小细胞肺癌细胞株及组织中的表达及意义

目的:研究叉头框C2(Forkhead box c2,FOXC2)在人非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)细胞株和组织中的表达水平,并探讨FOXC2与临床病理因素的相关性。方法:应用RT-PCR方法检测FOXC2在人肺癌细胞株A549和H460中mRNA水平的表达情况,并与永生化人支气管上皮细胞株16HBE进行比较;应用免疫组化(IHC)方法检测FOXC2蛋白在66例NSCLC组织和8例癌旁肺组织中的表达情况,并分析FOXC2表达与NSCLC患者临床病理因素的关系。结果:肺癌细胞株A549和H460中FOXC2的mRNA表达水平高于永生化人肺上皮细胞株,差异有统计学意义(P<0.05);FOXC2蛋白在NSCLC组织中表达高于癌旁组织,与肺癌组织淋巴结转移密切相关(P<0.05),而与患者年龄、性别、吸烟、组织学类型、分化程度和TNM分期无明显相关(P>0.05)。结论:FOXC2可能在促进NSCLC的发生和发展过程中发挥了重要的作用,有望作为评估临床肺癌患者预后的指标。     

微小 RNA -7 过表达对人肺癌细胞体内外转移的影响简

目的 探讨过表达miR-7对人肺癌细胞体内外转移的影响.方法 将真核表达载体pcDNA3.1（-）-pri-miR-7（命名为p-miR-7）体外瞬时转染人肺癌95D细胞后,划痕法检测细胞的体外迁移情况;侵袭实验检测细胞侵袭能力的改变;建立人肺癌裸鼠体内转移模型,HE染色观察过表达miR-7对肺部肿瘤转移的影响;免疫荧光技术检测肿瘤转移相关蛋白Sema4C蛋白的表达.结果 过表达miR-7可显著抑制人肺癌细胞的体外迁移和侵袭能力（P＜0.05）;与对照组相比,过表达miR-7组未观察到明显的肺部肿瘤细胞转移灶（P＜0.05）;免疫荧光结果显示,过表达miR-7组中,肿瘤细胞内Sema4C蛋白表达量显著降低（P＜0.05）.结论 过表达miR-7可以显著抑制人肺癌细胞体外及体内的转移能力,提示miR-7有望成为肺癌后续基因治疗的新靶点.     

microRNA干扰抑制MTDH的表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和侵袭能力的影响

目的 探讨microRNA干扰技术沉默异黏蛋白（MTDH,metadherin蛋白）基因表达及对人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞增殖、转移、侵袭能力的影响。方法 将人工合成的针对MTDH基因的miRNA片段瞬时转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231,通过Western blot法、RT-PCR法检测MTDH蛋白表达和MTDHmRNA;应用MTT检测法、划痕实验、Transwell实验检测抑制MTDH基因后对乳腺癌细胞增殖、转移、侵袭能力的影响。结果 MTDHmiRNA能有效抑制MTDH蛋白和MTDHmRNA表达,最佳抑制率分别为79.41%、80.56%（P<0.05）;经miRNA干扰的细胞,生长速度明显受到抑制（P<0.05）,侵袭迁移能力显著下降（P<0.05）。结论 MTDH miRNA瞬时转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞可明显抑制癌细胞中MTDH表达,沉默MTDH基因表达后可明显抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长增殖、侵袭迁移能力。     

ezrin蛋白在青海撒拉族和汉族胃癌中的表达及其生物学功能研究

目的 对ezrin蛋白在青海撒拉族和汉族胃癌中的表达及其生物学功能行相关研究.方法 用免疫组化法检测ezrin蛋白在胃癌组织和正常胃粘膜组织中的表达;MTT法检测胃癌细胞增殖;双荧光素酶及Western blot蛋白印迹法检测酶活性和蛋白表达情况.结果 ezrin蛋白在青海撒拉族和汉族胃癌组织中表达比正常胃黏膜组织高（P＜0.05）,且均与胃癌分化程度、淋巴结转移有关（P＜0.05）,而和年龄、性别无关（P＞0.05）.ezrin蛋白对胃癌细胞增殖具有一定抑制能力,同时可以增加由RhoA（Ac）激活型诱导的荧光酶素.结论 ezrin蛋白表达水平与青海撒拉族和汉族胃癌易感性相关,且参与调节由RhoA诱导的细胞内信号途径,从而调节细胞极化、细胞骨架重组等功能.     

ABCE1基因通过RNaseL途径抑制人大细胞肺癌H460细胞凋亡

摘要：目的研究ABCEl基因表达对人大细胞肺癌H460细胞增殖、凋亡的影响并初步探讨其机制。方法体外培养H460细胞,分为A组（转染ABCE1-siRNA-1组）、B组（转染ABCEl-siRNA-2组）、C组（转染空质粒组）以及D组（空白对照组）。将构建好的ABCEl的siRNA（小干扰RNA）载体转染人培养的细胞中,荧光显微镜下观察转染效率,WesternBlot法检测ABCEl蛋白以及RNaseL蛋白的表达,RT—PCR法检测ABCElmRNA的表达,MTT法分析细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果将构建好的载体成功转入了H460细胞,转染后A、B组的细胞活性降低,ABCEl的表达受到阻断俨〈0．01）,RNaseL蛋白含量明显增加（P〈0．01）,细胞的增殖能力明显降低并逐渐凋亡（P〈0．01）。结论ABCEl基因可促使人大细胞肺癌H460细胞增殖并抑制细胞凋亡,其机制是阻断了2-5A／RNaseL细胞通路。     

SRC激酶抑制剂PP2 通过上调Cx43蛋白表达降低肺癌A549 细胞的侵袭和转移

目的观察SRC激酶抑制剂PP2对肺癌细胞A549侵袭转移能力的影响,并探讨相关机制。方法采用MTT法检测PP2对 A549细胞的增殖抑制作用;利用细胞划痕实验和Transwell 实验分别测定不同浓度PP2处理A549细胞24 h后的侵袭和转移能 力;采用Western blot法检测SiRNA沉默Cx43基因、mRNA过表达Cx43基因和PP2处理后细胞内Cx43、MMP-2的表达。结果 MTT法显示2、4、8、16、32 μmol/L PP2显著抑制A549细胞的增殖,且在该范围内有浓度依赖性。采用1、2、4、8、16 μmol/L PP2分 别作用于A549细胞24 h,细胞的侵袭、转移能力也逐渐降低（P<0.05）。4 μmol/L 和8 μmol/L PP2可以显著增加细胞Cx43蛋白 水平,降低MMP-2蛋白水平。过表达Cx43蛋白后,PP2抑制细胞侵袭转移能力增强;沉默Cx43蛋白后,PP2抑制细胞侵袭转移 能力降低（P<0.05）。结论SRC激酶抑制剂PP2可以降低肺癌细胞A549的侵袭转移能力,该作用与细胞Cx43蛋白的表达有关。     

木犀草素对人肺癌细胞株H460增殖和迁移的影响

目的 探讨木犀草素(luteolin,LUT)对人肺大细胞癌H460细胞增殖和迁移能力的影响,并初步分析其作用机制.方法 不同浓度的LUT处理H460细胞24h或48 h后,用MTT法检测细胞活性;用平板克隆形成实验和划痕实验分别检测其克隆形成能力和迁移能力;用蛋白免疫印迹法检测上皮性钙粘附素(E-cadherin)和...     

从调控TNKS2/APC蛋白探讨培土生金法对非小细胞肺癌转移干预的体外研究

[目的]基于培土生金理论探讨经方黄土汤含药血清通过调控端锚聚合酶2(tankyrase 2,TNKS2)/腺瘤样息肉病(adenomatous polyposis coli,APC)蛋白抑制非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)转移的作用机制.[方法]采用实时荧光定量聚合酶链式...