异常白蛋白血症的分子研究进展

已命名的异常白蛋白血症目前已超过了100多种，大约存在60多个位点的氨基酸突变（定期更新的网址http：／／www．albumin．org／）。异常白蛋白的发生率大约为1：3000～1：10000，我院的调查结果发病率为1／6050。根据DNA突变发生在白蛋白整条链上的位置不同分3大类：（1）突变位点在前肽链或附近，使白蛋白原不能转变成白蛋白（白蛋白原氨基端的6个氨基酸残基突变后不被信号肽酶识别）；（2）DNA单点突变位点位于氨基酸残基313～382之间；（3）突变位点在多肽链C末端。     

在人血清白蛋白的次结构区ⅡB和ⅢA上的三个基因变异体的结构特征

在意大利,人们利用常规医学电泳测定方法发现了人血清白蛋白的3个新变异体。白蛋白Milano Slow变异体在北意大利比较普遍,而白蛋白Liprizzi和Trieste则是较少见和局部存在的变异体。对各种情况下获得的羧基化白蛋白的CNBr片段进行等电聚焦分析,结果证明突变位于CB5片段(氨基酸残基330～446)。以制备规模分离修饰的CNBr片段并用胰蛋白酶消化,分析异常的胰蛋白酶消化片段序列,结果显示,所有的变异均是由单个位点突变引起的。Trieste变异体为Lys359-Asn,MilanoSlow变异体为Asp375→His,Liprizzi变异体为Arg410→Cys。Trieste变异体上V8肽的序列分析及另外两个变异体的DNA序     

重组人血白蛋白的产业化实现方法

人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)是一个由585个氨基酸组成的单链多肽,分子量66.5kD.有3个结构域,整个分子盘旋成球型.单链分子内的半胱氨酸残基间有17对二硫键交叉连接,1个半胱氨酸位点(Cys34),1个色氨酸位点(Trp24).人血清白蛋白是人血浆中最丰富的蛋白成分,占血浆总蛋白的60%,每升成人血液中约有40g白蛋白,占血清总蛋白的(58±4)%.它主要由肝细胞合成,分泌进入血液循环系统.     

两个遗传性纤维蛋白原缺陷症家系表型与基因突变分析

目的对两个杂合突变导致遗传性纤维蛋白原缺陷症家系进行表型和基因突变分析, 并初步探讨其分子致病机制。方法采用凝固法检测两个先证者及其各自家系成员(3代9人和2代3人)凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原活性(Fg∶C), 免疫比浊法检测纤维蛋白原抗原(Fg∶Ag)。DNA直接测序法分析先证者FGA、FGB和FGG基因所有外显子和侧翼序列及家系成员相应的突变位点区域。通过凝血酶诱导进行纤维蛋白原聚集试验;用ClustalX-2、1-win软件分析突变位点的保守性;用Mutation Taster、PolyPhen-2、PROVEAN、SIFT和LRT在线生物信息学软件预测突变位点的致病性;用Swiss-pdb Viewer4.0.1分析突变前后蛋白质空间结构及分子作用力的变化。结果家系1先证者和家系2先证者Fg∶C明显下降(分别为1.28 g/L、0.98 g/L);家系1先证者Fg∶Ag正常(2.20 g/L), 家系2先证者Fg∶Ag降低(1.01 g/L)。基因分析发现, 家系1先证者的FGB基因第2号外显子存在c.293C>...     

Ⅰ型电压依赖型钠通道基因突变嵌合体的检测

目的:寻找鉴定Ⅰ型电压依赖型钠通道基因(SCN1A)突变嵌合体的有效方法,降低癫痫伴热性惊厥附加症的再发风险.方法:抽取携带已知突变c.5768A＞ G/p.Q1923R的患儿及无突变的患儿母亲的外周血全基因组DNA,将患儿的DNA与母亲的DNA以1∶0、1∶1、1∶3、1∶7、1∶15、1∶31及0∶1混合,对包含该突变位点的片段进行PCR扩增后,进行变性高效液相色谱(dHPLC)技术分析、常规测序及焦磷酸测序(pyrosequencing).结果:常规测序仅能检测出1∶0及1∶1混合样本的突变,而dHPLC及焦磷酸测序均能检测出低至1∶15混合样本的突变,且后者能对突变进行定量.结论:利用dHPLC结合焦磷酸测序的方法能有效快速地检测出低至3％左右的突变,可以避免绝大多数SCN1A基因嵌合突变的漏检.     

二尼曼匹克病家系NPC1和NPC2基因突变检测分析

目的:二C型尼曼匹克病患者家系,对其进行NPC1和NPC2基因测序分析基因型与表型关系.方法:采患者及家系外周血基因组DNA,根据人类基因组数据库NC_000018 (NPCl)及NG_007117 (NPC2)基因序列设计引物分别扩增25个外显子和5个外显子区域,产物经过回收纯化,采用直接测序进行突变检测,测序结果应用DNAman等软件进行序列分析,对于异常片段进行重新扩增测序,验证结果可靠性.结果:二例患者均在NPC1基因发现杂合子位点A644G (H215R),导致第215位氨基酸由His突变为Arg;18号外显子发现一个杂合位点N931N (C2793T),氨基酸编码没有改变,家系成员未发现上述基因位点突变.结论:二尼曼匹克患者具有典型尼曼匹克临床特征,在基因水平上也发现相关基因突变位点,但在遗传上与家系成员相关不大.因此对于尼曼匹克患者或存在其他致病因素.     

趋化因子与肿瘤

一、趋化因子简介趋化因子(chemok ines,CK)是一组由组织细胞和炎性细胞产生的具有多种生物学功能的小分子生物活性肽家族。相对分子质量为8 000~10 000(含70~100个氨基酸残基)。迄今发现的成员已逾60个。依其分子结构中氨基端半胱氨酸(cyste ine,C)残基排列顺序分4类:CXC族、CC族、C族、CX3C族。CXC族又根据是否含有谷氨酸-亮氨酸-精氨酸(ELR)基序分为2类:ELR-CXC趋化因子和非ELR-CXC趋化因子。研究表明,ELR-CXC趋化因子是有效的血管生长因子,如白细胞介素(IL)-8、生长相关性癌基因α(G roα)、生长相关性癌基因β(G roβ)…     

遗传性低纤维蛋白原血症家系复合杂合基因缺陷的研究

目的 对1个遗传性低纤维蛋白原血症家系进行临床表型诊断和基因分析,并探讨该病的分子发病机制.方法 采集该家系3代共7人外周血,检测活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、蕲蛇酶时间(RT)、抗凝血酶活性(AT∶A)、蛋白C活性(PC∶A)和蛋白S活性(PS∶A),纤维蛋白原(Fg)抗原和活性分别用免疫比浊法和Clauss法测定;采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对先证者及其父母的血浆纤维蛋白原进行半定量检测及肽链相对分子质量分析;使用自动校正凝血酶生成仪测定先证者的凝血酶生成;应用血栓弹力图仪检测血液凝固的动态过程和纤维蛋白形成过程的动力学变化.抽提先证者及家系成员外周血基因组DNA,采用PCR扩增Fg的3个基因(FGA、FGB和FGG)所有外显子及其侧翼序列,DNA直接测序进行基因分析.结果 先证者凝血功能检查显示Fg抗原为0.68 g/L,活性为0.48 g/L; TT延长为29.2 s,RT延长为75.8 s.SDS-PAGE结果显示,3条肽链相对分子质量正常,但含量明显减低;先证者凝血酶生成峰值为249.93 nmol/L,凝血酶生成潜力为1007.0 nmol·L-1·min;全血凝固的动态过程异常,凝血综合指数(CI)为-8.6,显示全血低凝状态.表型诊断为遗传性低纤维蛋白原血症.基因分析发现先证者纤维蛋白原Aa链存在g.3175A＞C突变导致的Gln143Pro突变,以及g·4642delC 突变导致的438位苏氨酸后编码26个异常氨基酸提前出现终止密码子;前者来源于母亲,后者来源于父亲.结论纤维蛋白原Aa链Gln143Pro和g.4642delC复合杂合突变是导致该家系先证者低纤维蛋白原血症的原因.     

不同基因型戊型肝炎病毒株宿主选择性差异的基因突变分析

目的初步探讨影响不同基因型戊型肝炎病毒(HEV)能否跨物种传播的核苷酸或氨基酸突变位点的特点。方法从DNA序列Gen Bank数据库获得87株HEV全基因组序列,根据宿主选择不同的特点将其分为H类和Z类,其中H类为基因1型和2型,Z类为基因3型和4型。通过ALIGNX软件对两类中全部HEV全基因组序列进行比对分析,寻找影响两类HEV病毒株间宿主选择或致病性差异的可疑核苷酸或氨基酸突变位点。结果本研究共发现26个可疑的核苷酸或氨基酸突变位点,可能参与决定不同基因型HEV宿主选择性差异;这些突变位点分布在ORF1区有16个,ORF2区有7个,ORF3区有1个,5'UTR和3'UTR区分别各有1个,特别是G11A/C(5'UTR区)、T511S(E2s蛋白决定簇区)及E78D(ORF3区)相对于其他突变子更为重要。结论 26个可疑特异性核苷酸或氨基酸突变位点的发现为研究不同基因型HEV宿主选择性和致病性差异提供了重要线索。     

HLA-A新等位基因A*01∶01∶51的DNA序列分析

目的 分析HLA-A*01∶01∶51新等位基因的序列.方法 应用SBT基因分型技术,通过位点特异性PCR扩增和组特异性PCR扩增,对扩增产物进行HLA-A基因的第2、3、4外显子双向测序,将测序结果与数据库进行比对,确认突变的位置.结果 组特异性引物扩增结果显示A位点有2个等位基因,其中1个为A*02∶07∶01,另1个为新等位基因.经BLAST分析,新等位基因与HLA-A* 01∶01∶01∶01序列仅在第4外显子上有1个碱基不同,即第762位C→T,254位氨基酸CTC→CTT,氨基酸没有改变,仍为亮氨酸.新等位基因序列已递交Genebank(JX629459).结论 该HLA-A新等位基因于2012年9月被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为A*01∶01∶51.     

亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌中oprD基因突变研究

目的 研究耐哑胺培南(IMP)铜绿假单胞菌(Pa)外膜孔蛋白oprD基因突变方式和突变意义.方法 对来自临床样本的34株耐IMP的Pa用PCR方法直接扩增oprD基因,扩增产物纯化后进行DNA双向序列分析,测得序列在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST中的BLASTn(序列号:X63152.1 Pseudomonas aeruginosa PA01)和BLASTx(序列号:NF249649.1 Pseudomonas aeruginosa PA01)进行DNA序列和氨基酸序列分析,并与标准菌株ATCC27853和2株临床分离IMP敏感Pa比较,分析突变类型和可能影响的oprD外膜蛋白功能域.结果 oprD基因突变率高达92.3%(12/13),突变方式多样(包括点突变、缺失突变、插入突变),导致外膜蛋白oprD L2、L3茎环结构上103、115、127、154、158、170、185、186、189位氨基酸改变和(或)移码突变.发现新的碱基变异位点(1 079、1114、1196、1206、1288、1300、1301 bp)和新的氨基酸突变位点(115、127、154、158、185、189位氨基酸).以上突变在标准菌株ATCC27853和2株临床IMP敏感的Pa中均未检测到.结论 oprD基因发生广泛有意突变,导致L2、L3茎环结构氨基酸改变和(或)移码突变,可能影响oprD与IMP结合,导致本组Pa对IMP耐药.     

萘啶酸耐药甲型副伤寒沙门菌gyrA基因突变的研究

目的研究绍兴地区萘啶酸耐药甲型副伤寒沙门菌gyrA基因突变情况。方法对52株甲型副伤寒沙门菌进行基因扩增,PCR产物纯化后进行双向测序,用OMIGA2.0软件对DNA回旋酶A亚单位序列进行分析比对,确定gyrA基因突变。结果萘啶酸耐药甲型副伤寒沙门菌在gyrAQRDR区域氨基酸残基83或87位点发生点突变;其中83位点发生突变51株,87位点发生突变1株;未发现两个位点同时突变菌株;gyrAQRDR区域其他部位未发现突变。结论gyrA基因83位点突变与甲型副伤寒沙门菌耐萘啶酸有直接关系,gyrA基因87位点单突变也可导致对萘啶酸耐药;绍兴地区近两年耐萘啶酸甲型副伤寒沙门菌菌株主要为83位点TCC→TTC(Ser→Phe)突变。     

两个遗传性低且异常纤维蛋白原缺陷症家系分析

目的对两个复合杂合突变导致低且异常纤维蛋白原(Fg)缺陷症家系进行表型和基因型分析, 并初步探讨其分子致病机制。方法调查两个先证者及家系成员(3代7人和3代10人)。采用凝固法检测凝血酶时间(TT)和Fg活性(Fg:C), 免疫比浊法检测Fg抗原(Fg:Ag)。DNA直接测序法分析先证者Fg的FGA、FGB和FGG基因所有外显子和侧翼序列及家系成员相应的突变位点区域。通过凝血酶诱导进行Fg聚集试验;用ClustalX-2, 1-win软件分析突变位点的保守性;PROVEAN和Mutation Taster在线生物信息学软件预测突变位点的致病性;用Pymol软件分析突变前后蛋白质空间结构及分子作用力的变化。结果先证者A和先证者B, Fg:C明显下降(分别为0.74和0.78 g/L), Fg:Ag同步降低(分别为0.96和0.94 g/L), 两个先证者TT均延长。基因测序分析显示, 先证者A和先证者B的FGA第6外显子均存在c.2185G>A(p.AαGlu710Lys)杂合错义突变;另外, 先证者A的FGG第7外显子存在c.701G>T(p.γTrp208Leu)杂合错义...     

杭州市2013~2014年流感暴发流行期甲型流感病毒H3N2亚型基因特性分析

目的分析杭州2013~2014年冬春季流感暴发期间流行的甲型流感病毒H3N2亚型的分子特性。方法选取H3N2阳性标本提取病毒RNA,PCR扩增全基因组并测序,构建血凝素(HA)及神经氨酸酶(NA)分子进化树,对H3N2亚型的病毒进化进行分析。结果 6个代表株中H3N2未发生片段间的重配。以WHO推荐流感疫苗株A/TEXAS/50/2012为参考,HA1蛋白主要抗原决定区发生N145S氨基酸替换,并有其他多个位点的突变。病毒基质蛋白(M2)的金刚烷胺耐药位点全为S31N,神经氨酸酶抑制剂耐药位点未发生突变。结论 H3N2亚型甲型流感病毒HA1蛋白的氨基酸变异与2013~2014年杭州地区暴发流行有关。另外,病毒已出现对金刚烷胺的耐药突变,而对神经氨酸酶未发生耐药突变。     

非经典的剪接位点(IVS1a+5g>a)及His348Gln双杂合突变导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症

目的　探讨遗传性凝血因子Ⅶ (FⅦ )缺陷症分子发病机制。方法　检测凝血指标以明确诊断 ;用DNA直接测序法对患者FⅦ基因的全部外显子和其侧翼以及 3′ ,5′非翻译区进行分析 ,寻找基因突变 ,对有突变的序列反向测序证实 ;发生在非经典的剪接位点突变用外周血单个核细胞异位转录的RT PCR方法确定其剪接方式。结果　患者在 8号外显子 10 96 1位发生T→G杂合突变 ,导致 348位His被Gln替代 ;在 1号内含子 5′端的非经典的剪接位点有Ggtgcg >Ggtgca(IVS1a 5g >a)杂合突变 ,RT PCR结果揭示剪接过程中去除了 2号外显子 ,却把 3号内含子包含进去 ,在 3号外显子起始处出现了移码突变 ,编码与原来氨基酸完全不同的 9个氨基酸后出现了终止信号 ,产生了一个只有 30个氨基酸组成的截短型蛋白。结论　患者FⅦ基因中发现了两种杂合突变 (10 96 1位T→G、IVS1a 5g >a) ,其中后一种非经典的剪接位点突变导致的异常剪接方式为国际首次报道。     

新的双重杂合性FⅤ基因突变导致的重型遗传性FⅤ缺陷症

目的　对一个遗传性凝血因子Ⅴ (FⅤ )缺陷症家系进行FⅤ基因突变的检测。方法　用活化部分凝血活酶时间(APTT),凝血酶原时间 (PT)及FⅤ促凝活性 (FⅤ∶C)和FⅤ抗原 (FⅤ∶Ag)测定进行表型诊断;用PCR法对先证者FⅤ基因 25个外显子及其侧翼序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变。突变位点经限制性内切酶分析证实。结果　先证者APTT249. 2s,PT46. 6s,TT17. 9s, Fg3. 42g/L, FⅤ∶C0. 1%,FⅤ∶Ag1. 5%, FⅡ∶C99%, FⅦ∶C110%、FⅧ∶C95%、FⅨ∶C88%、FⅩ∶C120%、vWF121%;FⅤ外显子区共发现 4个与基因文库Z99572序列不同的位点,其中位于exon13区的杂合性 2238 ~2239delAG导致移码突变和终止密码子的提前出现(Asp689stop), 位于exon23区的杂合性G6410T错义突变导致Gly2079Val。家系分析表明前者遗传于母亲,后者遗传于父亲。结论　2238~2239delAG导致的移码突变和G6410T导致的错义突变,是导致先证者FⅤ缺陷的原因。这是 2个导致遗传性FⅤ缺陷症的新的FⅤ基因突变位点。     

新等位基因HLA-B*56∶21的核苷酸序列分析

目的 确认HLA新等位基因HLA-B* 56∶21并分析其有异常反应格局的核苷酸序列.方法 标本DNA抽提采用美国Tiangen试剂盒,采用聚合酶链反应序列-特异寡核苷酸探针杂交技术(PCR-SSOP)进行HLA分型,发现1个与HLA -B*56相关的异常基因,使用DNA测序分型技术(PCR-SBT)直接测定其基因序列,并分析其与最接近的HLA-B* 56∶ 05∶02和HL4-B* 56∶07基因序列的差异.结果 新基因与所有已知的HLA-B等位基因序列均不相同,与HLA-B*56∶05∶02基因序列相比在第2外显子有6个碱基发生替代,导致5个氨基酸发生改变;与HLA-B*56∶07相比,在第2外显子序列仅有2个碱基被替代,第3外显子序列有6个碱基被替代,也导致5个氨基酸发生改变.结论 发现1个新的HLA-B等位基因,现已被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B* 56∶21,新等位基因HLA -B*56∶21与HLA-B* 56∶ 05∶02、HLA-B* 56∶07均有很高相似性.     

中国健康人血清游离表皮生长因子受体外显子18-22序列分析

目的 分析中国健康人血清游离DNA中表皮生长因子受体(EGFR)外显子18～22基因序列是否存在突变,为监测EGFR酪氨酸激酶选择性抑制荆(EGFR TKIs)的临床疗效提供正常参考数据.方法 采用高灵敏度DNA提取方法结合高保真巢式PCR和基因测序技术对42例中国健康人外周血血清游离DNA中EGFR TKIs作用靶点所在结构域即EGFR外显子18～22的基因序列和氨基酸序列进行分析.结果 从外周血血清游离DNA中均扩增出EGFR外显予18～22的基因片段,片段大小(分别为400,374,404,408争419 bp)与预期设计片段完全相符.健康人外周血游离DNA中存在EGFR基因突变,突变频率出现最多的是EGFR外显子20.41名健康人样本中有7例样本出现1处相同位点的沉默点突变(4838499 G→A),其氨基酸序列(Glu)没有发生改变;EGFR外显子18也出现点突变,34名健康人样本中有1名健康者样本出现3处点突变,其中2处点突变(4830989 G→C;4831025 G→C)导致氨基酸序列发生改变(Glu→Gln;Ala-Pro),另外1处点突变(4831000 A→C)为沉默突变,其氨基酸序列(Thr)没有发生变化;EGFR外显子19、外显子21～22没有出现基因突变.结论 通过巢式PCR结合基因测序可以分析外周血游离DNA中EGFR基因序列,健康人外周血游离EGFR外显子18和20存在基因点突变,其中外显子18的点突变导致了氨基酸序列改变.     

双白蛋白血症一例报告及其家系初步调查

双白蛋白血症是人血清在碱性缓冲液中电泳后存在有两个白蛋白成分,其中一个成分的电泳迁移率比正常白蛋白较快或较慢,并以此分为3种类型:1.持续慢速型,2.持续快速型,3.暂时快速型。前两种是遗传性异常双白蛋白血症,为常染色体显性遗传。本症在人群中较罕见。1986年9月我们发现1例持续慢速型双白蛋白血症,并作了家系调查,报告如下。     

X-连锁迟发性脊髓骨骺发育不良家系的基因诊断

目的 探讨一个X-连锁迟发性脊髓骨骺发育不良(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDL)家系发病的分子机制,建立基因诊断方法 .方法 采用身高测量、影像学检查殚及家系分析进行临床诊断.收集相关家系成员的外周血标本.提取基因组DNA后,采用PCR-SSCP和DNA测序分析家系中先证者、携带者和健康人SEDL基因的第3～6外显子.利用微卫星位点DXS16进行连锁分析.结果 PCR-SSCP检测到先证者第4外显子有异常泳动带;第4外显子的序列分析表明3例先证者均存在C.218C＞T突变,导致氨基酸序列S73L改变,3例携带者均存在该核苷酸位点的杂合突变,健康人未见突变;先证者的第3、5和6外显子核酸序列未见突变.序列分析证实家系中3名未婚女性Ⅲ10、Ⅳ6和Ⅳ7为致病基因携带者.结论 C.218C＞T突变是导致该家系发病的分子机制,可采用第4外显子序列分析对该家系进行基因诊断和产前基因诊断.