细胞穿透肽PEP-1在蛋白转导中的应用

文章对细胞穿透肽PEP-1在大分子物质体内外跨膜转导中的应用进行了综述，为进一步研究PEP-1介导有潜在治疗价值的大分子物质跨膜转导进行疾病的蛋白治疗提供了依据。     

HIV TAT——一种生物大分子的运载体

人工合成编码TAT蛋白转导区核心区域11个氨基酸的双链寡核苷酸，构建pET28a-TAT-LacZ表达子，转化大肠杆菌，得到高表达的TAT－β-Gal融合蛋白。TAT－β-Gal加入体外培养的平滑肌细胞中，15min细胞即出现监染，1h TAT-β-Gal 100%进入细胞。该融合蛋白ip到Wistar大鼠体内，30min各组织出现蓝染，4h光密度值达高峰。实验证明TAT蛋白可有效携带大分子物质穿过生物膜，是一良好的生物大分子运载体。     

新型囊性纤维化治疗药Ivacaftor在美国获准上市

美国FDA近期已批准Vertex制药公司开发的首个针对囊性纤维化（CF）病因——cF跨膜转导调节蛋白（CFTR）基因突变的新型口服CF治疗药ivacaftor（Kalydeco）用于CFTR基因发生G55lD突变的6岁或以上年龄的CF患者。CF为一种致死性遗传疾病，可引发慢性肺部感染及进行性肺损伤，并累及其他器官，最终可导致患者过早死亡。     

反式激活蛋白-氧依赖性降解结构融合结构域介导蛋白跨膜转运和氧依赖性降解作用

目的研究反式激活蛋白(TAT)蛋白转导结构域介导的融合蛋白的跨膜转运,以及氧依赖性降解(ODD)结构域介导融合蛋白在体内外不同氧分压环境中的降解作用。方法将TAT,ODD以及增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列进行融合,构建了TAT-ODD-EGFP融合蛋白基因。将该序列克隆到原核表达载体pET28a中,在BL21工程菌中进行表达,通过亲和柱层析法纯化,得到高纯度的融合蛋白。同方法制备EGFP和TAT-EGFP融合蛋白作为对照。在20%O2和1%O2将融合蛋白与A549,H1299和MDA-MB-231细胞系孵育,荧光显微镜下观察融合蛋白在细胞中的分布以及稳定性。小鼠尾静脉注射不同融合蛋白(10 mg.kg-1),分别在注射后1,6和12 h处死动物,取脏器在荧光显微镜下观察融合蛋白的分布及稳定性。结果由于EGFP相对分子质量大,无法穿透细胞及组织。TAT可以有效地介导TAT-EGFP进入细胞和动物实体组织,其稳定性不受细胞或组织中氧分压的影响,而TAT-ODD-EGFP进入细胞或组织后,在20%O2条件下迅速降解,但可稳定存在于1%O2细胞及组织中。结论 TAT可以有效地转导融合蛋白穿过细胞膜。引入ODD,20%O2下融合蛋白TAT-ODD-EGFP迅速降解,但可以稳定存在于1%O2细胞和组织中,说明TAT-ODD可以转导蛋白进入并靶向存在于低氧的肿瘤组织中。     

水通道蛋白8与胎膜水平衡调控相关性研究进展

水通道蛋白（AQP）是一类对水具有高度选择性的跨膜糖蛋白，可介导自由水快速被动跨生物膜转运，是水分子跨膜转运的主要分子基础，对保持细胞内外环境的稳态起重要作用，同时参与机体一些重要的生理功能。自1988年Agre分离出第一个AQP以来，目前已确定了13种AQP家族成员，即AQP0、AQP1～12，称为AQP家族（AQPS）。迄今为止，AQP的基因结构和表达调控、染色体定位、蛋白结构、组织分布和生理功能均得到了一定的研究。近年来有关胎膜与AQPS的研究只涉及AQP1、3、4、8、9。水通道蛋白8作为一种重要的调控哺乳动物胎膜两侧水平衡的跨膜通道蛋白目前广受关注。     

Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶4对胃癌侵袭转移的作用

<正>细胞表面蛋白水解酶为丝氨酸蛋白水解酶家族,能够通过激活蛋白发挥重要的调节作用。近年来发现的多个跨膜丝氨酸蛋白酶,广泛表达于细胞膜上并参与多种细胞活动,包括细胞表面蛋白水解、胞外基质降解、与细胞骨架相互作用、细胞信号转导和侵袭转移[1]。该蛋白酶被命名为Ⅱ型跨膜     

GST-TAT-P53c融合蛋白的表达及对p53基因突变型肿瘤细胞的促凋亡作用

目的研究P53蛋白C端(P53c)对p53基因突变型肿瘤细胞SW480的促凋亡作用。方法用人类免疫缺陷病毒TAT蛋白的蛋白转导域(TAT)将P53c运载进入肿瘤细胞,用氧依赖性降解区域(ODD)控制P53c在组织中的稳定性。通过PCR方法制备TAT-ODD-p53c(TOPc),TAT-p53c(TPc)及p53c基因,与pGEX4T载体连接后在大肠杆菌中表达谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-TAT-ODD-P53c(GST-TOPc),GST-TAT-P53c(GST-TPc)及GST-P53c等融合蛋白。免疫组化方法检测TAT蛋白运载融合蛋白穿过SW480细胞膜的作用,MTT法检测融合蛋白对SW480细胞活力的影响,流式细胞仪检测致SW480细胞凋亡作用。结果成功构建pGEX系列表达载体,并在大肠杆菌中可溶性表达。Western印迹结果表明,重组蛋白可以和GST单克隆抗体特异性结合。免疫组化显示GST-TPc,GST-TOPcm及GST-TOPc均能进入SW480细胞,GST-TPc能明显降低SW480细胞活性,导致SW480细胞凋亡。含ODD的融合蛋白在常氧环境中对肿瘤细胞有轻度促凋亡作用。结论TAT可以介导其融合蛋白跨越细胞膜。GST-TPc可引起p53突变型肿瘤细胞凋亡。     

HIV-1Gag蛋白与胞膜结合的结构基础

逆转录病毒基因组编码的Gag蛋白含有病毒组装所需的多种病毒原件，在核糖体合成后，Gag蛋白直接到达胞膜或内含体膜的结合位点进行组装并发育成非成熟的病毒体，然后被病毒蛋白水解酶裂解成基质（MA）、农壳（CA）和核衣壳蛋白，从而组装成成熟的可感染的病毒颗粒。对于大多数逆转录病毒，病毒与细胞膜的结合依赖于转录后GagN端MA结构域的乙酰化，HW1型（HIV-1）和2型的MA是含有132个氨基酸的多肽残基，N端含有十四烷基，可以与保守片断相互作用，从而进行膜的选择和结合。     

hCu,Zn-SOD-TAT PTD的融合表达及其跨膜转运性质的初步研究

HIV I反式激活蛋白TAT中的一段富含碱性氨基酸的短序列具有独特的跨膜转运能力 ,被称为TAT蛋白转导结构域 (proteintransductiondomain ,PTD)。从人肺cDNA文库中PCR扩增hCu ,Zn SOD基因 ,插入pUC19测序 ;以测序质粒为模板 ,再用含TATPTD编码序列的 3’引物PCR扩增得hCu ,Zn SOD TATPTD融合基因 ,并插入 pUC19。将SOD基因和SOD TATPTD融合基因分别亚克隆至温控表达载体 pJW 2 ,转化大肠杆菌DH5α。SDS PAGE和Westernblot结果表明 ,热击诱导 4h后 ,分别在 19ku和 2 2ku处出现SOD和SOD TATPTD目标表达条带 ,表达蛋白以包含体形式存在。分别提取SOD和SOD TATPTD包含体 ,复性纯化后SOD和SOD PTD重组蛋白均具有特异的SOD酶活性 ,其比活性分别为 12× 10 3 NU/mg和 9.9× 10 3 NU/mg。细胞试验结果表明 ,与SOD相比较 ,SOD TATPTD融合蛋白能显著提高细胞内SOD酶活力。     

以绿色荧光蛋白为标志研究对肿瘤细胞的基因转移

目的 建立以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）示踪肿瘤细胞的方法。方法 用编码EGFP的逆转录病毒分别转导人白血病细胞K562、乳腺癌细胞MCF7和膀胱癌细胞5637,G418选择获得EGFP标记的肿瘤细胞。EGFP基因的整合与表达分别用聚合酶链反应（PCR）、流式细胞术（FCM）及荧光显微镜分析。结果 EGFP病毒转导的3种肿瘤细胞内均有EGFP基因和NeoR基因的整合;与对照细胞相比,EGFP病毒转导可使EGFP阳性细胞的比例提高到85.5%-90.0%。结果 携带EGFP基因的逆转录病毒载体能在肿瘤细胞稳定表达,可用于研究肿瘤的生长、转移和血管生成。     

整合素靶向性病毒载体对肿瘤细胞基因转导的促进作用

在进行基因导入研究及临床试验中，目前采用的载体通常包括了病毒及非病毒两大类。对于非病毒载体用于基因转染有许多报道。而腺病毒作为基因载体，因其具有的高效转导能力及对分裂或非分裂细胞均能转导等优点而被广泛应用于针对疾病的基因治疗中。对腺病毒进入细胞机制进行的深入研究结果发现，腺病毒与细胞结合的第一步是与细胞表面的柯萨奇腺病毒受体（coxsackie adenovirus receptor，CAR）结合，第二步是利用其在五角体基（pentonbase）中的RGD序列和细胞表面的整合素结合，     

Toll样受体4的研究及现状

Toll样受体4（Toll-like receptor4，TLR4）是天然免疫系统识别病原微生物的主要受体，在天然免疫反应中具有重要的作用。TLR4细菌脂多糖（1ipopolysaeeharide，LPS）是介导信号跨膜转导的主要受体，对于革兰氏阴性菌的感染性炎症至关重要。近年来，有关TLR4介导的信号转导及其TLR4与疾病的关系受到人们的关注。本文就TLR4的信号转导、TLR4与LPS的关系进行了综述，并介绍了TLR4与相关疾病之间的关系，对TLR4的研究意义进行了肯定。     

艾滋病病原学诊断研究的进展

艾滋病（AIDS）的确诊，病原学诊断是重要依据，现将其进展情况介绍如下。一、艾滋病病原体：AIDS的病原体为人类免疫缺陷病毒（HIV），属于逆转录病毒科，慢病毒亚科，免疫缺陷病毒属。其基因组由2个相同分子的正极单股RNA组成。3个主要结构基因为：（）核心基因，编码内壳蛋白P24，内膜蛋白P15／17；（2）酶基因，编码逆转录酶Psl及整合酶P31；（3）包膜基因，编码外膜蛋白PP120及跨膜蛋白gg41。最近在核心基因及酶基因基因间发现pro基因，编码蛋白P22。6个调控基因编码调控蛋白，可调控HIV复制。HIV有3个型，即HIV－1及HIV…     

HIV融合抑制剂的研究进展

人免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）进入靶细胞的过程是由病毒表面的包膜糖蛋白（Env）跨膜亚基gp41介导的。gp41中含有2个α-螺旋疏水重复序列，即N末端重复序列（HR1）和C末端重复序列（HR2）。在融合过程中，它们能寡聚化形成gp4l介导膜融合的功能性结构（6股α-螺旋束核心结构），该结构的形成使得病毒膜与细胞膜接近，继而发生融合。任何可有效阻止6股α-螺旋束核心结构形成的化合物，均有可能产生抗HIV融合活性。多肽类HIV融合抑制剂中C肽和N肽分别衍生于HR2和HR1，具有很好的抗HIV融合活性，C肽类中的新药enfuvirtide（T-20）已于2003年被美国FDA批准上市。现综述近几年HIV融合抑制剂的研究现状及发展方向。     

Ivacaftor

Ivacaftor是由美国Vertex公司研发的用于治疗罕见型囊性纤维化的药物,于2012年1月31日经美国食品与药品管理局（FDA）批准上市,商品名为Kalydeco。该药用于治疗一种囊性纤维化跨膜转导调节因子（CFTR）基因G551D突变引起的罕见型囊性纤维化（CF）,适合年龄在6岁及以上患者使用。     

破伤风抗毒素过敏实验致严重变态反应1例临床护理

破伤风抗毒素（TAT）是马的免疫血清,对人体是一种异种蛋白,具有抗原性,注射后容易出现变态反应。TAT过敏实验法^[1]：①实验液的配制。取每毫升含TAT1500ml的药液0．1m1．加0．9％氯化钠溶液至1ml（每毫升含TAT 150IU）即得。②实验方法。皮内注射TAT实验液0．1ml（含TAT15IU）,20min后观察结果。阴性：局部皮丘无变化,全身无反应。阳性：局部皮丘红肿硬结,直径大于1．5cm,红晕超过4cm,有时出现伪足．痒感。全身反应同青霉素变态反应。     

马尔堡出血热感染非人灵长类动物后用重组水泡性口炎病毒载体疫苗治疗的保护效力评估

马尔堡病毒（MARV）是引起致死性出血性疾病的一种丝状病毒，目前尚无人用治疗药物或疫苗。先前的研究表明，一种表达MARV跨膜糖蛋白的减毒重组水泡性口炎病毒（rVSV）活疫苗（VSVΔG／MARVGP）可保护非人灵长类动物防御致死性MARV攻击。美国陆军传染病医学研究所Dadd—ario—DiCaprio等用这种疫苗对MARV接触后的治疗效果进行研究。     

烟碱对脑M胆碱能受体信息跨膜转导的调节

采用体外实验研究烟碱对大鼠脑Ｍ受体信息跨膜转导的调节作用．脑突触体以烟碱１．０μｍｏｌ·Ｌ－１预处理后，［３Ｈ］ｌ－二苯羟乙酸奎宁酯与Ｍ受体结合及解离动力学过程减慢．在溶脱的大脑皮层Ｍ受体与Ｇ蛋白复合体上，烟碱１．０μｍｏｌ·Ｌ－１可减慢［３５Ｓ］－腺苷５＇－［γ－硫］三磷酸与Ｇ蛋白的结合，并增强Ｍ受体与Ｇ蛋白之间的偶联关系．烟碱０．１～１０００μｍｏｌ·Ｌ－１既不影响纹状体腺苷酸环化酶的基础活性，也不影响氟化钠激活腺苷酸环化酶的作用．烟碱０．１～３０μｍｏｌ·Ｌ－１浓度依赖性地提高脑细胞内Ｃａ２＋浓度．据此提出烟碱对脑Ｍ受体信息跨膜转导系统有多点调节作用．     

调节类风湿关节炎滑膜细胞基质金属蛋白酶表达的信号转导和相应的药物作用靶点

影响类风湿关节炎 (rheumatoidarthritis,RA)滑膜细胞基质金属蛋白酶表达的胞外信号包括T淋巴细胞、细胞因子、生长因子、干扰素和神经肽等,它们引起的信号在胞内主要依赖G蛋白偶联跨膜受体介导的途径和丝裂原激活的蛋白激酶途径转导。作用于这些信号或其转导过程的药物正成为治疗RA、预防RA关节破坏的新策略之一。     

针对G蛋白偶联受体的药物筛选新方法

G蛋白偶联受体（GPCR）为具有7个跨膜螺旋的蛋白质受体，是人体内最大的蛋白质家族，其为极重要的药物靶点。本文针对GPCR的固有激活和变构效应的药物筛选模型开发新进展和高内涵药物筛选新技术进行综述。