FcεR Ⅰ受体α亚基的重组表达、单克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的 通过基因重组的方法表达IgE高亲和力受体FeεR Ⅰα亚基,并用重组蛋白制备单克隆抗体.方法 用RT-PCR的方法从过敏性疾病病人外周血嗜碱性粒细胞调取FcεR Ⅰα蛋白基因,经T-A克隆、亚克隆至pET28a( )原核表达载体,将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR(DE3),IPTG诱导表达FeεR Ⅰα亚基蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白;并用其免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗FcεR Ⅰα亚基单克隆抗体,用细胞免疫荧光法对单克隆抗体的特异性进行鉴定.结果 成功调取了人IgE高亲和力受体FcεRⅠα亚基的基因,且测序正确;构建原核表达质粒FcεR Ⅰα-pET28a( );成功建立4株稳定分泌抗FcεR Ⅰα亚基的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为G101、C22、G113、G42.通过细胞免疫荧光实验证实,4株单克隆抗体均能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεR Ⅰα亚基.结论 成功利用基因重组技术制备了FcεR Ⅰα亚基蛋白,制备了4株效价高、特异性好的抗FcεR Ⅰα亚基单克隆抗体,为FeεR Ⅰα亚基及其抗体在过敏性疾病中的生物学功能研究奠定了基础.     

人IgE重链3-4区蛋白的表达、纯化及功能分析

目的通过基因重组的方法表达IgE Cε3-Cε4区,鉴定重组蛋白与天然细胞表面受体FcεRⅠ之间的相互作用,并用重组蛋白免疫小鼠制备血清。方法用RT-PCR方法从过敏性疾病病人外周血淋巴细胞调取IgE Cε3-Cε4cDNA片段,克隆至pET28a(+)构建原核表达载体IgE Cε3-Cε4-pET28a(+),将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达IgE Cε3-Cε4区蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白后,用免疫荧光方法鉴定重组蛋白与天然细胞表面受体FcεRⅠ之间的结合能力,并用UniCAP 100全自动分析检测仪对重组抗原进行定量检测与鉴定;用表达蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗鼠血清,用Western-blot法对多克隆抗体进行鉴定。结果成功调取的人IgE Cε3-Cε4区基因与已报道的序列相一致;获得的IgECε3-Cε4区蛋白相对分子质量(Mr)同预期的结果相一致;IgE Cε3-Cε4能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεRⅠ受体;通过UniCAP 100全自动分析检测仪能够检测到重组抗原并精确到国际单位;免疫鼠血清多抗能特异性结合天然人血清IgE。结论成功构建了IgE C...     

慢性荨麻疹的自身免疫性质及病因探讨

病因不明慢性荨麻疹被称为＂慢性特发性荨麻疹＂,近年研究表明,部分慢性特发性荨麻疹患者血清中存在抗高亲合力的IgE受体α链（FcεRIα）的自身抗体或抗IgE自身抗体,该类荨麻疹的发生以自身免疫为基础,本文就相关研究进展做一综述。     

应用A蛋白分离纯化细胞培养上清中的鼠源性抗肥大细胞FcεRIα的单克隆抗体

目的 分离纯化鼠源性抗肥大细胞FcεRIα(高亲和力的IgE的Fc段受体)的单克隆抗体。方法 先培养ER-E5.3细胞,获得大量的含抗肥大细胞FcεRIα的单克隆抗体的培养上清。然后应用A蛋白-Sphrose CL-4B制备亲和层析柱,分离纯化细胞培养上清中的单克隆抗体。结果分离纯化的单克隆抗体纯度高,活性强。结论应用A蛋白可以很好分离纯化细胞培养上清中的鼠源性抗肥大细胞FcεRIα的单克隆抗体。     

慢性特发性荨麻疹患者血清抗Fcε RI抗体的临床意义

目的了解慢性特发性荨麻疹(CIU)患者血清抗FcεRI抗体水平及其临床意义。方法采用酶联免疫吸附试验法((ELISA)检测50例CIU患者血清抗FcεRI抗体水平,并与20名正常人对照;分析抗FcεRI抗体水平与CIU临床表现的关系。结果CIU患者血清抗FcεRI抗体水平为2.73(0.60～14.45)U/L,正常对照为1.42(0.60～2.30)U/L,两组差异有统计学意义(P0.05);抗FcεRI抗体水平与CIU病程、瘙痒程度、风团数量和风团大小无相关性(P0.05)。结论血清抗FcεRI抗体水平增高可作为CIU的辅助诊断指标,但不能用来评价CIU的病情严重程度。     

膜结合型抗大鼠FcεRIα单克隆抗体制备及活性鉴定

目的:建立抗鼠FcεRI单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),为靶向诱导肥大细胞凋亡创造条件.方法:大鼠嗜碱性粒细胞细胞系RBL-2H3免疫的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,ELISA筛选鼠血清和融合细胞产生的抗体,有限稀释克隆化培养.SDS-PAGE胶电泳、免疫扩散鉴定抗体性质,IgE竞争结合、组胺释放检测抗体生物活性,125I-细胞膜抗体复合物免疫沉淀放射自显影鉴定抗体识别抗原成分.结果:获得2株抗FcεRIα McAb生产细胞株ER-E5.3、ER-C7.4,均为IgG1.培养上清和小鼠腹水获得的抗体效价均大于10-5.流式细胞术分析抗体与RBL-2H3结合率均大于95%,与大鼠胸腺细胞和外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)无交叉反应,并能竞争性抑制IgE与肥大细胞结合.抗体触发RBL-2H3脱颗粒,组胺释放效应与抗原特异性IgE对肥大细胞的激活效应相同.酶切的Fab片段能与RBL-2H3结合,也能竞争抑制IgE与肥大细胞的结合,但不致RBL-2H3脱颗粒.抗体结合的细胞膜成分为α亚单位.结论:大鼠肥大细胞免疫小鼠与骨髓瘤细胞融合得到2株抗体产生杂交瘤克隆ER-E5.3和ER-C7.4,抗体效价和功能活性达到了实验要求,抗原识别成分为膜FcεRIα.     

自身免疫性慢性荨麻疹的现代观点

自身免疫性慢性荨麻疹(AICU)是一种近年来正在逐步被人们所认识的疾病,与遗传因素,尤其是与HLA-Ⅱ类抗原及自身免疫诱发组胺释放的自身抗体关系密切,患者血清中可以存在着IgG-抗FcεRIα自身抗体和(或)抗IgE自身抗体,现就本病的有关问题综述如下.     

慢性荨麻疹自身抗体的表达情况及意义分析

目的:对慢性荨麻疹自身抗体的表达情况及意义分析。方法:收集近期在本院治疗的慢性自身免疫性荨麻疹患者78例作为观察组,同时随机选择同期健康体检者78例作为对照,检测抗FcεRI抗体、抗甲状腺自身抗体(抗甲状腺过氧化物酶自身抗体与抗甲状腺球蛋白抗体)、抗幽门螺杆菌(HP)自身抗体、抗核抗体(ENA)、抗dsDNA抗体等自身抗体表达情况,并进行比较分析。结果:与对照组相比较,慢性荨麻疹患者FcεRI抗体、抗甲状腺抗体、HP抗体、抗dsDNA等自身抗体表达阳性率均明显升高,与对照组比较差异具有统计学意义,抗核抗体阳性率差异则不具有统计学意义。与对照组相比较,慢性荨麻疹患者FcεRI抗体、抗核抗体、抗dsDNA等自身抗体表达水平明显升高,比较差异具有统计学意义(P0.05)。结论:慢性特发性荨麻疹的发病与其自身免疫背景有关,其血清内存在多种自身抗体异常表达,值得临床进一步研究应用。     

人源抗Met基因工程抗体scFv的改造与特性分析

目的:将已制备的抗Met单链抗体基因与人IgG Fc基因片段融合,表达有活性的融合蛋白分子,以增强单链抗体的可溶性.方法:从人淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增并制备人IgG的Fc基因片段,并克隆于已构建好的pBAD-scFv原核表达载体中,转化大肠杆菌Top10,经阿拉伯糖诱导表达融合蛋白scFv-Fc.所表达的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDS-PAGE、Western blot分析鉴定,并用ELISA检测抗体效价.结果:序列分析表明重组质粒pBAD-scFv-Fc基因序列正确;SDS-PAGE分析表明,scFv-Fc融合蛋白分子量为60 ku,且为可溶性蛋白;该蛋白经过His亲和层析纯化、ELISA检测,结果表明,该融合蛋白能够与抗原分子Met特异性结合.结论:改造后的抗体融合蛋白scFv-Fc能与人Met特异性结合,增加了抗体蛋白溶解度,有利于抗体的大量制备.     

蛋白激酶SGK2α在大肠杆菌中的表达纯化及抗体制备

目的 该研究通过SGKα基因的克隆、原核蛋白表达以及纯化,制备抗SGK2α抗体,为进一步研究SGK2α蛋白的生物学功能奠定基础.方法 利用原核表达载体PGEX-4T-3构建重组质粒,并在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白:以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗SGK2α多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价,免疫印迹法检测抗体的特异性.结果 构建了PGEX-4T-3-SGK2α原核表达质粒,经原核表达和亲和层析获得GST-SGK2α融合蛋白,蛋白纯度在90%以上;利用GST-SGK2α融合蛋白制备多克隆抗体,抗体效价阳性且具有较强的特异性.结论 利用原核表达的GST-SGK2α融合蛋白成功地制备了抗SGK2α多克隆抗体,可用于免疫组织化学和免疫印迹检测以及功能研究.     

人FcγRIIb胞外区原核表达载体的构建及表达

目的构建人FcγRIIb胞外区蛋白原核表达载体pET-sFcγRIIb,诱导表达并纯化。方法 PCR扩增获得人sFcγRIIb基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a（＋）,构建原核表达重组质粒pET-sFcγRIIb,经PCR、限制性内切酶鉴定及测序分析后,转化大肠杆菌BL21,采用不同温度和时间的IPTG诱导蛋白表达,确定最佳诱导条件,SDS—PAGE分析正确后,用镍琼脂糖磁珠纯化。结果扩增出了人sFcγRIIb基因,成功构建原核表达重组质粒pET-sFcγRIIb,30℃10h IPTG诱导表达并纯化出41.5kDa的融合蛋白。结论获得重组人FcγRIIb胞外区蛋白,为以后人FcγRIIb胞外区蛋白功能的深入研究奠定基础。     

人重组CD137-Fc分子的构建与真核表达

目的构建人CD137-Fc基因的真核表达质粒，并表达有生物学活性的纯化人CD137-Fc融合蛋白。方法从cDNA文库中用PCR扩增cD137全长编码基因，并导入真核表达载体pcDNA3中。测序证实后，继续用PCR扩增其膜外区cDNA，酶切后与hIgGIFc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中，转染293T细胞瞬时表达，用夹心ELISA检测其表达情况，经蛋白A亲和纯化，用SDS-PAGE与免疫印迹进行鉴定。结果测序证实构建的CD137与CD137-Fc cDNA阅读框完整，连接部位序列正确；ELISA证实cD137-Fc蛋白的表达；SDS-PAGE与免疫印迹证实其为人cD137-Fc蛋白。结论获得了纯化的hCD137-Fc融合蛋白，为探讨CD137在免疫自稳调节中的地位，以及探索CD137的其它生物学功能奠定了坚实的实验基础     

中国人群IgE高亲和力受体β链（FcεRIβ）基因-6843G/A多态性位点与哮喘易感性关系的Meta分析

目的探讨中国人群IgE高亲和力受体β链（FcεRIβ）基因-6843G/A多态性与哮喘易感性的关系。方法检索PubMed、Embase、中国学术期刊网全文数据库（CNKI）、万方数据检索系统及维普数据库,收集研究中国人群FcεRIβ基因-6843G/A多态性与哮喘易感性关系的文献进行Meta分析,末次检索时间为2009年10月1日。病例组和对照组基因型分布的比值比（OR）及95%CI为效应指标,应用RevMan 4.2.8软件对各研究原始数据进行统计学分析并检验异质性,采用STATA10.0软件检验发表偏倚。结果根据纳入排除标准,共有9篇文献研究-6843G/A多态性位点,G携带者（GG＋GA）的哮喘发病风险较AA野生型纯合子（AA）增加49%（OR=1.49,95%CI1.01~2.22）。亚组分析显示,G携带者成年发病的风险明显增高（OR=1.83,95%CI1.32~2.52）,而儿童发病风险无显著性差异（OR=1.19,95%CI0.68~2.08）。结论中国人群FcεRIβ基因-6843G/A多态性与哮喘易感性密切相关,突变子G携带者的哮喘发病风险较高。     

人IκBα基因的克隆和原核表达

目的:构建人类IκBα基因的原核表达载体,表达并纯化蛋白,为研究IκBα基因的功能奠定基础。方法:从cDNA文库获取目的基因,经PCR扩增目的片段IκBα;利用分子克隆技术构建原核表达质粒;转化入大肠杆菌BL21(DE3),优化诱导表达条件,进行纯化,获得目的蛋白。结果:成功构建pET-28a-IκBα重组表达质粒;经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳显示:IκBα在pET-28a-IκBα表达载体中获得表达量较高的融合蛋白,主要以上清形式存在。结论:成功表达并纯化获得了高纯度的IκBα蛋白。     

类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统BPSS1395蛋白表达及其抗体制备与鉴定

目的 重组表达类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统蛋白BPSS1395,利用其抗体检测该蛋白在细菌中的分布.方法 以pET-22b为表达系统,采用DNA重组技术在大肠杆菌中表达BPSS1395蛋白;用纯化重组蛋白免疫新西兰大白兔,Western blot及ELISA法鉴定其免疫学性质;以制备的抗血清Western blot分析该蛋白的亚细胞定位.结果 从类鼻疽杆菌BPC006株基因组DNA中PCR得到了BPSS1395目的基因,并成功构建pET-22b-BPSS1395重组质粒,转化到E.coli宿主菌BL21(DE3)经IPTG诱导表达、纯化得到了相对分子质量为32×103的高纯度BPSS1395蛋白,制备的兔抗血清ELISA效价均高达1:1280000,并能与目的蛋白发生特异性抗原抗体反应.亚细胞分离后BPSS1395在类鼻疽杆菌中主要定位于细胞质.结论 重组表达了具有生物活性的BPSS1395蛋白,制备了其特异性多克隆抗体,证明了该蛋白定位于细胞质.     

免疫复合物对U937细胞和中性粒细胞表面Fc受体表达的调节

目的探讨免疫复合物(ICs)对U937细胞和中性粒细胞表面Fc受体表达的调节.方法将U937细胞或中性粒细胞与各种免疫复合物共同孵育1 h后,用流式细胞仪分析细胞表面各种Fc受体的表达情况.结果 IgG1ICs和IgG3 ICs能上调U937细胞表面FcγRⅡ和FcγRⅢ以及中性粒细胞表面的FcγR I和FcαR I的表达.与各类免疫复合物孵育后中性粒细胞表面FcγRⅡ的表达呈降低趋势.结论免疫复合物能调节中性粒细胞和U937细胞Fc受体的表达,其中以IgG1 ICs和IgG3 ICs最为明显.     

Purification and characterization of biologically active recombinant human Eppin expressed in Escherichia coli

Background Eppin （epididymis protease inhibitor） appears to play an important role in primate fertility. However, the function of Eppin and its antibody in men and its relationship with men＇s infertility are poorly studied. To reveal the significance and possibility of detection of anti-Eppin antibody in clinical infertilty cases, we developed an Escherichia coil expression system for the expression of biologically active human Eppin. Methods The human Eppin gene was cloned into PET-28a（＋） vector after induction with 0.5 mmol/L isopropy-β-Dthiogalactoside （IPTG） at 26℃ for 4 hours, and the expressed fusion protein His6-Eppin was purified by Ni2. affinity chromatography. Afterwards, six female 8-week-old Balb/c mice were immunized with purified His6-Eppin for three weeks. Their sera were collected and polyclonal antibodies against His6-Eppin were purified, all of which were further verified by Western-blot and immunofluorescence analysis. Results About 18.33 mg His6-Eppin was obtained from 1-L flask culture. The produced polyclonal antibodies against His6-Eppin recognized the Eppin protein both in human epididymis and in HEK293T cells by over-expression of the recombinant human Eppin. Conclusion The purified His6-Eppin protein has biological activity, which might be a candidate for clinical diagnosis of infertility and development of male immuno-contraceptive agents.     

OVA-CdTe/ZnSe核壳量子点探针的制备及其应用

目的：制备CdTe/ZnSe核壳量子点标记卵清白蛋白（OVA）探针OVA-CdTe/ZnSe,并检测其特异性荧光示踪作用。方法：将CdTe/ZnSe核壳量子点与OVA偶联制备荧光探针,通过凝胶电泳和光谱分析鉴定偶联效果;然后示踪OVA致敏的小鼠外周血嗜碱粒细胞（BASO）表面IgE高亲和力受体FcεRI。结果：偶联OVA后的量子点分子量增加,荧光增强且荧光峰位从628 nm红移至635 nm。通过激光共聚焦显微镜能清晰观测到OVA-CdTe/ZnSe探针对BASO表面IgE-FcεRI复合物的荧光标记。结论：OVA-CdTe/ZnSe探针能示踪OVA特异性IgE-FcεRI复合物,此探针在OVA致敏动物模型的特异性IgE检测中具有一定应用价值。     

短期使用益赛普与来氟米特治疗强直性脊柱炎疗效观察

目的探讨短期使用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（rhTNFR：Fc益赛普）与来氟米特（LEF）联合治疗强直性脊柱炎（AS）的有效性和安全性。方法对36例患者随机分为实验组21例和对照组15例,实验组给予益赛普皮下注射治疗3个月,每周2次,每次25mg,同时给予LEF每日1次,每次20 mg。对照组给予LEF,剂量及方法同实验组,疗程3个月,随时观察并记录治疗过程中的任何不良事件,在0、2、4、8、12周监测血常规、红细胞沉降率（ESR）、肝肾功能。结果实验组和对照组的ACR20,ACR70,ESR、CRP指标均较入组时有明显改善,但两组间差异无统计学意义（P〉0.05）。治疗12周后实验组停用益赛普时,两组的上述指标均进一步改善,两组间的不良反应率差异无统计学意义。结论短期益赛普与LEF联合治疗AS,可以减少益赛普的疗程,有效的缓解AS的症状,并不增加不良反应,具有较好的安全性。