尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因核酸疫苗免疫效果评价

目的研究尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因核酸疫苗产生的免疫反应及其对小鼠的免疫保护作用,并比较不同免疫途径产生的免疫效果。方法选取BALB/c小鼠40只,随机分为4组(PBS组、空质粒组、pcD-NA3.0-fimH肌肉注射组、pcDNA3.0-fimH滴鼻组),用构建的fimH基因真核表达载体pcDNA3.0重组质粒分别通过肌肉注射和滴鼻(粘膜)免疫BALB/c小鼠,同时分别以载体质粒(pcDNA3.0)和PBS液为空质粒对照和空白对照,经股四头肌注射免疫小鼠,于第3周和第5周加强免疫。每次免疫前及末次免疫后2周采血检测特异IgG抗体。末次免疫后第10 d,以UPEC分离株菌液进行尿道上行攻击,攻击后第5 d进行尿液细菌培养和计数。结果免疫后,肌注组与滴鼻组小鼠血清特异性IgG抗体水平与对照组及空质粒组比较显著升高(P<0.05);UPEC分离株菌液攻击小鼠后,pcDNA3.0-fimH肌注组与滴鼻组小鼠尿液菌落数较对照组及空质粒组显著减少(P<0.05)。结论 pcDNA3.0-fimH基因疫苗可诱导BALB/c小鼠产生特异性体液免疫,对小鼠尿道上行感染具有一定的免疫保护作用,且不同的免疫途径免疫...     

鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株体外生物学特性和对小鼠致病性分析

目的 探索caf1基因缺失对鼠疫耶尔森菌体外生物学特性与对小鼠致病性的影响。方法 利用CRISPR/Cas12a介导的基因编辑技术构建鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株,并通过PCR技术对caf1基因缺失验证。比较鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株和野生株201在生长速率、液体培养状态、聚集情况等体外生物学特性和对小鼠致病性等方面的差异。结果 PCR扩增结果证实,caf1基因缺失株构建成功。体外生物学特征分析表明,与野生株相比,caf1基因缺失株的形态学和生长速率并未发生明显变化,自凝聚率升高。肺递送途径LD₅₀分析表明,caf1的缺失导致鼠疫耶尔森菌气溶胶感染小鼠半数致死剂量显著降低。结论 不同途径感染结果表明,caf1基因缺失株相较于野生株,在肺递送、滴鼻、皮下、尾静脉注射4种途径下对BALB/c小鼠的毒力均降低。caf1基因的缺失导致鼠疫耶尔森菌自凝聚率升高,对BALB/c小鼠致病性下降。     

小鼠肺炎支原体肺炎模型的建立及干扰素-γ的变化

目的　探索小鼠急性肺炎支原体感染的过程及干扰素 γ的变化规律。方法　BALB/c小鼠按体重随机分组 ,在0、1、2d滴鼻感染肺炎支原体菌液 ,在 0～ 2 1d分批宰杀 ,并分批设立滴注培养基的对照组 ,以 0～ 2 6分的组织病理学评分来确定肺部的炎症反应程度 ,所有实验组动物的病原学诊断均作了肺匀浆支原体培养或 /和肺匀浆的支原体PCR鉴定 ,于感染1、3、4、6、8、14天以ELISA方法检测了血清干扰素 -γ的含量。结果　经接种菌液于感染后第一天每 1例小鼠肺部均出现炎症反应 ,组织病理学评分平均为 6 32分 ,于第 3、4天达到最重 ,为 11 6 0和 9 5 8分 ,以后逐渐减轻 ,于第 2 1天炎症基本消失。本实验组中动物的组织病理学评分为 0～ 19分。培养基对照组未出现肺部炎症反应。感染后 1、2、3、4d肺组织培养和PCR检测均有肺炎支原体生长 ,检出率为 10 0 %。在 6、8、14、2 1d大部分未检测出支原体 ;随着肺炎的出现 ,在病程第 3、4天有γ -干扰素的显著降低 ,于第 6天逐渐恢复接近于对照组水平。结论　经 3天滴鼻感染肺炎支原体菌液 ,经组织病理学和肺组织培养和PCR检测证实可使小鼠出现明显的肺炎 ,并有不同程度的干扰素 -γ的降低。小鼠的mp肺炎的动物模型已经建立 ,组织病理学评分方法可以区分肺炎的严重程度 .     

气溶胶感染小鼠急性结核病模型的建立及应用

目的建立气溶胶感染小鼠急性结核病模型,应用该模型评价抗结核新化合物的体内活性。方法应用气溶胶感染装置对BALB/C系小鼠进行不同浓度的H37Rv雾化感染,10d后应用抗结核药及新化合物开始治疗,给予15个剂量,在感染后3d、10d及30d分别进行小鼠解剖、肺活菌计数,统计分析该感染模型及药物的有效性。结果感染106cfu/ml的菌量可以较好的作为模型感染剂量,肺活菌计数和组织病理学结果均表明成功建立气溶胶感染小鼠急性结核病模型。INH治疗后肺活菌计数比较空白对照组可以降低5.95lgcfu,应用该模型筛选到新的抗结核活性化合物JYS-17。结论气溶胶感染小鼠急性模型适合抗结核新药早期活性筛选和评价。     

嗜肺军团菌感染不同时间血清IL-12浓度的变化

目的探讨嗜肺军团菌感染对机体血清IL-12水平的影响,阐述嗜肺军团菌感染对机体免疫功能的作用。方法将BALB/C小鼠随机分为实验组和对照组,实验组又分为实验1周组、2周组、3周组、4周组;每个实验组分别在该周第3天时间点观察,每个实验组15只小鼠;对照组15只小鼠。实验组在腹腔内注射含有嗜肺军团菌菌液0.2ml,菌液浓度为1×10^6/ml,对照组在腹腔内注射无菌生理盐水0.2ml。分别在感染第1周至第4周内的相应时间点,采集小鼠血清,利用酶联免疫吸附法（ELISA）观察血清IL-12水平在第1～4周的动态变化。结果感染嗜肺军团菌后第1周到第3周两组比较,血清IL-12水平明显下降,有统计学意义（P〈0.05）;而第4周两组比较,无统计学意义（P〉0.05）;嗜肺军团菌感染后前两周血清IL-12水平明显下降,并在第2周内达到最低水平;在第3周血清IL-12水平有上升趋势;在感染第4周后血清IL-12水平基本恢复到正常水平。结论研究结果显示,嗜肺军团菌感染对机体免疫功能在不同的时期可能有不同的作用,既在感染早期表现为机体免疫功能下降,而在感染后期对机体免疫功能影响逐渐减少,机体免疫功能逐渐恢复正常。     

铜绿假单胞菌重组Bb-OprH疫苗诱导的保护力及体液免疫应答

目的用重组Bb-OprH疫苗免疫小鼠,观察其对小鼠的保护力及诱导的体液免疫应答情况。方法将重组疫苗经口灌胃接种BALB/c小鼠,1次/d,每周3 d,连续3周。于首次免疫后第4周以5×10~7 CFU的铜绿假单胞菌PAO1株对小鼠滴鼻攻击,1次/d,连续3 d,攻击后2周处死小鼠,计数小鼠肺细胞负荷。于免疫前、首次免疫后4周尾静脉采血,于攻击后2周眼球取血,常规ELISA检测血清IgG及其亚类和IgE。结果疫苗免疫及PAO1株攻击后,小鼠肺细菌负荷减少(F=1 506.793,P0.05);初免后4周,小鼠血清抗体IgG、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE明显升高(0.078±0.005、0.010±0.002、0.038±0.004、0.029±0.002和0.027±0.003,P0.05),较空载体组和Bb对照组差异有显著性(P0.05);攻击后2周,小鼠血清抗体IgG、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE再次升高(0.118±0.010、0.018±0.001、0.068±0.013、0.032±0.003和0.041±0.004,P0.05),较空载体组和Bb对照组差异有显著性(P0.05)。结论铜绿假单胞菌重组Bb-OprH疫苗可诱导铜绿假单胞菌感染小鼠产生保护性体液免疫应答。     

弓形虫STAg联合IFN-γ佐剂滴鼻免疫小鼠诱导不同黏膜部位抗体水平动态观察

目的观察弓形虫可溶性速殖子抗原（soluble tachyzoite antigen,STAg）联合IFN-γ佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠后不同黏膜部位抗体水平及其持续时间,为黏膜疫苗研制提供实验依据。方法 84只5~6周龄BALB/c小鼠随机分为免疫组和对照组,每组42只。免疫组以STAg（20μg/只）为抗原加IFN-γ（1 000 U/只）为佐剂滴鼻免疫,对照组以PBS 20μl滴鼻。共滴鼻2次,间隔2周。首次免疫后第0、2、4、6、8、10、12周每组处死6只小鼠,ELISA法测定鼻咽、肺和小肠冲洗液sIgA、IgG水平。结果小鼠用弓形虫STAg联合IFN-γ首次免疫后鼻咽冲洗液sIgA和IgG水平均增高,其中第2、4、6、8周sIgA水平显著高于对照组（P〈0.05）,第2、4、6周IgG水平高于对照组（P〈0.05）;首次免疫后第6、8周小鼠肺冲洗液sIgA水平显著高于对照组（P〈0.05）,第4、6、8周IgG水平高于对照组（P〈0.05）;首次免疫后第2、4、6周小肠冲洗液sIgA水平高于对照组（P〈0.05）,第2、4、6、8周IgG水平高于对照组（P〈0.05）。免疫后不同黏膜部位抗体均以sIgA为主,且以肠道冲洗液最高。结论 STAg联合IFN-γ佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠可诱导鼻咽、肺和小肠黏膜部位产生高水平sIgA和IgG抗体应答,并可持续6~8周。表明滴鼻免疫是弓形虫疫苗的适宜接种途径。     

纳米链霉素在小鼠结核病模型中治疗作用的研究

目的 对比研究链霉素纳米制剂与普通制剂--硫酸链霉素注射液在小鼠体内经肠胃外给药时的抗结核活性。方法 雌性BALB/c小鼠尾静脉感染结核分枝杆菌H₃₇Rv 1×10⁷CFU。感染后第2 d开始按照空白对照组、阳性对照组、比较对照组和纳米链霉素SM-NP BSA组、纳米链霉素SM-NP CRM组的剂量和频率分别腹腔注射给药,给药至感染后28 d。在感染的14、28、56 d分别处死每组4只小鼠进行脾、肺活菌计数。结果 SM-NP CRM组在整个实验期间的存活率是100%,SM-NP BSA组第28 d和第56 d的存活率分别为83%和75%。治疗14 d时,比较对照组小鼠脾、肺的菌量较阳性对照组大,而SM-BSA与SM-CRM组小鼠脾、肺的活菌数较阳性对照组降低;治疗4周时,各组的活菌数与2周时相比没有明显变化,但SM-NP BSA与SM-NP CRM组的脾、肺活菌数均比比较对照组低,差异有统计学意义。感染8周时,SM-NP BSA、SM-NP CRM组肺的活菌数量仍比阳性对照组小,差异有统计学意义。结论 纳米链霉素制剂SM-NP BSA、SM-NP CRM与普通链霉素注射液相比,在给药剂量与给药频率降低时,在小鼠急性结核病感染模型中表现的抗菌活性仍与阳性对照相当,值得进一步研究。     

经腹腔注射建立免疫抑制BALB/c小鼠系统念珠菌感染模型的研究

目的经腹腔注射建立免疫抑制BALB/c小鼠系统念珠菌感染模型。方法 BALB/c小鼠用环磷酰胺致免疫低下后,腹腔注射不同浓度白色念珠菌SC5314,观察小鼠不同时间血液常规、肾脏真菌载量和组织病理变化。结果白色念珠菌SC5314孢子浓度在2×106～5×107个/ml间的5种0.1ml菌液均造成小鼠系统感染白色念珠菌,病理表现以注射2×107个/ml孢子组小鼠最为典型,在心、肺、肾、脑、横膈、肠系膜等组织内均可见真菌孢子和菌丝。结论经腹腔注射白色念珠菌SC5314可成功建立免疫抑制BALB/c小鼠系统念珠菌感染模型,最适感染剂量为每鼠0.1ml的1×107～2×107个孢子/ml菌液。     

MBL免疫治疗结核病小鼠的实验研究

目的 观察甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin,MBL)对结核分枝杆菌感染小鼠的免疫治疗作用.方法 将BALB/c小鼠18只随机分成MBL免疫治疗组、微卡治疗组和结核菌感染对照组,每组6只.小鼠感染结核分枝杆菌后第14、21、28 d各组腹腔内分别注射MBL、微卡和生理盐水.治疗结束后第3周处死小鼠,观测各组小鼠体质量以及肺、脾脏湿重,观察肺脏病理改变,取肺、脾组织进行结核菌培养和菌落计数.结果 治疗后第3周,治疗组小鼠体质量和脾脏质量高于对照组,肺脏质量低于对照组,且肺部病变较轻.MBL减轻结核病小鼠体质量下降,减少结核病小鼠肺和脾脏结核菌数量.结论 MBL对结核病小鼠具有一定的免疫治疗作用.     

MMP-9、TIMP-1分别对哮喘小鼠和气道重塑小鼠作用的比较研究

目的研究基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9,MMP-9）和基质金属蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitor matrix metalloproteinase-1,TIMP-1）在小鼠哮喘模型和气道重塑模型中表达作用的区别。方法30只BALB／c雌性小鼠按随机数字表法分为哮喘组（n=10）、气道重塑组（n=10）和生理盐水对照组（n=10）。通过鸡卵清白蛋白（ovabumin,OVA）滴鼻和腹腔注射的的方法分别建立小鼠哮喘模型和气道重塑模型。通过病理学观察气道炎症和气道重塑。用免疫组化法测定MMP-9和TIMP-1蛋白的表达;RT-PCR测定MMP-9和TIMP-1的基因水平表达。结果病理学显示哮喘组气道痉挛,大量炎性细胞浸润;气道重塑组呈现气道上皮指状增生,管腔内容物增多,上皮下纤维化。免疫组化结果显示哮喘组MMP-9为8868.8±3544.5,TIMP-1为4783±1508.1,二者比值为1.85;气道重塑组MMP-9为4383.1±2498.6,TIMP-1为6542.3±3026.6,气道重塑组MMP-9／TIMP-1的比值为0.67。二者有统计学意义（P〈0.01）。RT-PCR结果显示气道重塑组MMP-9 mRNA的表达低于哮喘组,而气道重塑组TIMP-1 mRNA的表达高于哮喘组。结论MMP-9主要在哮喘气道炎症中表达增高,而TIMP-1则在气道重塑过程中表达升高,二者的比例失调可能是哮喘的发病机制之一。     

日本血吸虫感染小鼠IL17IL23动态变化研究

目的观察日本血吸虫感染小鼠IL 17A、IL 23p19的表达,探讨IL 17、IL 23在免疫调控中的作用。方法建立日本血吸虫感染的小鼠模型,采用ELISA和RT PCR法检测小鼠感染后1、2、4、6、8及10周脾细胞培养液上清中IL 17A、IL 23p19蛋白水平和mRNA水平的表达。结果蛋白及mRNA表达结果显示,感染小鼠IL 17A与IL 23p19的变化趋势基本一致。感染小鼠IL 17A蛋白表达水平于感染后1周迅速升高,之后持续下降,8周时表达水平低于正常对照组;其mRNA表达也于感染后1周升高,第2周开始下降。而IL 23p19蛋白的表达水平于感染后1周升高,第2周到达高峰,第4周开始下降;其mRNA水平起先一直在正常范围波动,感染后4周开始升高,第6周达到峰值,之后逐渐下降。结论 IL 17和IL 23在日本血吸虫感染小鼠体内协同表达,并于感染早期呈现显著上升趋势,提示IL 17、IL 23参与了血吸虫感染极早期的免疫病理过程。     

BALB/c小鼠感染日本血吸虫后血清中SEA特异性抗体的动态观察

目的 观察BALB/c小鼠感染日本血吸虫后18周内血清中可溶性虫卵抗原 （SEA） 特异性IgG、 IgM抗体水平的动态变化。方法 尾蚴感染BALB/c小鼠, 感染2周后开始每周采血并分离血清, 以SEA为抗原, 通过ELISA测定不同感染时间血清IgG、 IgM值; 通过免疫印迹法检测不同感染时间小鼠血清中SEA特异性IgG、 IgM抗体条带。结果 ELISA检测结果表明感染小鼠血清IgG水平在感染5、 6、 9、 11周上升明显; IgM在感染5周和9周时上升明显。免疫印迹试验结果表明感染血吸虫4周后, 小鼠血清中开始出现140、 180、 210 kDa蛋白特异性IgG抗体; 感染5周后出现43、 50 kDa强反应IgG特异性抗体带; 感染6周后在60～130 kDa处出现 IgG特异性弥散带; 感染9周后出现38、 73 kDa 蛋白特异性IgG条带, 其中38 kDa 条带较弱, 随感染时间延长, 条带反应逐渐增强, 直至感染18周; 感染11周后新增26、 32、 35、 80 kDa特异性IgG条带, 并且在12周后增强。感染3周后出现100、 140、 180 kDa IgM特异性反应条带, 感染9周后出现73 kDa特异性IgM强反应条带及 38、 43、 50 kDa弱反应IgM抗体带, 后3条蛋白条带随感染时间延长逐渐变强。 结论 SEA中不同组分抗原对感染宿主的免疫调节具有时间特异性, 其中43、 50、 100、 140、 180 kDa具有早期诊断价值; 73 kDa 既可用于急性血吸虫病诊断, 也可用于慢性血吸虫病诊断; 28、 32、 35、 38、 80 kDa抗原既可作为慢性血吸虫感染的优势抗原, 同时也可能具有一定的抗血吸虫感染作用, 可作为疫苗开发的候选抗原。     

Antigenic cross-reactivity between the human whipworm, Trichuris trichiura, and the mouse trichuroids Trichuris muris and Trichinella spiralis

Cross-reactivity was demonstrated between circulating antibodies from Trichuris trichiura-infected humans and T. muris-infected mice for heterologous antigen preparations. Mouse immune sera raised against excretory/secretory (E/S) products and anterior end homogenate from adult T. muris showed marked affinity for T. trichiura adult homogenate in ELISA, and 35S-methionine-labelled adult T. muris E/S products were precipitated by T. trichiura infection sera. Monoclonal antibodies recognizing a 48 kD Trichinella spiralis muscle larval beta-stichocyte granule antigen also showed avidity for T. trichiura adult homogenate in ELISA, as did serum from mice with patent T. muris worm burdens. This cross-reactivity is thought to result from shared stichocyte antigens and the relevance of this observation is discussed.     

Efficacy of membrane TNF mediated host resistance is dependent on mycobacterial virulence

TNF is required for protection against virulent and non-virulent mycobacterial infections. Here we compared the effect of Tm-TNF and sTNF, two different molecular forms of TNF, in virulent and non-virulent murine challenge models. Using non-virulent Mycobacterium bovis BCG intranasal infection we established that immunity is durably compromised in Tm-TNF mice, with augmented bacilli burden, leading to chronic but non-lethal infection. Acute infection by a virulent Mycobacterium tuberculosis low-dose aerosol challenge was controlled in Tm-TNF mice with bacilli burdens equivalent to that in WT mice and pulmonary pathology characterised by the formation of well-defined, bactericidal granulomas. Protective immunity was however compromised in Tm-TNF mice during the chronic phase of M. tuberculosis infection, with increased lung bacterial growth and inflammatory cell activation, dissolution of granulomas associated with dispersed iNOS expression, increased pulmonary IFNgamma and IL-10 expression but decreased IL-12 production, followed by death. In conclusion, membrane TNF is sufficient to control non-virulent, M. bovis BCG infection, and acute but not chronic infection with virulent M. tuberculosis.     

Influence of oral lactoferrin on Mycobacterium tuberculosis induced immunopathology

The ability of lactoferrin to provide protection and decrease immunopathology in infectious diseases was evaluated using an aggressive aerosol model of Mycobacterium tuberculosis (MTB) infection. C57BL/6 mice were challenged with MTB strain Erdman and treated with 0.5% bovine lactoferrin added to the drinking water starting at day 0 or day 7 post-infection. Mice were sacrificed at three weeks post-challenge and evaluated for organ bacterial burden, lung histopathology, and ELISpot analysis of the lung and spleen for immune cell phenotypes. Mice given tap water alone had lung log10 colony forming units (CFUs) of 7.5 ± 0.3 at week 3 post-infection. Lung CFUs were significantly decreased in mice given lactoferrin starting the day of infection (6.4 ± 0.7), as well as in mice started therapeutically on lactoferrin at day 7 after established infection (6.5 ± 0.4). Quantitative immunohistochemistry using multispectral imaging demonstrated that lung inflammation was significantly reduced in both groups of lactoferrin treated mice, with decreased foamy macrophages, increased total lymphocytes, and increased numbers of CD4+ and CD8+ cells. ELISpot analysis showed that lactoferrin treated mice had increased numbers of CD4 + IFN-γ+ and IL-17 producing cells in the lung, cells that have protective functions during MTB infection. Lactoferrin alone did not alter the proliferation of MTB in either broth or macrophage culture, but enhanced IFN-γ mediated MTB killing by macrophages in a nitric oxide dependent manner. These studies indicate that lactoferrin may be a novel therapeutic for the treatment of tuberculosis, and may be useful in infectious diseases to reduced immune-mediated tissue damage.     

汉滩病毒核酸疫苗滴鼻免疫小鼠效果的实验

目的　观察汉滩病毒DNA疫苗滴鼻免疫诱导机体产生的免疫应答 ,探索汉滩病毒DNA疫苗新的免疫途径。方法　用重组质粒PcDNA3 1B -S1 3 经滴鼻接种BALB/c小鼠 ,采用ELISA、淋巴细胞转化试验及流式细胞仪等方法检测了其诱导的系统和粘膜免疫反应。结果　免疫小鼠血清IgG及粪便IgA明显增高 (P <0 0 1) ,且IgA增幅较大 ;实验组淋巴细胞增殖反应明显 ,刺激指数 (SI)显著增大 (P <0 0 5 ) ;免疫后CD+ 4 、CD+ 8T细胞均增加 (P <0 0 1) ,而CD+ 4 /CD+ 8T细胞比值无显著变化 (P >0 0 5 )。结论　汉滩病毒重组质粒滴鼻免疫能诱导机体产生了特异的系统免疫和较强的粘膜免疫 ,滴鼻的疫苗免疫途径有着潜在的应用价值。     

Leflunomide prevents alveolar fluid clearance inhibition by respiratory syncytial virus

RATIONALE: Previously, we demonstrated that intranasal infection of BALB/c mice with respiratory syncytial virus (RSV) resulted in an early 40% reduction in alveolar fluid clearance (AFC), an effect mediated via P2Y purinergic receptors. OBJECTIVES: To confirm that RSV-induced inhibition of AFC is mediated by uridine triphosphate (UTP), and to demonstrate that inhibition of de novo pyrimidine synthesis with leflunomide prevents increased UTP release after RSV infection, and thereby also prevents inhibition of AFC by RSV. METHODS: BALB/c mice were infected intranasally with RSV strain A2. AFC was measured in anesthetized, ventilated mice by instillation of 5% bovine serum albumin into the dependent lung. Some mice were pretreated with leflunomide or 6-mercaptopurine. MEASUREMENTS AND MAIN RESULTS: RSV-mediated inhibition of AFC is associated temporally with a 20-nM increase in UTP and ATP content of bronchoalveolar lavage fluid, hypoxemia, and altered nasal potential difference. RSV-mediated nucleotide release, AFC inhibition, and physiologic sequelae thereof can be prevented by pretreatment of mice with the de novo pyrimidine synthesis inhibitor leflunomide, which is not toxic to the mice, and which does not affect RSV replication in the lungs. In contrast, pretreatment of mice with 6-mercaptopurine, an inhibitor of de novo purine synthesis, has no beneficial effect on AFC or other indicators of disease progression. Finally, RSV-mediated inhibition of AFC is prevented by volume-regulated anion channel inhibitors. CONCLUSION: Pyrimidine synthesis or release pathways may provide novel therapeutic targets to counter the pathophysiologic sequelae of impaired AFC in RSV disease.