磁珠法DNA提取技术在多重连接依赖探针扩增检测中的应用

目的探讨磁珠法DNA提取技术在多重连接依赖探针扩增(MLPA)检测样品制备中的应用价值。方法分别用半自动磁珠法和手工离心柱法提取1例21-羟化酶缺乏症患者和16例健康男性外周血、16例羊水细胞标本的基因组DNA,用MLPA法检测CYP21A2基因拷贝数,比较两种方法制备DNA的质量及MLPA结果。用磁珠法提取200例羊水细胞DNA,MLPA法检测染色体非整倍体异常表达情况。结果磁珠法提取外周血DNA的浓度和总量均高于离心柱法(P0.05)。两种方法提取羊水DNA浓度相当,磁珠法所得总量较高(P0.05)。21-羟化酶缺乏症患者CYP21A2基因拷贝数比值接近0.5。200例羊水标本中检出正常二倍体188例,21三体9例,18三体2例,特纳(Turner)综合征(45,X)1例,与核型分析结果一致。结论磁珠法制备的外周血和羊水细胞DNA适用于MLPA检测,具有较高的应用价值。     

多重连接依赖式探针扩增技术在遗传病分子诊断中的应用

多重连接依赖式探针扩增技术（multiplex ligation—dependent probe amplification,MLPA）是近年发展起来的基因检测新技术,可通过简单的杂交（hybridization）、连接（1igation）及PCR（polymerase chain reaction）扩增反应于同一管内同时检测出多达40种基因组DNA或RNA拷贝数变化。凭借其操作简单、高通量、稳定可靠等特点,该技术在遗传病的分子诊断等领域的应用已得到迅速的推广,本文就MLPA技术的原理、特点以及在遗传病分子诊断中的实际应用等作一综述。     

用多重连接依赖探针扩增技术进行Y染色体微缺失的产前诊断

目的探讨多重连接依赖探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术在Y染色体微缺失产前诊断中的应用价值。方法收集4例染色体为46,XYqh-和1例染色体46,X,+mar的羊水样本,用MLPA P095染色体非整倍体检测试剂盒和Y染色体微缺失检测试剂盒分别对5例羊水样本进行检测。结果 4例Yqh-染色体的羊水样本的Y染色体信号值均在正常范围内,即Y染色体不存在微缺失,1例小Mar染色体为Y染色体;进一步用Y染色体探针检测结果示,Y染色体上AZFb和c区存在大片段缺失。结论用MLPA技术对疑似Y染色体微缺失的病例进行检测,可判断是否存在Y染色体生精功能区域的缺失,为产前诊断提供分子遗传学依据。     

多重连接探针扩增技术的研究进展及其应用

多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependentprobe amplification,MLPA)是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技术。该技术仅需20ng/μlDNA,即可通过简单的杂合、连接、PCR扩增及电泳步骤,在同一反应管中对四十多个不同的靶基因进行检测和定量分析。这一技术最先于2002年由荷兰的Schouten等[1]报道。如今短短几年中,该技术已被欧洲、亚洲等几十个实验室采用。迄今为止,已有150多篇不同领域采用该技术方法的报道在重要刊物上发表。     

多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术在广州地区RhD阴性献血者基因分型研究中的应用

目的 采用新型Rh血型系统的MLPA检测试剂盒,对广州地区收集的200名RhD阴性献血者进行基因分型.方法 采用传统的血型血清学方法,对RhD阴性献血者进行RhD表型鉴定.提取基因组DNA,采用MLPA检测试剂盒对收集的200名RhD阴性献血者进行RHD基因分型.对于不能明确分型的标本,进行RHD基因直接测序分析.结果 在200名RhD阴性献血者中,采用MLPA方法对196名进行了明确的基因分型.其中,127名为RHD基因缺失(占63.5％);仅检测到包含RHD1227A突变的DEL等位基因有41例,其中38例包含杂合等位基因,其余3例包含纯合等位基因;仅检测到RHD (1-2)-CE (3-9)-D (10)等位基因的有23例,其中19例杂合,4例纯合;3例包含2种不同的RHD等位基因(1条为RHD (1-2)-CE (3-9)-D (10),另1条为RHD1227A);其余2例分别包含杂合的DFR-2(RHD-CE(4) -D)及弱D15型(RHD845A)等位基因.在其余4例直接测序分析的标本中,2例包含杂合的RHD711 delC突变;1例1条等位基因为MLPA检测到的包含RHD1227A突变的DEL等位基因,另1条为包含711delC突变的RHD等位基因;其余1例的1条等位基因为MLPA检测到的RHD (1-2)-CE (3-9)-D (10),另1条为包含新突变的RHD等位基因(1154G ＞T,385Gly＞ Val).结论 MLPA检测试剂盒是适用于中国人群的1种快速、有效的高通量基因分型方法,能够对中国人群常见的各种RHD基因型进行明确分型,适用于参比实验室相关疑难标本的基因分型检测.也可应用于中国人群常见的Del表型检测,使Del表型患者不必再输注RhD阴性血液,节约稀有的RhD阴性血液资源.     

多重探针连接依赖式扩增技术在常见非整倍体染色体异常快速产前诊断中的应用研究——附407例检测报告

目的:评估现有多重探针连接依赖式扩增技术(MLPA)方案作为常见非整倍体染色体异常的快速产前诊断方法的有效性.方法:对407例羊水样本进行MLPA试验及羊水细胞染色体G显带核型分析,所有样本进行MLPA获得的扩增产物信息经GenemarkerV l.80软件进行定量分析,观察样本DNA拷贝数的变化,并将所得结果与染色体核型分析结果进行比较,计算其检测的敏感度、特异度及阳性预测值.结果:407例样本中,应用MLPA技术发现正常样本397例及染色体非整倍体异常样本9例.异常结果包括21三体6例、18三体l例、X三体1例及X-单体1例,与羊水细胞培养染色体G显带核型分析结果一致.MLPA检测出的1例X单体疑似样本,经核型分析结果验证为正常核型.MLPA检测非整倍体性染色体异常的敏感度为100％,特异度为99.75％,阳性预测值为90％.结论:MLPA分析技术作为一项快速产前诊断技术,具有良好的特异性和应用价值.     

多重连接探针扩增技术检测常见线粒体疾病

  目的  探讨多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)用于常见线粒体疾病基因检测的可行性。  方法  收集2010年5月至2012年8月北京协和医院281例可疑线粒体异常病例, 包括神经科存在神经系统损伤的患者233例及眼科疑诊Leber遗传性视神经病变的患者48例, 运用MLPA法对常见线粒体疾病突变位点进行检测, 并使用线粒体基因序列测定方法进行验证。  结果  281例标本中共38例检测到线粒体基因突变, 总检出率为13.5%。眼科48例标本中, 3460G > A、11778G > A和14484T > C 3种突变共检测到19例, 检出率为39.6%;神经科233例标本中, 3243A > G、8344A > G、8993T > G和大片段缺失共检测到19例, 检出率为8.2%。除1例大片段缺失暂无PCR测序验证外, 其余MLPA结果均经序列测定验证为相符。  结论  MLPA法是一种可行的快速、准确、简便的基因诊断方法, 可作为筛查常见线粒体疾病的检测工具, 为临床诊断和治疗提供依据。     

多重连接探针扩增技术在胚胎停止发育染色体非整倍体异常分析中的应用

目的：探讨多重连接探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）技术在分析胚胎停止发育（以下简称胚胎停育）流产绒毛组织染色体非整倍体异常中的应用,探讨染色体非整倍体异常导致胚胎停育与胎儿性别、患者年龄间的关系。方法：收集324例临床诊断为胚胎停育患者的流产绒毛组织,采用MLPA技术进行染色体检测,并分析检测结果与胎儿性别及患者年龄间的相关性。结果：在324例胚胎停育患者中,检出绒毛染色体非整倍体异常共68例（20.99%）,其中常染色体三体33例（13-三体12例、18-三体6例、21-三体15例）,常染色体缺失3例（13-单体1例、21-单体2例）,性染色体数目异常32例（45-XO 15例、47-XXY 13例、47-XXX 1例、47-XYY 3例）。常染色体数目异常组与染色体数目正常组间的胎儿性别分布差异无统计学意义（P>0.05）。对绒毛染色体数目正常组[平均年龄（32±6）岁]、常染色体数目异常组[平均年龄（34±7）岁]、性染色体数目异常组[平均年龄（28±6）岁] 3组患者的年龄进行比较,发现差异有统计学意义（P<0.05）。结论：MLPA技术可以作为一种辅助检测手段,用于检测胚胎停育流产绒毛组织染色体的非整倍体异常,染色体数目异常导致的胚胎停育与胎儿的性别无关,但与患者的年龄有关,胚胎常染色体数目异常组的孕妇年龄大于染色体数目正常组及性染色体数目异常组。     

高通量MLPA基因分型技术在1个Del表型家系基因鉴定中的应用

目的 对1个Del表型家系作基因鉴定.方法 运用血型血清学方法对先证者及其家系的3名成员作RhD及相关血型抗原鉴定;提取先证者及其父母和妹妹的静脉血DNA.运用高通量红细胞血型基因的多重连接依赖探针扩增技术(MLPA)对先证者及其他成员血型基因作定性及定量分型;用PCR产物直接测序方法对发现的变异作确认.结果 血型血清学检测:先证者为Del表型,其他3名家系成员为正常的RhD阳性个体.MLPA基因分型:先证者有2条包含1227G＞A突变位点的RHD等位基因,而3名家系成员有1条包含1227G＞A突变位点的RHD等位基因及1条正常的RHD等位基因.结论 高通量红细胞血型基因分型的MLPA技术能够对Del表型作明确的基因鉴定,有助于节约宝贵的RhD阴性血液.     

甲基化特异性多重连接探针扩增及甲基化特异性PCR诊断Prader-Willi综合征方法比较

  目的  应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR, MS-PCR)和甲基化特异性多重连接探针扩增(methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification, MS-MLPA)方法对Prader-Willi综合征(Prader-Willi syndrome, PWS)进行诊断并比较两种方法的差异。  方法  回顾性研究2005年10月至2014年2月到北京协和医院就诊的患儿及正常对照共102例, 男57例, 女45例。其中正常对照16例; 荧光原位杂交或高分辨染色体确诊PWS阳性对照2例; 临床疑似PWS患儿84例。提取受试者外周血基因组DNA分别应用MS-PCR及MS-MLPA方法进行基因分析, 对疑似患儿进行确诊和遗传类型分型, 并计算两种方法的特异性、敏感性及准确度, 应用卡方检验对两种方法进行比较。  结果  MS-PCR结果示正常对照及阳性对照与其表型全部相符, 84例疑似患儿中有39例提示为PWS, 45例提示正常。MS-MLPA结果示除正常对照外的86例受试者中, 29例提示为父源缺失型PWS; 9例提示为母源二体型PWS; 47例提示为正常; 1例因DNA过于陈旧未检出有效结果。对比两种方法检测结果, 有2例MS-PCR结果显示为PWS, 但MS-MLPA结果显示为正常, 通过增加DNA用量重新进行MS-PCR检测后, 除外PWS。结合临床表现, 受试者中明确诊断PWS的患儿39例, 非PWS者63例。MS-PCR方法共出现2例假阳性, 假阳性率为3.17%(2/63)。MS-PCR方法敏感性100%, 特异性96.83%, 准确度98.03%;MS-MLPA方法敏感性97.43%, 特异性100%, 准确度99.02%。两种方法的敏感性、特异性及准确度差异无统计学意义(P均 > 0.05)。  结论  MS-PCR及MS-MLPA敏感性、特异性及准确度皆佳, 均可用于PWS诊断, MS-MLPA可区分父源缺失型及母源二体型。MS-PCR应保证DNA用量充足以避免假阳性出现。MS-MLPA应使用新鲜提取的DNA, 且实验条件要求更为严格。建议同时使用两种方法检测以获得准确结果。     

Rh缺失型D--个体及其家系成员基因分型与序列分析

目的初步探讨Rh缺失型D--个体发生的分子机制。方法采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP),对两例Rh缺失型D--个体及其家系成员RHD与RHCE基因多个外显子与内含子进行扩增。根据PCR-SSP结果,对所有与血清学表型不符的异常扩增片段进行克隆测序。结果两例Rh缺失型D--个体PCR-SSP扩增后获得D、e的基因相关片段。经测序发现,RhD--个体1第5外显子第22位核苷酸出现缺失,48与90位发生点突变。RhD--个体2第5外显子第89位发生突变。结论Rh基因外显子的缺失以及单个核苷酸的缺失与突变可能是导致Rh缺失型DD--形成的重要原因之一。     

血清学Rh（D）阴性个体分子机制的研究

目的探讨江苏地区无偿献血者中血清学Rh（D）阴性表型汉族人群的分子背景。方法 37份常规血清学试验检测出的Rh（D）阴性江苏汉族人,采用PCR-SSP检测RHCE基因和RH（D）基因;并对存在RH（D）基因的个体进行10个外显子及邻近内含子的测序。结果 37例血清学Rh（D）阴性献血者中,分子生物学方法确认26例无RH（D）基因。存在RH（D）基因的11例中,3例为RH（D）和RHCE基因发生互换,6例为RH D（K409k）（第9外显子1 227G〉A）,1例为弱D15型（第6外显子845G〉A）,1例为RH（D）＊711delC（第5外显子711位碱基缺失）。结论一定比例的血清学阴性Rh（D）人群并非真正的Rh（D）阴性,即表达弱D抗原。提示对血清学Rh（D）阴性个体进行分子生物学分析,有利于安全输血。     

常见染色体病的快速检测

目的:初步建立运用多重连接探针扩增(MLPA)联合变性液相高效色谱(DHPLC)技术快速诊断常见染色体非整倍体的方法。方法:应用P095试剂盒将待测DNA标本进行MLPA反应,得到的MLPA反应产物用DHPLC仪进行分离分析,并于用ABI3130XL得到的结果加以对比。结果:检测了10份正常人DNA和16份21三体DNA、3份47,XYYDNA、3份47,XXXDNA标本,结果与用MLPA/ABI3130XL检测及染色体核型分析结果一致。结论:用1管MLPA反应结合DHPLC即可对常见染色体非整倍体作出快速、准确的诊断。     

多重连接探针扩增技术对1个假肥大型中国汉族肌营养不良症家系的遗传学研究

目的拟通过多重连接探针扩增技术(MLPA)对1个假肥大型进行性肌营养不良(DMD)家系进行检测以明确DMD的诊断,结合患者临床表现进行分析并对MLPA技术用于DMD临床诊断进行探讨。方法收集1个DMD患者家系,该家系共12人,男性患者2例。分离外周血并提取DNA,用MLPA的方法对其进行基因诊断。结果先证者符合DMD诊断。基因检测提示先证者和其弟弟携带抗肌萎缩蛋白基因缺失突变DMD(Exon3-11)。先证者母亲为致病基因携带者。结论通过MLPA检查技术明确了一个中国汉族DMD家系的致病基因,MLPA技术能够用于DMD疾病的诊断。     

Rh 新生儿溶血病的血清抗体分析

目的对20例Rh新生儿溶血病血清抗体回顾性分析。方法采用直接抗人球蛋白试验、游离抗体试验、放散试验检测ABO以外的抗体,采用微柱凝胶间接抗人球蛋白试验进行抗体鉴定。结果20例Rh溶血病患儿中由抗D引起的溶血病有11例,由抗-D和Rh其他系统抗体联合引起的有4例,共15例,占75%;由抗-E引起有3例,由抗-E和抗-c联合引起1例,占20%;由抗-C引起1例,占5%。20例患儿母亲都曾有生产或流产或输血史。结论为预防新生儿Rh溶血病的发生,尤其是对曾有过生产史、流产史或输血史的孕妇作产前夫妇Rh血型和孕妇Rh免疫性血清抗体筛查极有必要。     

NGS和MLPA技术检测2例马凡综合征患者FBN1基因缺失突变

目的对2例马凡综合征(Marfan's syndrome,MFS)患者的原纤维蛋白-1基因(FBN1)进行突变检测。方法提取患者的外周血全基因组DNA,用第二代测序技术(NGS)和多重连接探针扩增技术(MLPA)对FBN1进行突变筛查,对这2种方法提示有拷贝数异常的外显子进行PCR和DNA Sanger测序以证实突变。结果 NGS和MLPA技术检测均显示1例患者有18号外显子缺失突变,另1例患者其56号外显子有缺失突变。经PCR和Sanger测序证实前者18号外显子及其两侧翼区有大片段缺失c.2114-2357_2167+747del3158bp,后者第56号外显子及其内含子有9 bp的缺失突变c.6864_c.6871+1del CTGTGTAGG。结论 NGS和MLPA技术有助于筛查基因组缺失突变,但仍需借助Sanger测序等方法验证。     

PCR—SSP基因分型技术在Rh血型鉴定中的应用研究

目的研究聚合酶链式反应-特异性序列引物（polymerase chain reaction-sequence specific primer,PCR-SSP）基因分型技术在Rh血型鉴定中的应用。方法收集广东省肇庆市无偿捐血者RhD阴性血型样本2例、RhD阳性样本1例,采用盐水法进行C、c、D、E、e抗原分型,对D抗原阴性的样本采用抗人球蛋白法进行确认。提取样本基因组DNA,并应用PCR-SSP基因分型技术特异性扩增RhD以及RhCE基因片段,并对D外显子进行检测。根据有无PCR产物以及产物长度,判断样本的基因型。结果1例RhD阳性样本以及ccdee样本的血清学分型与基因分型结果相符合,1例Ccdee样本的血清学分型与基因分型结果不相符。结论PCR—SSP基因分型技术在RhD血型鉴定中能识别血清意义上的假阴型,在临床输血实践中具有广阔的应用前景。     

Rh血型抗原抗体检测对保障输血安全的意义

目的：探讨 Rh 血型系统抗原、抗体检测在安全输血中的意义。方法对2012年8月至2013年5月在该院住院的2700例输血患者进行 Rh 系统抗原表型检验和抗体筛查。结果Rh 血型抗原表型所占比例由高到低依次为 CCDee、CcDEe、CcDee、ccDEE、CCDEe,5种抗原基因频率由高到低依次为 D、e、C、c、E。结论对于接收输血者及供血者,除了要做必需的常规检查外还应进行其他4种 Rh 血型抗原表型的检查及相应抗体的鉴定,从而避免因输血而产生免疫性抗体,给患者再次输血带来困难。