LOX-1/NF-κB信号途径对ox-LDL刺激的人脐静脉内皮细胞炎症因子表达的影响及氟伐他汀的干预作用

目的：探讨血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）/核因子（NF）-κB信号途径对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）刺激的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）炎症因子表达的影响及氟伐他汀的干预作用。方法：设立不同浓度的ox-LDL刺激组,LOX-1中和抗体干预组,NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氢基甲酸盐（PDTC）干预组,氟伐他汀干预组及空白对照组;检测细胞上清液中肿瘤坏死因子（TNF）-α,白细胞介素（IL）-6的浓度。结果：25mg/L、50mg/L、100mg/L浓度的ox-LDL刺激组24h后上清液TNF-α浓度分别为：（32.34±2.46）pg/ml、（96.43±8.36）pg/ml、（62.79±4.64）pg/ml,IL-6浓度分别为：（264.71±15.06）pg/ml、（630.70±17.77）pg/ml、（378.62±16.33）pg/ml,均较空白对照组TNF-а（22.99±3.55）pg/ml、IL-6（80.37±8.29）pg/ml水平显著升高（P〈0.05~0.01）;NF-кB抑制剂PDTC和LOX-1中和抗体干预后上清液TNF-α浓度较50mg/L ox-LDL刺激组显著下降（P〈0.01）。不同浓度氟伐他汀（0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L）干预HUVECs 24h后上清液TNF-α浓度分别为（73.84±6.50）pg/ml、（42.59±6.45）pg/ml、（23.55±4.27）pg/ml;IL-6浓度分别为（549.0±20.23）pg/ml、（434.56±22.4）pg/ml、（302.42±21.30）pg/ml,较50mg/L ox-LDL刺激组显著下降（P〈0.05~0.01）。结论：氧化低密度脂蛋白可刺激人脐静脉内皮细胞上清液中炎症因子TNF-α和IL-6的表达,在25~50mg/L剂量范围内呈显著的剂量-效应关系。氟伐他汀可浓度依赖性抑制人脐静脉内皮细胞上清液中炎症因子TNF-α和IL-6的表达。     

黄芪多糖对LPS损伤小肠上皮细胞的保护作用

目的:探讨黄芪多糖(APS)在内毒素-脂多糖(LPS)损伤小肠上皮细胞(IEC-6)中的作用机制及对细胞因子和核因子-κB(NF-κB)表达的影响.方法:以小肠上皮细胞株IEC-6为研究对象, 将培养的细胞分为6组: 对照组、LPS组、LPS APS 50 mg/L组、LPS APS 100 mg/L组、LPS APS 200 mg/L组和LPS APS 500 mg/L组. 采用RT-PCR法检测细胞因子TNF-α和IL-8 mRNA的表达, 采用凝胶电泳迁移率法分析NF-κB蛋白活性.结果: LPS损伤IEC-6细胞后, TNF-α, IL-8 mRNA水平和NF-κB蛋白定量表达均升高, 均显著高于对照组(TNF-a: 1.26±0.06 vs 0.65±0.05, IL-8 mRNA: 1.19±0.05 vs 0.57±0.06, NF-kB: 2.76±0.07 vs 0.07±0.03, P均<0.01). 而黄芪多糖呈浓度和时间依赖性地抑制LPS诱导IEC-6细胞分泌的TNF-α, IL-8等细胞因子的mRNA的表达水平(P<0.01), 并能降低NF-κB的表达活性(P<0.01).结论:APS具有抑制LPS刺激IEC-6细胞产生的TNF-α, IL-8炎性因子的作用, 并能降低NF-κB的表达活性, 其对LPS所致的肠道损伤具有保护作用.     

肺结核患者外周血sIL-2R、IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α的检测意义

目的分析未抗痨治疗的结核患者及已经有效治疗的患者s IL-2R、IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α表达的差异,以探讨上述指标的变化及意义。方法采用免疫化学发光法检测未抗结核治疗患者(A组)、抗结核治疗有效患者(B组)及健康组(C组)上述指标的表达水平,并比较各组差异。结果 A组C组相比较,均明显升高(P0.01)。B组s IL-2R和IL-6的含量较A组明显下降,分别为(509.41±96.52)U/ml vs(1207.09±105.33)U/ml和(8.91±3.22)pg/ml vs(37.84±15.46)pg/ml(P0.01);IL-8和TNF-α在B组中的含量较A组明显下降,分别为(12.78±3.69)pg/ml vs(23.82±5.67)pg/ml和(14.33±6.82)pg/ml vs(32.41±11.66)pg/ml(P0.05);而IL-10水平未发生明显变化。结论肺结核病患者s IL-2R、IL-6、IL-8、TNF-α水平明显增加,抗结核治疗后上述因子水平明显降低,初步提示s IL-2R、IL-6、IL-8、TNF-α表达水平与结核活动程度相关,有望进一步作为评价肺结核活动程度的指标。     

Toll样受体-2、核因子-κB在Aβ诱导的阿尔茨海默病中的作用

目的探讨Toll样受体2(TLR-2)、核因子-κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β与β淀粉样蛋白(Aβ)诱导的阿尔茨海默病(AD)中的作用。方法将雄性Wistar大鼠50只,随机分为A、B、C、D、E组,每组10只;A组大鼠双侧海马CA1区注射5μl生理盐水,B~E组双侧海马注射5μl Aβ(分别含Aβ25~350.5、1、5、10μg);ELISA检测TNF-α、IL-1β含量;免疫组化(IHC)检测海马CA1区TLR-2表达;实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测TLR-2、NF-κB基因的mRNA表达。结果 IHC检测TLR-2主要聚集在Aβ斑块周围,D组(0.036 6±0.007 3)、E组(0.044 8±0.010 8)TLR-2阳性表达明显高于A组(0.018 7±0.005 8)、B组(0.010 0±0.003 4)、C组(0.015 1±0.006 0)(P0.01);ELISA检测大鼠血清TNF-α含量D组(568.65±44.66)pg/ml、E组(685.06±29.92)pg/ml明显高于A组(426.87±55.91)pg/ml、B组(432.99±28.09)pg/ml、C组(488.14±39.04)pg/ml(P0.01),IL-1β含量D(104.60±9.32)pg/ml、E组(143.38±17.09)pg/ml明显高于A(49.13±8.46)pg/ml、B(60.89±14.71)pg/ml、C(79.81±9.94)pg/ml三组(P0.01);qRT-PCR检测大鼠海马组织内TLR-2 mRNA表达D组(2.185 9±0.381 4)、E组(2.977 7±0.390 7)明显高于A组(1.000 0±0.000 0)、B组(1.178 5±0.106 6)、C组(1.463 3±0.127 3)(P0.01);NF-κB mRNA表达D组(1.747 0±0.125 6)、E组(2.271 9±0.533 2)明显高于A组(1.000 0±0.000 0)、B组(1.274 3±0.165 1)、C组(1.429 1±0.077 7)(P0.01)。结论随着Aβ剂量不断增加,TLR-2促进小胶质细胞吞噬和清除Aβ的能力不足使Aβ积聚体并激活NF-κB,促进更多的TNF-α、IL-1β释放,最终导致大鼠脑内神经元损伤。     

锌指蛋白A20干预人单核细胞炎症因子TNF-α、IL-12以及IL-10表达的实验研究

目的通过阳离子脂质体将A20基因转染入单核细胞,观察A20过表达对促炎因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-12及抗炎因子IL-10表达的调节以及对促炎因子/抗炎因子比率即TNF-α/IL-10和IL-12/IL-10比率的影响,探讨锌脂蛋白A20对单核细胞炎症反应的保护作用及可能的调节机制。方法用Ficoll细胞分离液分离人外周血单核细胞,随机分为A组(空白对照组);B组[脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)组];C组(A20转染组);D组(LPS加A20转染组)。荧光显微镜检测GFP报告基因,反转录聚合酶链反应检测内源性A20、外源性A20的mRNA表达;免疫组化检测A20蛋白的表达;双抗体夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测上清液TNF-α、IL-12及IL-10表达水平。结果单核细胞受到LPS(1 mg/L)刺激后,其内源性A20的mRNA和蛋白表达以及TNF-α、IL-12和IL-10表达较对照组均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);TNF-α/IL-10和IL-12/IL-10的比率均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。转染A20基因的单核细胞,在无LPS刺激的条件下,其内源性A20的mRNA和蛋白表达以及TNF-α、IL-12和IL-10的表达与对照组比较,差异均无统计意义(P>0.05);TNF-α/IL-10和IL-12/IL-10的比率与对照组比较,差异也无统计意义(P>0.05)。而转染A20基因的单核细胞在受到LPS(1 mg/L)刺激后,其促炎因子TNF-α、IL-12的表达均显著低于LPS组,而抗炎因子IL-10的表达明显上调,高于对照组和LPS组;而TNF-α/IL-10和IL-12/IL-10的比率明显下降,低于LPS组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 A20的表达具有炎症活化依赖性;A20过表达可抑制TNF-α、IL-12的表达,而上调抗炎因子IL-10表达,并通过改善促炎因子/抗炎因子的平衡关系,从而达到抑制炎症反应的作用。     

TNF-α对胃癌细胞MMP-2和MMP-9表达的诱导作用

目的:探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)对胃癌细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达的诱导作用.方法:以外源性TNF-α作用于胃癌细胞.未经TNF-α作用的胃癌细胞作为对照.采用ELISA法检测胃癌细胞培养上清液中MMP-2和MMP-9蛋白的含量.采用RT-PCR检测胃癌细胞MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表达状况.采用Western blot检测胃癌细胞内MMP-2蛋白和MMP-9蛋白含量.结果:不同浓度(1,10和100μg/L)的TNF-α作用胃癌细胞后,胃癌细胞上清液中MMP-2的含量分别为8.24±1.36,23.65±3.45和14.83±2.54 ng/L,均显著高于对照组(1.56±0.23 ng/L,P<0.01);MMP-9的含量分别为12.47±2.66,34.12±6.78和23.31±4.45 ng/L,亦均明显高于对照组(5.25±0.89 ng/L,P<0.01),其中以10μg/L TNF-α作用时升高最为显著.TNF-α作用胃癌细胞16h后,上清液中MMP-2和MMP-9含量达到峰值,分别为23.65±3.45和34.12±6.78 ng/L.胃癌细胞MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表达明显增强,胃癌细胞内MMP-2和MMP-9蛋白表达亦明显增多.结论:TNF-α可上调胃癌细胞MMP-2和MMP-9表达.     

HPV16 E2蛋白及其TAD和DBD对巨噬细胞分泌TNF-α与IL-1β的影响

目的分析人乳头瘤病毒(HPV)16型E2蛋白及其转活性结构域(TAD)和DNA结合结构域(DBD)与绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白在巨噬细胞(MΦ)中的定位,并研究其对MΦ分泌TNF-α和IL-1β的影响。方法将质粒pEGFP-C1、pEGFP-C1/E2、pEGFP-C1/TAD、pEGFP-C1/DBD分别转染MΦ,倒置荧光显微镜下观察融合蛋白在MΦ中的分布与定位,通过ELISA测定转染细胞培养上清液中TNF-α和IL-1β的含量。结果 GFP、GFP-E2融合蛋白在MΦ细胞核、细胞浆内均有表达,且后者细胞核荧光亮度强于细胞浆;GFP-DBD融合蛋白表达于细胞核,GFP-TAD表达于细胞浆。GFP-E2组细胞培养上清中TNF-α和IL-1β含量分别为(321.83±22.00)pg/ml和(214.35±22.79)pg/ml,GFP-TAD组分别为(371.79±22.73)pg/ml和(233.52±17.75)pg/ml,GFP组和空白组分别为(265.74±28.74)pg/ml、167.60±18.68)pg/ml和(234.76±31.94)pg/ml、155.13±20.54l)pg/ml,差异有统计学意义(P<0.05);GFP-DBD组分别为(258.24±33.55)pg/ml和(148.08±19.50)pg/ml,与GFP组和空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。GFP-TAD组与GFP-E2组比较TNF-α含量差异有统计学意义(P<0.05),IL-1β含量差异无统计学意义(P>0.05)。结论真核表达载体pEGFP-C1/HPV16E2、pEGFP-C1/TAD、pEGFP-C1/DBD均能在MΦ中表达相应的融合蛋白,GFP-E2主要定位细胞核,GFP-DBD仅定位细胞核,GFP-TAD仅定位细胞浆;HPV16E2及其TAD即时高表达上调MΦ分泌TNF-α和IL-1β。     

沉默信息调节因子1在具核梭杆菌诱导肠上皮细胞炎症和凋亡中的作用

目的探讨沉默信息调节因子1(SIRT1)在具核梭杆菌(Fn)诱导肠上皮细胞炎症和凋亡中的作用。方法建立Fn感染肠上皮细胞模型并分为3组,即Fn感染组、Fn+Sirtinol组(SIRT1抑制剂)、Fn+白藜芦醇组(SIRT1激动剂),另设未感染对照组。在Fn感染肠上皮细胞6 h后,采用qRT-PCR、ELISA、Western blot、流式细胞术检测4组细胞中SIRT1基因mRNA和蛋白表达情况、炎症因子的量、NF-κB信号通路的表达、凋亡率、凋亡相关蛋白的表达。结果与Fn感染组相比,Fn+白藜芦醇组细胞中SIRT1 mRNA和蛋白质的表达升高,Fn+Sirtinol组细胞中SIRT1 mRNA和蛋白质的表达降低(P0.01)。Fn+Sirtinol组上清液中4种炎症因子含量[IL-1β:(35.975±2.995)pg/ml,IL-6:(954.250±37.340)pg/ml,IL-8:(598.500±23.014)pg/ml,TNF-α:(398.296±20.663)pg/ml]显著高于Fn+白藜芦醇组[IL-1β:(6.925±1.053)pg/ml,IL-6:(242.009±18.850)pg/ml,IL-8:(5.375±6.067)pg/ml,TNF-α:(79.537±8.334)pg/ml]和Fn感染组[IL-1β:(11.125±1.374)pg/ml,IL-6:(525.425±21.247)pg/ml,IL-8:(262.000±14.071)pg/ml,TNF-α:(180.412±11.826)pg/ml](P0.01)。Fn+Sirtinol组细胞中3种NF-κB信号通路相关蛋白质的表达量与其余3组比较差异有统计学义(P0.01);Fn感染组细胞中3种蛋白质的表达量明显高于Fn+白藜芦醇组和对照组(P0.01,P0.05)。Fn+Sirtinol组细胞在Fn感染6 h后凋亡率达峰值[(27.028±3.319)%],与其余3组的细胞的凋亡率比较差异有统计学义(P0.01);Fn感染组细胞的凋亡率[(16.864±2.213)%]明显高于Fn+白藜芦醇组[(5.584±1.148)%]和对照组[(2.510±0.763)%](P0.01)。Fn+Sirtinol组细胞中Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白高表达,与其余3组比较差异有统计学义(P0.01)。Fn+Sirtinol组细胞中Bcl-2蛋白低表达,与Fn+白藜芦醇组和对照组表达量比较差异有统计学义(P0.01或P0.05),Fn+白藜芦醇组组细胞中Bcl-2蛋白的表达量则明显高于对照组(P0.01)。结论在Fn感染的体外模型中,SIRT1可抑制肠上皮细胞分泌炎症因子,下调NF-κB信号通路的表达,可能通过线粒体凋亡途径抑制细胞的凋亡。     

二苯乙烯苷对急性酒精性肝损伤小鼠炎症相关因子的影响

目的:研究二苯乙烯苷(tetrahydroxystilbene glucoside,TSG)对急性酒精性肝损伤小鼠炎症相关因子的影响.方法:将昆明种小鼠随机分为正常对照组、模型组、TSG低剂量组(30mg/kg)、TSG高剂量组(60mg/kg)、水飞蓟宾组(50mg/kg);采用白酒灌胃的方式建立小鼠急性酒精性肝损伤模型.光学显微镜观察小鼠肝脏病理变化,采用ELISA法检测各组小鼠血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α、白介素1β(interleukin1β,IL-1β)、IL-6的含量,鲎试剂终点显色法检测小鼠血浆内毒素水平,Real-timePCR法检测肝脏组织TNF-α和iNOS基因表达,Westernblot法检测肝脏组织IκB-α磷酸化水平和NF-κB核移位程度.结果:与正常对照组比较,模型组小鼠肝索排列紊乱,肝脏出现明显的脂肪变性,血清TNF-α、IL-1β、IL-6的含量和血浆内毒素水平均显著升高,TNF-α和iNOS基因表达上调,IκB-α磷酸化水平升高和NF-κB核移位增多,差异具有统计学意义[TNF-α:128.5pg/mL±20.7pg/mLvs45.2pg/mL±14.2pg/mL;IL-1β:71.8pg/mL±9.1pg/mLvs33.1pg/mL±9.5pg/mL;IL-6:59.8pg/mL±13.1pg/mLvs23.7pg/mL±5.9pg/mL;endotoxin:0.35EU/mL±0.09EU/mLvs0.11EU/mL±0.03EU/mL.TNF-α mRNA:1.33±0.11vs0.63±0.10;iNOS mRNA:0.85±0.09vs0.40±0.07;phospho-IκB-α:2.02±0.14vs0.92±0.19;NF-κB P65:1.10±0.14vs0.44±0.13,P<0.05或P<0.01];给予TSG后,小鼠肝脏组织脂肪变性减少,各组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6的含量和血浆内毒素水平均明显降低;肝脏组织TNF-α和iNOS基因表达下调,同时IκB-α磷酸化水平和NF-κB核移位减少,差异具有统计学意义[TSG60mg/kg group:TNF-α:65.9pg/mL±13.9pg/mLvs128.5pg/mL±20.7pg/mL;IL-1β:43.0pg/mL±7.1pg/m Lvs 71.8pg/mL±9.1pg/mL;IL-6:36.3pg/mL±10.1pg/mL vs 59.8pg/mL±13.1pg/mL;endotoxin:0.20EU/mL±0.05EU/mL vs 0.35EU/mL±0.09EU/mL;TNF-α mRNA:0.79±0.09vs1.33±0.11;iNOS mRNA:0.53±0.10vs0.85±0.09;phospho-IκB-α:1.35±0.32vs2.02±0.14;NF-κB P65:0.62±0.05vs1.10±0.14,P<0.05或P<0.01].结论:TSG对小鼠急性酒精性肝损伤有良好的保护作用,其机制可能是通过抑制内毒素引起的Kupffer细胞激活,进而抑制下游核因子NF-κB的激活,减少炎性反应级联放大的触发机制,从而产生肝功能保护作用.     

芍药甙对急性坏死性胰腺炎大鼠NF-κBp65及细胞因子表达的影响

目的观察芍药甙对ANP大鼠的治疗效果及对NF-κB、TNF-α、IL-6表达的影响。方法40只大鼠随机分为正常组、ANP 24h、72h组和芍药甙24h、72h治疗组(芍药组),每组8只。采用L -精氨酸腹腔内注射法诱发ANP模型,芍药组于造模后即刻用2ml芍药甙药液灌胃,11次/2h。各组采血检测血清淀粉酶,取胰腺组织行病理检查,Western blot法检测NF-κB p65蛋白表达,实时荧光定量PCR法检测TNF-αmRNA、IL-6 mRNA的表达。结果造模后24h ANP组和芍药组血清淀粉酶分别为(3569±516)U/L和(2994±370)U/L,明显高于正常组的(1136±107)U/L(P<0.05);病理学分值分别为4.25±0.63和3.06±0.49,也明显高于正常组的0分(P<0.05);芍药组24h的NF-κB p65蛋白及TNF-αmRNA、IL-6 mRNA表达相对值分别为0.230±0.044,0.141±0.018和0.017±0.029,72h分别为0.040±0.006、0.078±0.017和0.008±0.001,均显著低于同时间点的ANP组(P<0.05)。结论芍药甙能减轻ANP大鼠胰腺的病理损害程度,其机制可能与抑制NF-κB活化、抑制TNF-αmRNA、IL-6 mRNA表达有关。     

脂多糖对AR42J细胞Toll样受体7、9表达的影响

目的探讨Toll样受体（TLR）7、9在急性胰腺炎（AP）发病机制中的作用。方法用含1、10、100mg／L脂多糖的培养基处理正常大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J,构建AP体外细胞模型,以不加脂多糖处理的细胞作为对照组。培养24h后收集细胞及培养上清液。采用RT-PCR法和蛋白质印迹法分别检测细胞TLR7、TLR9mRNA及蛋白的表达,ELISA法检测培养上清液中TNF-α、IL-10含量。结果对照组及1、10、100mg／L脂多糖处理组细胞TLR7mRNA表达量分别为0．12±0．09、0．28±0．06、0．49±0．04、0．78±0．04;TLR9mRNA表达量为0．06±0．02、0．32±0．03、0．56±0．14、0．84±0．12;TLR7蛋白表达量为0．04±0．01、0．26±0．05、0．49±0．04、0．77±0．16;TLR9蛋白表达量为0．10±0．14、0．62±0．23、1．21±0．26、1．75±0．13。培养上清液中TNF-α含量分别为（8．01±5．32）、（25．64±8．71）、（49．06±10．23）、（75．83±6．65）ng／L;IL-10含量分别为（155．54±25．47）、（105．16±10．49）、（69．36±8．19）、（14．07±9．06）ng／L。细胞TLR7和TLR9的mRNA及蛋白表达量、培养上清液中TNF-α含量均随脂多糖浓度升高而逐渐升高,而培养上清液中IL-10含量随脂多糖浓度增加逐渐下降,各组间的差异均具有统计学意义（P值均〈0．01）。结论脂多糖处理AR42J细胞后细胞的TLR7、TLR9基因表达明显上调,提示两者在AP疾病发展中可能发挥重要作用。     

高糖对小鼠足细胞表型转化的诱导作用及机制探讨

目的观察高糖对小鼠足细胞表型转化的诱导作用,并探讨其机制。方法将传代培养后的小鼠足细胞随机分为A、B、C三组,A组常规培养,B组加入终浓度为30 mmol/L的葡萄糖、C组加入终浓度为30 mmol/L的葡萄糖及10μmol/L的蛋白质酪氨酸激酶(JAK2)特异性阻断剂α-氰-(3,4-二羟基)-N-苄基肉桂酰胺(AG490)进行培养,48 h后收集细胞,采用Western blot法检测足细胞中自身标志物人肾病蛋白(Nephrin)、间充质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及磷酸化蛋白质酪氨酸激酶(p-JAK2)蛋白,采用RT-PCR检测足细胞中的Nephrin、α-SMA mRNA。结果 A组足细胞中Nephrin、α-SMA、p-JAK2蛋白积分光密度值分别为0.96±0.01、0.21±0.02、0.39±0.01,B组分别为0.58±0.01、0.66±0.07、0.71±0.02,C组分别为0.87±0.04、0.35±0.02、0.41±0.04;A组足细胞中Nephrin、α-SMA mRNA的相对表达量为1.53±0.04、0.57±0.01,B组分别为0.82±0.09、0.89±0.03,C组分别为1.30±0.04、0.78±0.03。B组与A组比较,P均<0.05;C组与B组比较,P均<0.05。结论高糖可通过激活JAK/STAT信号途径诱导足细胞发生表型转化。     

口服抗生素对NASH大鼠肝组织TLR4信号通路的影响

目的观察口服抗生素对非酒精性脂肪性肝炎大鼠代谢性内毒素血症激活肝脏4型Toll样受体(TLR4)信号通路的影响。方法将30只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组和干预组,后者给予高脂饮食喂养,正常组予普通饲料喂养。干预组大鼠自第9周起给予环丙沙星灌胃。造模12周末,比较各组门静脉血内毒素、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、甘油三酯和空腹血糖水平;计算非酒精性脂肪性肝病评分;采用Real time PCR及Westernblot法检测大鼠肝脏TLR4、胰岛素受体底物-1(IRS-1)mRNA及蛋白表达水平;采用ELISA法检测血清和肝匀浆肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)水平。结果模型组动物门静脉内毒素为0.361±0.018EU/ml,而正常组为0.324±0.013EU/m(l P<0.05);肝脏TLR4 mRNA水平为正常组的7.7倍,IRS-1 mRNA水平下降69%,血清及肝脏TNF-α分别为105.7±30.1pg/ml和608.7±78.8pg/ml,IL-6分别为60.9±12.5pg/ml和756.4±90.8pg/ml,均显著高于正常组(P<0.05);与模型组比,干预组门静脉血内毒素为0.341±0.016EU/m(lP<0.05),NAS积分为4.40±0.26(P<0.05),肝脏TLR4 mRNA和蛋白表达水平分别下降44%和14%,肝脏IRS1 mRNA和蛋白表达水平分别增加2.3倍和1.6倍,TNF-α和IL-6水平分别为531.1±64.6pg/ml和575.1±84.5pg/m(lP<0.05)。结论 NASH大鼠肝脏TLR4信号通路被激活,口服抗生素可减少肠源性内毒素血症,减轻肝脏炎症。     

化痰祛湿活血方对脂肪变L02细胞促炎抑炎因子的影响

目的:探讨化痰祛湿活血方对脂肪变L02细胞相关炎性因子的影响。方法:培养L02细胞,采用油酸复制脂肪变肝细胞模型,随机分为空白组、模型组、脂联素(ADPN)组和化痰祛湿活血方含药血清组(中药组)。化学发光法测定细胞上清液中ALT、AST、TG含量;运用ELISA法检测细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10水平,Real time PCR法检测细胞中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10 mRNA表达。结果:与模型组比较,24 h后ADPN组和中药组L02细胞中ALT、AST、TG含量均明显下降(P0.05),TNF-α、IL-1、IL-6水平明显下降,IL-10水平明显上升(P0.05)。TNF-α、IL-1、IL-6 mRNA表达明显下降(P0.05),IL-10 mRNA表达明显升高(P0.05)。结论:化痰祛湿活血方可通过下调TNF-α、IL-1α、IL-6表达及上调IL-10表达抑制脂肪变L02细胞炎症反应。     

沙利度胺对大鼠急性坏死性胰腺炎保护作用的实验研究

目的 探讨沙利度胺对大鼠急性坏死性胰腺炎(ANP)的保护作用及机制.方法 54只SD大鼠按数字表法随机分成ANP组、沙利度胺组和对照组,每组18只.采用5%牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射方法建立ANP模型.沙利度胺组于建模后1 h予沙利度胺200 mS/kg体重灌胃.术后3、6、12 h分批处死大鼠,观察腹水量;ELISA法检测血清TNF-α、IL-6、IL-18水平;流式细胞术检测外周血CD4+、CD8+T细胞比例;RT-PCR法检测胰腺组织TNF-α mRNA表达;免疫组化法检测胰腺组织细胞间黏附分子1(ICAM-1)蛋白表达;行胰腺常规病理检查.结果 术后6 h,对照组的腹水量,血清TNF-α、IL-6、IL-18水平和CD4+、CD8+T 细胞比例,胰腺组织TNF-α mRNA及CAM-1蛋白表达,病理评分分别为(1.03±0.31)ml、(57.17±11.29)pg/ml、(24.45 ±4.14)pg/ml、(64.23 ±21.85)pg/ml、(47.58±9.21)%、(40.88±2.96)%、0.07±0.02、0.57±0.30、0.67±0.81;ANP组分别为(3.63±0.38)ml、(107.54±33.05)pg/ml、(47.30±11.40)pg/ml、(367.76±108.43)pg/ml、(54.90±7.15)%、(17.17±3.12)%、0.65±0.26、3.20±0.57、11.50±1.87;沙利度胺组分别为(1.45±0.53)ml、(80.60±20.48)pg/ml、(26.61±10.85)pg/ml、(321.82±85.20)pg/ml、(29.80±2.19)%、(15.52±1.96)%、0.35±0.23、2.37±0.67、8.00±3.03.ANP组除CD8+T细胞比例显著降低外,其余指标均较对照组显著增加(P值均<0.05).沙利度胺组指标均显著低于ANP组(P值均<0.05).结论 沙利度胺能通过抑制TNF-α表达,减少炎症递质的释放,从而减轻ANP大鼠的胰腺病理损害.     

瞬时受体电位M8离子通道对冷刺激诱导气道上皮细胞炎症反应的影响

目的 探讨瞬时受体电位M8离子通道(TRPM8)在冷刺激诱导气道上皮细胞产生炎性因子过程中发挥的作用及相关信号转导机制.方法 用冷空气(18℃)刺激人气道上皮16HBE细胞,以TRPM8通道特异性拮抗剂BCTC、TRPM8 shRNA及蛋白激酶C(PKC)特异性抑制剂钙磷酸蛋白C为干预手段,将细胞分为对照组(37℃培养)、冷刺激组、冷刺激+BCTC组、冷刺激+转染TRPM8 shRNA组、冷刺激+转染对照shRNA组、冷刺激+钙磷酸蛋白C组.Western blot法检测TRPM8 shRNA转染对16HBE细胞合成TRPM8蛋白的干扰效率;钙离子成像技术测量前5组细胞内每10s间隔的相对Ca2+浓度动态变化;ELISA法检测各组细胞分泌的白细胞介素(IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α蛋白含量;实时荧光定量PCR检测各组细胞中IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表达水平.结果 冷刺激组细胞内相对Ca2+浓度最高值为2.36±0.24,显著高于对照组的1.01±0.02(t=12.52,P＜0.01),冷刺激+BCTC组、冷刺激+转染TRPM8 shRNA组细胞内相对Ca2+浓度降为1.47±0.17和1.26±0.12,显著低于冷刺激组(t值分别为6.69、9.12,均P＜0.01);冷刺激组的IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA和蛋白含量分别为0.66±0.16、0.77±0.15、0.73±0.09、(92±13) ng/L、( 125±22) ng/L、( 88±12) ng/L,较对照组[0.37±0.08、0.32±0.07、0.48±0.10、(52±8)ng/L、(50 ±9) ng/L、(61±8)ng/L]显著升高(t值分别为3.20、5.36、3.36、5.24、6.26、3.74,均P＜0.05),冷刺激+ BCTC组[分别为0.42±0.09、0.52±0.13、0.52 ±0.12、(72±8)ng/L、(92±14) ng/L、(68±11)ng/L]、冷刺激+转染TRPM8 shRNA组[分别为0.41 ±0.10、0.49±0.08、0.50±0.08、(60±12)ng/L、(89±14)ng/L、(68±11)ng/L]、冷刺激+钙磷酸蛋白C组[分别为0.40±0.07、0.44±0.09、0.47±0.08、(69±9)ng/L、(86±15) ng/L、(61±10) ng/L]较冷刺激组显著降低(均P＜0.05);冷刺激+转染对照shRNA组[分别为0.61±0.10、0.69±0.11、0.64±0.13、(89±13) ng/L、( 118±20)ng/L、(79±13)ng/L]与冷刺激组比较差异无统计学意义(t值分别为0.48、0.79、1.12、0.35、0.43、1.00,均P＞0.05).结论 冷空气可通过激活气道上皮细胞上的TRPM8离子通道而诱导Ca2+内流进而激活下游PKC信号通路,进而导致代表性炎性因子的表达及生成增多.     

JAK/STAT信号通路在胰弹性蛋白酶诱导大鼠Kupffer细胞分泌IL-18中的作用

目的:探讨JAK/STAT信号通路在胰弹性蛋白酶(elastase)诱导Kupffer细胞分泌IL-18中的作用机制.方法:采用酶消化法及密度梯度离心法将提取的肝脏Kupffer细胞分为4组,A组:生理盐水组(正常对照组);B组:脂多糖(LPS)处理组;C组:LPS和elastase处理组:D组:AG490预处理组.采用酶免疫吸附(ELISA)法检测Kupffer细胞上清液中IL-18含量;细胞免疫荧光染色技术和Westem blot法检测细胞总蛋白中JAK2的表达.结果:与A组比较,B组在给予LPS刺激后.JAK2蛋白的表达以及上清液中IL-18含量均明显增加(IL-18:312.23±20.5 ng/Lvs 13.50±2.18 ng/L,P<0.01);C组在同时给予LPS和elastase刺激后,JAK2的表达显著升高,上清液中IL-18含量与B组比较也显著增加(P<0.01);而D组在预先给予AG490处理后,JAK2表达明显下降,上清液中IL-18含量也有不同程度降低,与C组比较差异有统计学意义(317.31±25.24 ng/L vs438.86±21.32 ng/L,P<0.01),但与B组比较,各值仅有轻微变化,差异无统计学意义.结论:抑制JAK/STAT通路的活化可下调elastase诱导Kupffer细胞分泌促炎症因子IL-18的表达,这可能有助于减轻急性胰腺炎时炎症反应和肝损伤.     

RhoA/ROCK通路在缺氧复氧诱导的人心肌AC16细胞损伤中的作用机制

目的 探讨Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)通路在缺氧复氧(H/R)诱导的人心肌AC16细胞损伤中的作用及其机制。方法 将体外培养的AC16细胞分为对照组(正常培养)、H/R组(构建H/R模型)、H/R＋NC-siRNA组(转染NC-siRNA后构建H/R模型)和H/R＋RhoA-siRNA组(转染RhoA-siRNA后构建H/R模型),采用MTT法检测AC16细胞存活率,流式细胞术检测AC16细胞凋亡率,比色法检测AC16细胞乳酸脱氢酶(LDH)活性和Caspase-3活性,ELISA检测AC16细胞上清液中白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,试剂盒检测AC16细胞超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平,实时荧光定量PCR检测AC16细胞中RhoA、ROCK1、ROCK2、核因子κB(NF-κB)p65及IkB激酶(IKK)的mRNA表达水平,Western blot检测AC16细胞中RhoA、ROCK1、ROCK2、NF-κB p65、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)p65及IKK的蛋白表达水平。结果 与对照组比较,H/R组细胞存活率、SOD水平显著降低,细胞凋亡率、LDH活性、Caspase-3活性、MDA水平和细胞上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及细胞中RhoA、ROCK1、ROCK2、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IKK mRNA与蛋白表达水平均显著升高(P＜0.05);H/R＋NC-siRNA组和H/R组之间上述各指标差异均无统计学意义(P＞0.05);与H/R＋NC-siRNA组比较,H/R＋RhoA-siRNA组细胞存活率、SOD水平显著升高,细胞凋亡率、LDH活性、Caspase-3活性、MDA水平和细胞上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及细胞中RhoA、ROCK1、ROCK2、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IKK mRNA与蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05)。结论 靶向抑制RhoA/ROCK通路可通过降低炎症反应、氧化应激和细胞凋亡减轻H/R诱导的心肌细胞损伤。     

双歧杆菌分泌型粘附素对肠上皮细胞应激反应的影响

目的 观察双歧杆菌分泌型粘附素对肠上皮细胞应激反应后核因子(NF)-κB DNA结合活性、细胞胞质核因子抑制蛋白κB(IκB)、细胞胞核NF-κB p65的表达和肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-8等细胞因子表达的影响.方法 经培养的肠上皮Lovo细胞分为5组,分别经LPS( 100 ng/ml)、H2O2( 200 μmol/L)直接刺激3h以及经双歧杆菌分泌型粘附素(30 μg/ml)预孵30 min后再予LPS( 100 ng/ml)、H2O2刺激(200 μmol/L)刺激3h,正常对照组未作任何处理.采用凝胶电泳迁移率试验(EMSA)方法检测NF-κB DNA结合活性;Western印迹法分别检测细胞胞质IκB和细胞胞核NF-κBp65的表达;RT- PCR方法检测TNF-α、IL-1β、IL-8等细胞因子mRNA的表达情况.结果LPS和H2O2刺激后,细胞表现出较高的NF-κB DNA结合活性[分别为正常对照组的(6.20±0.35)倍和(4.16±0.52)倍]和细胞胞核NF-κB p65的表达[分别为(0.64±0.05)和(0.67±0.06)],而细胞胞质IxB的表达则较弱[分别为(0.28±0.10)和(0.39±0.12)];以双歧杆菌分泌型粘附素预孵后,前二者活性明显降低,而后者的表达明显增强;LPS和H2O2处理后,TNF-α、IL-1β、IL-8等细胞因子mRNA的表达水平均明显增高[LPS处理组分别为(0.92±0.10)、(0.38±0.03)、(1.44±0.25),H2O2处理组分别为(0.89±0.13)、(0.36±0.06)、(1.42±0.18)],而粘附素预孵后则可显著降低它们的表达水平.NF-κB DNA结合活性与TNF-α、IL-1β、IL-8三种细胞因子的mRNA表达水平均呈显著正相关.结论 双歧杆菌分泌型粘附素对LPS和H2O2诱导的肠上皮细胞NF-κB DNA结合活性有显著抑制作用,NF-κB的活化可能与TNF-α、IL-1β和IL-8等炎性细胞因子的表达调控有关.     

肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β对内皮细胞妊娠相关血浆蛋白A表达的影响

目的 观察肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β对内皮细胞妊娠相关血浆蛋白A表达的影响并探讨其机制.方法原代培养大鼠主动脉内皮细胞,选择生长良好的第3～4代细胞用于实验.实验分组:①空白对照组;②10、20、40、60及100μg/L肿瘤坏死因子α培养细胞24 h组;③1、5、10、20及50μg/L白细胞介素1β培养细胞24 h组;④60μg/L肿瘤坏死因子α培养细胞2、4、8、16、24及48 h组;⑤20μg/L白细胞介素1β培养细胞2、4、8、16、24及48 h组;⑥核因子κB抑制剂BAY11-7082干预组:预先用核因子κB抑制刺BAY11-7082(20 μmol/L)与内皮细胞共同孵育60 min后,再加入60 μg/L肿瘤坏死因子α或20μg/L白细胞介素1β作用48 h.实验结束后收集细胞及培养上清液,用乳酸脱氢酶试剂盒检测各组培养上清液中乳酸脱氢酶活性,用逆转录聚合酶链反应测定细胞中妊娠相关血浆蛋白A mRNA的表达,用酶联免疫吸附法检测上清液中妊娠相关血浆蛋白A蛋白水平.结果 不同浓度肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β作用24 h后,大鼠内皮细胞妊娠相关血浆蛋白A mRNA及上清液中妊娠相关血浆蛋白A蛋白表达水平随肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β浓度的增加而升高(P<0.05);60μg/L肿瘤坏死因子α和20μg/L白细胞介素1β作用于大鼠内皮细胞不同时间,妊娠相关血浆蛋白A表达水平显著高于空白对照组(P<0.05),且随刺激时间的延长,妊娠相关血浆蛋白A的表达逐渐升高;核因子κB抑制剂BAY11-7082作用后,妊娠相关血浆蛋白A表达水平明显降低(P<0.05).结论 肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β上调内皮细胞妊娠相关血浆蛋白A的表达,而核转录因子的活化是其对内皮细胞妊娠相关血浆蛋白A表达上调的主要机制.