超声联合微泡造影剂携p53基因转染宫颈癌HeLa细胞的实验研究

目的 探讨超声联合微泡造影剂介导野生型p53(wtp53)基因转染宫颈癌HeLa细胞的可行性、效率性及作用效果.方法 以前期实验所筛选的超声辐照参数(300 kHz,0.5 W/cm~2,30 s)为实验条件,将HeLa细胞分为质粒组(A组)、质粒+超卢组(B组)、质粒+超声+微泡组(C组)、质粒+脂质体组(D组)、空白对照组(E组),分别进行处理.转染24～48 h后,收集各组细胞,荧光显微镜观察细胞基因转染效率、RT-PCR检测p53 mRNA表达,流式细胞仪检测细胞周期,M1Tr检测细胞增殖抑制情况.结果 荧光显微镜下见C、D组均有较多绿色荧光蛋白表达的细胞(转染率分别为14.15%和10.86%),B组仅有极少的荧光细胞(0.81%);A组和E组无荧光表达;RT-PCR结果 显示,C组和D组均可见特异性p53电泳条带,C组的电泳条带的光密度比值高于D组(P<0.05);流式细胞仪测细胞周期展示,转染野生型p53基因能使细胞周期出现明显的G_1期阻滞,C、D组与E组相比差异有显著性(P<0.05);MTT测定结果 显示c组细胞生长明显受抑,且随时间的延长,抑制程度逐渐增强.结论 适当浓度的微泡和优化的超声辐照条件可增强基因转染效率,野生型p53基阒能使HeLa细胞产生G_1期阻滞,抑制宫颈癌细胞生长.     

p53基因与5-FU联合作用诱导鼻咽癌细胞凋亡的研究

目的:研究通过转染野生型p53基因,并联合5-FU诱导人鼻咽癌CNE2细胞的凋亡作用.方法:将克隆有野生型p53基因的pUHD10-3-p53质粒.用脂质体(Lipofectamine)介导的方法转染人鼻咽癌CNE2细胞,同时在培养液中加入5-FU;以RT-PCR检测p53基因的表达,通过AO/EB染色和流式细胞术等方法进行细胞凋亡分析.结果:经转染wt-p53基因后,基因在细胞中的表达增加.在荧光显微镜下可观察到凋亡细胞增多.流式细胞仪检测结果示,经转染质粒pUHDl0-3-p53后,细胞的凋亡率为35.2%,单纯用5-FU组的细胞凋亡率为33.8%,而联合作用组的细胞凋亡率可达53.9%.结论:野生型p53基因与5-FU均可诱导人鼻咽癌细胞CNE2发生凋亡,野生型p53基因与5-FU联合作用,促进鼻咽癌细胞凋亡.     

靶向沉默p65基因对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖及凋亡的影响

目的利用miRNA靶向沉默p65基因,观察其对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖及凋亡的影响。方法以脂质体LipofectamineTM2000为载体,将针对特异靶点p65基因的miRNA转染入MDA-MB-231细胞。RT-PCR和Western blot法检测p65 mRNA和蛋白表达的变化;MTT法检测细胞增殖;流式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡;Western blot法检测凋亡相关因子表达的变化。结果 RT-PCR和Western blot检测结果显示,p65miRNA转染组p65 mRNA及蛋白表达量较对照组显著下降(P<0.05);MTT检测结果显示,沉默p65基因后,细胞出现了生长抑制现象;FCM检测结果发现,p65miRNA转染组细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。Western blot进一步检测发现,转染组细胞中caspase-3的前体蛋白条带变细,裂解片段条带加深;PARP蛋白出现裂解片段。结论 miRNA靶向沉默p65基因可抑制人乳腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,推测p65基因可能成为乳腺癌基因治疗的一个新靶点。     

抑癌PTEN基因联合p53基因转染对前列腺癌PC-3m细胞凋亡的影响

目的研究抑癌PTEN基因联合p53基因转染对前列腺癌PC-3m细胞凋亡的影响。方法构建表达载体：空质粒pEGFP—N1、pEGFP—N1-PTEN质粒、pEGFP—N1-p53质粒及pEGFP—N1-PTEN—p53质粒,体外分别转染到前列腺癌Pc-3m细胞中,观察它们转染后的荧光表达情况;采用RT—PCR法检测目的基因表达;Westernblotting法检测目的PTEN蛋白和P53蛋白的表达;用MTT法观察细胞增殖抑制情况并绘制生长抑制曲线;AnnexinV—FITC／PI双染流式细胞术检测PTEN基因和p53基因对前列腺癌PC-3m细胞凋亡的影响。结果荧光显微镜下观察到PTEN、p53及两个基因同时在PC-3m细胞系中成功表达;RT—PCR检测结果显示,与PTEN基因单转染组、p53基因单转染组和空载体转染组相比联合转染组mRNA在PC-3m细胞系中表达明显增加俨〈0．05）;Westernblotting法检测同样发现,联合转染组PTEN蛋白及P53蛋白表达明显高于PTEN基因单转染组、p53基因单转染组和空载体转染组俨〈0．05）;联合转染组细胞凋亡率明显高于空载体转染组、PTEN基因单转染组和p53基因单转染组（P〈0．05）。结论PTEN基因与p53基因联合转染能诱导前列腺癌PC-3m细胞凋亡．这种联合转染可能对前列腺癌的基因治疗具有潜在的应用价值。     

乙型肝炎病毒X基因对正常肝细胞HL7702凋亡影响的初步探讨

目的 研究乙型肝炎病毒X基因(HBX基因)对HL7702肝细胞凋亡及凋亡相关因子表达的影响.方法 用脂质体转染法将HBx真核表达载体pcDNA3.1( )-X瞬时转入HL7702细胞,以转染空质粒pcDNA3.1( )的细胞及未转染的HL7702细胞为对照.转染后72 h收集细胞标本,作以下处理:RT-PCR法检测HBX mRNA的表达,免疫荧光鉴定HBx蛋白的表达;流式细胞术检测细胞凋亡率;以β-actin为内参,半定量RT-PCR法检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2 mRNA的表达量变化.结果 转染72h后,转染pcDNA3.1( )-X真核表达载体的HL7702细胞经RT-PCR扩增出HBX片段,免疫荧光结果 显示细胞内出现HBx蛋白的较强荧光;而转染空质粒组及未转染对照组经RT-PCR法及免疫荧光检测均显示无HBx表达.通过流式细胞术和半定量RT-PCR法检测细胞凋亡情况,结果 显示:转染HBX的细胞凋亡率(3.38%±0.67%)相对于转染空质粒组(1.25%±0.30%)及未转染质粒组(1.40%±0.37%)凋亡率增高, 差异均有显著性意义(P<0.05);转染HBx的细胞Bax mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高,差异均有显著性意义(P<0.05),Bcl-2 mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显降低,差异均有显著性意义(P<0.05).转染空质粒组和未转染质粒组之间,对细胞凋亡率、Bax mRNA、Bcl-2 mRNA进行比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论成功将HBX转染入HL7702细胞,并在细胞中表达;转染后72 h HBx可上调Bax表达,而下调Bcl-2表达,表明HBx能促进HL7702细胞凋亡.     

外源性PUMA对非小细胞肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨外源性p53上调凋亡调制因子(PUMA)对非小细胞肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响。方法将肺癌A549细胞分为Control组、空载体组、PUMA组(转染pCEP4-(HA)2-PUMA质粒),DDP组(10μg·mL-1)和PUMA+DDP组(转染pCEP4-(HA)2-PUMA质粒,加10μg·mL-1顺铂)5个组。细胞生存率和凋亡率分别用MTT法和流式细胞仪检测,细胞PUMA、Bax及Bcl-2蛋白表达水平采用Western blot方法检测。结果与Control组比较:PUMA组、DDP组及PUMA+DDP组A549细胞增殖均显著降低(P<0.01),且PUMA+DDP组降低程度最强(P<0.01);凋亡率均显著升高(P<0.01);Bax蛋白水平呈显著性升高(P<0.01),Bcl-2蛋白呈显著性下降(P<0.01)。结论外源性PUMA可抑制肺癌A549细胞增殖,促进凋亡,其机制与增加细胞Bax蛋白表达,降低Bcl-2蛋白表达有关。 更多还原     

重组质粒pEGFP-N2/XPD和Pifithrin-α对肝癌细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨人着色性干皮病基因D(xeroderma pigmentosum D,XPD)和P53对肝癌细胞HepG2.2.15增殖凋亡及P21等基因表达的影响.方法 用脂质体转染法将空载质粒pEGFP-N2和重组质粒pEGFP-N2/XPD转染HepG2.2.15,然后给予20 μmol/L的Pifithrin-α(P53抑制剂)孵育24 h.实验分为5组:空白对照组、pEGFP-N2组、pEGFP-N2/XPD组、pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组和Pifithrin-α组.用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况;用RT-PCR和Western blot检测XPD、P53、磷酸化P53(phosphorylated P53,p-P53)、P21和乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)的表达;用MTT法检测细胞活力;用流式细胞仪检测凋亡率.结果 在荧光显微镜下,可在转染了空载质粒pEGFP-N2和重组质粒pEGFP-N2/XPD的细胞中观察到绿色荧光,即转染成功;RT-PCR和Western blot检测发现,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染使XPD表达增高(P＜0.001);XPD表达升高使P53、p-P53(ser-15)、P21表达增高,同时使得HBx表达降低,而Pifithrin-α能抑制XPD这一作用(P＜0.001).MTT结果显示,XPD表达升高抑制了细胞活力,而Pifithrin-α能抑制XPD减弱细胞活力的作用(P＜0.001).流式细胞仪结果显示,XPD表达增高引起了细胞凋亡率增加,而Pifithrin-α能抑制XPD诱导细胞凋亡的作用(P＜0.001).结论 XPD能通过P53通路抑制肝癌细胞增殖并促进其凋亡,上调P21的表达以及下调HBx的表达.     

WT1反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡的实验研究

[目的]研究WT1反义寡核苷酸转染对卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响。[方法]实验分4组:正常对照组(加入转染液)、反义组(脂质体+反义寡合苷酸转染)、正义组(脂质体+正义寡合苷酸转染)和脂质体组(只加入脂质体)。分组转染卵巢癌SKOV3细胞株后,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,MTT法检测细胞的增殖活性,RT-PCR检测WT1 mRNA表达水平,Western blot检测其蛋白表达水平。[结果]脂质体介导的WT1反义寡核苷酸转染明显抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,抑制率为49.48%,G0-G1期细胞分布率增加达(79.10±2.79)%,凋亡细胞群明显增多,凋亡率为(13.18±2.00)%,同时转染后细胞WT1 mRNA及蛋白表达水平下降,与对照组及其他各组相比较差异均有显著性意义(P<0.05)。[结论]WT1反义核酸能抑制卵巢癌细胞增殖,诱导细胞凋亡。WT1反义核酸用于卵巢癌的基因治疗具有一定的潜在意义。     

联合应用Survivin和VEGF反义寡核苷酸对肺癌A549细胞的抑制作用

目的研究非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)A549细胞经Survivin和VEGF反义寡核苷酸(ASODN)单独和联合转染后细胞生长、凋亡以及对基因表达的抑制作用。方法针对Survivin和VEGF mRNA序列设计反义寡核苷酸,以脂质体(Lip)为载体,介导Survivin和VEGF ASODN单独和联合转染A549细胞。MTT法检测细胞生长抑制率,RT-PCR检测细胞中Survivin和VEGF基因的mRNA含量,流式细胞术检测细胞凋亡以及细胞中Survivin基因的蛋白表达。结果经脂质体转染后200~600 nmol/L Survivin ASODN和5~20μmol/L VEGF ASODN均能抑制A549细胞增殖,诱导细胞凋亡;在48 h时,400 nmol/L Survivin ASODN和10μmol/L VEGF ASODN抑制率和凋亡率有统计学意义(P<0.05);两者联合转染A549细胞抑制率和凋亡率分别为(61.37±1.94)%和57.03%,显著高于两基因单独转染(P<0.05);联合组的Survivin mRNA的表达量为(15.26±1.31)%,蛋白表达率为(30.40±1.33)%,VEGF mRNA的表达量为(13.12±1.45)%,均显著低于单独转染组(P<0.05)。结论 Survivin和VEGF ASODN均能抑制A549细胞基因表达,诱导细胞凋亡,两基因反义寡核苷酸联合转染的效果优于单独转染。     

MTA1靶向RNA干扰对人肝癌HepG2细胞生物学行为影响的研究

目的 观察转移相关基因1(MTA1)特异性siRNA对肝癌细胞株HepG2细胞生物学行为的影响.方法 体外构建2个MTA1特异性siRNA表达载体(pRNAi-1、pRNAi-2),实验分为脂质体对照、空质粒转染对照及MTA1 siRNA重组质粒转染组,转染肝癌细胞株HepG2细胞,定量RT-PCR检测MTA1 mRNA表达情况,检验其对细胞的RNA干扰效果;采用MTT法分析其对细胞增殖的影响,流式细胞仪检测其对细胞周期的影响.结果 测序表明MTA1干扰序列完全正确;pRNAi-1与pRNAi-2表达质粒有效抑制肝癌细胞株HepG2细胞中MTA1的表达,MTT 法检测结果显示转染重组质粒组细胞体外生长的抑制率高于脂质体对照组和空质粒对照组(P<0.01);流式细胞术检测的转染重组质粒组细胞凋亡率高于脂质体对照组和空质粒对照组(P<0.01).结论 成功构建了MTA1干扰真核表达载体,重组MTA1特异性siRNA质粒可抑制肝癌细胞中MTA1的表达,并抑制肝癌细胞生长,促进其凋亡.     

靶向survivin的siRNA联合顺铂抑制肺腺癌A549细胞增殖的实验研究

目的:研究靶向survivin的siRNA和顺铂联用对肺癌细胞A549的增殖抑制作用.方法:将A549细胞分为空白对照组,阴性对照质粒pSilencer2.0-Nc转染组,顺铂处理组,pSileneer2.0-SVV2转染组,pSilencer2.0-SVV2转染+顺铂处理组.转染采用脂质体法.MTT法检测靶向survivin的siRNA和顺铂对A549细胞增殖的抑制作用;RT-PCR法检测A549细胞survivinmRNA转录水平变化情况;流式细胞术和TUNEL.法检测A549细胞凋亡情况.结果:MTT法示:pSilencer2.0-SVV2转染+顺铂处理组增殖抑制率为51.38%±1.35%,与其它各组相比抑制率明显增高,具有统计学意义(P<0.05);RT-PCR检测显示空白对照组,阴性对照质粒pSilencer2.0-NC转染组,顺铂处理组survivinmRNA表达无明显变化(P>0.05).pSilencer2.0-SVV2转染组、pSilencer2.0-SVV2转染+顺铂处理组survivin mRNA表达明显下降(P<0.05);流式细胞术和TUNEL法检测pSilencer2.0-SVV2转染+顺铂处理组凋亡率分别为42.48%±2.28%和40.65%4±3.53%,与其它各组相比凋亡率明显增高,具有统计学意义(P<0.05).结论:将靶向survivin的siRNA和顺铂联合应用可以协同抑制A549细胞增殖,共同发挥诱导细胞凋亡作用.     

核仁素表达下调对顺铂诱导人骨肉瘤细胞株SaOS-2增殖抑制和凋亡的影响

目的:观察核仁素(C23)表达下调对顺铂(DDP)诱导人骨肉瘤细胞株SaOS-2增殖抑制和凋亡的影响。方法:将细胞随机分为5组:对照组、DDP组、S+DDP组(转染C23正义寡核苷酸后再用DDP)、AS+DDP(转染C23反义寡核苷酸后再用DDP)与R+DDP(转染随机寡核苷酸后再用DDP);用MTT法检测各组细胞增殖率;用Western印迹和RT-PCR检测各组C23,Bcl-2和Bax蛋白与mRNA的表达;用DAPI染色方法和流式细胞术检测各组细胞凋亡核百分率、细胞凋亡率。结果:C23反义寡核苷酸显著抑制了C23蛋白和mRNA的表达,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);AS+DDP组与DDP组比较,细胞增殖率下降约18%(P<0.01),C23与Bcl-2蛋白和mRNA表达均降低(P<0.01),但Bax表达增高(P<0.01);细胞凋亡核百分率与细胞凋亡率均增高(P<0.01)。结论:C23表达下调能促进DDP诱导的SaOS-2细胞增殖抑制和凋亡。     

脂质体介导的p53基因转染对鼻咽癌细胞作用的研究

目的 通过转染野生型p53基因,观察其对鼻咽癌细胞CNE2生长的影响.方法 将克隆有野生型p53基因的pUHD10-3-p53质粒,用脂质体(lipofectamine)介导的方法转染人鼻咽癌CNE2细胞,以RT-PCR检测p53基因的表达,通过细胞生长曲线、AO/EB染色和流式细胞术等方法对转染细胞的生物学行为进行检测.结果 人鼻咽癌CNE2细胞转染p53基因后,基因在细胞中表达增加,细胞的生长受到抑制,在荧光显微镜下观察到凋亡细胞增多,流式细胞技术显示细胞凋亡率增高.结论 采用脂质体转染野生型p53基因的方法,可抑制人鼻咽癌CNE2细胞的生长,诱导鼻咽癌细胞凋亡.     

造血干细胞来源的树突状细胞负载p53基因诱导对HMCC97肝癌细胞特异性杀伤

目的:以p53基因转染CD34+造血干细胞采集物来源的树突状细胞(dendritic cell,DC),诱导DC产生特异性抗肝癌免疫,观察其对表达P53抗原肝癌细胞的杀伤效果.方法:采用化疗和集落刺激因子联合动员肝癌患者外周血造血干细胞,血细胞分离机采集CD34+造血干细胞,白细胞介素(interleukin-4,IL-4)、粒-巨细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating-factor,GM-CSF)联合肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor αTNF-α)刺激CD34+细胞分化为DC.通过脂质体转染的方法将携带人p53基因的质粒pEGFP-C3/p53转染培养7 d的DC,MTT法检测对不同人肝癌细胞HMCC97和HepG2的特异性杀伤效果.结果:经细胞冈子刺激诱导培养的DC具有典型的分枝状突起,高表达CD1a、CD11c、CD80、CD86和HLA-DR分子.转染p53基因后可见到转染DC细胞表达绿色荧光蛋白,免疫荧光染色可见转染p53基因的DC发出红色荧光,而未转染DC无荧光表达.MTT法检测结果表明,p53基因转染后的DC可诱发特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,杀伤表达P53抗原的HMCC97细胞,p53基因转染组、空载体组和未转染DC组的杀伤率分别为(49.3±4.6)%、(25.4±4.1)%和(24.8±3.8)%,转染组与空载体组和未转染DC组间存在统计学差异(P<0.05).而对于不表达P53抗原的HepG2细胞,转染P53的DC诱导的CTL反应未能产生明显的杀伤作用,p53基因转染组、空载体组和未转染DC组的杀伤率分别为(30.8±4.6)%、(27.3±4.3)%和(28.5±5.1)%,3组间差异无统计学意义(P0.05).结论:p53基因转染CD34+造血干细胞来源的DC可诱导特异性CTL反应杀伤表达P53抗原的肝癌细胞,提示P53可能成为DC细胞免疫治疗的潜在靶点.     

Bcl-2基因转染对体外培养大鼠大脑皮层神经细胞氧糖剥夺损伤的保护作用

目的研究bcl-2基因转染对体外培养大鼠大脑皮层神经细胞氧糖剥夺损伤的保护作用,为基因转染治疗脑血管病寻找实验依据。方法体外培养新生大鼠大脑皮层神经细胞,应用脂质体转染法将bcl-2基因转染入神经细胞,建立氧糖剥夺模型,实验分为正常对照组、氧糖剥夺组和bcl-2转染组(转染bcl-2基因24h后,进行氧糖剥夺),采用Western blot法、MTT法、流式细胞仪分别检测各组细胞的bcl-2蛋白表达、细胞活力及凋亡率。结果 SD大鼠大脑皮层神经细胞可纯化体外培养,纯度达到90%以上。成功建立了大鼠神经细胞体外氧糖剥夺模型,成功进行了质粒pc-DNA3.1-hbcl-2的转化、扩增及基因转染。对照组神经细胞bcl-2少量表达,氧糖剥夺组bcl-2蛋白微弱表达,转染组细胞bcl-2蛋白高表达,各组间差异均有统计学意义(均P<0.01)。MTT法检测结果显示,对照组细胞的吸光度值(A)为(0.851±0.034);氧糖剥夺组的A值为(0.648±0.030),与对照组相比明显降低(P<0.01);转染组的A值为(0.787±0.004),低于对照组(P<0.05),但明显高于氧糖剥夺组(P<0.05)。对照组神经细胞凋亡率为4.6%;氧糖剥夺损伤后细胞凋亡率明显增加,为19.6%;转染组细胞凋亡率与氧糖剥夺组相比有明显下降,为9.6%,差异有统计学意义(均P<0.01)。结论脂质体介导的bcl-2基因转染对氧糖剥夺损伤的大鼠大脑皮层神经细胞有明显保护作用。     

可溶性人TRAIL诱导胃癌细胞BGC-823凋亡的研究

目的 通过构建pBud-EGFP-TRAIL质粒体外观察可溶性人TRAIL蛋白(sTRAIL)对胃癌细胞BGC-823的作用.方法 以EFGP基因为报告基因,sTRAIL为目的基因,构建pBud-EGFP-TRAIL双表达质粒,鉴定酶切和测序重组体.经脂质体转染法转染体外培养的胃癌细胞BGC-823,用荧光显微镜观察EGFP的表达,RT-PCR及Western blot进一步检测sTRAIL mRNA及其蛋白的表达,MTT法检测转染后对胃癌细胞的生长抑制率,TUNEL法观察细胞的凋亡情况,流式细胞仪分析转染后胃癌细胞的凋亡率.结果 测序结果证实pBud-EGFP-TRAIL载体构建成功,质粒经脂质体转染后,通过表达sTRAIL蛋白对胃癌细胞发挥作用.MTT法显示转染该质粒的细胞的生长抑制率明显高于对照组,TUNEL法显示细胞核固缩,核染色质聚集或断裂,形成凋亡小体.流式细胞仪结果表明转染该质粒的细胞的的凋亡率明显高于对照组.结论 在体外初步证实TRAIL能诱导胃癌细胞BGC-823凋亡.     

Survivin siRNA对人脐静脉内皮细胞的survivin基因及蛋白表达与凋亡的作用

[摘要] 目的 探讨Survivin siRNA对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的Survivin基因与蛋白表达与凋亡的影响。方法 合成Survivin siRNA转染混合物,以不同浓度转染HUVEC细胞, MTT法测定细胞生长抑制率, RT-PCR、Western blot检测HUVEC细胞Survivin mRNA及蛋白的表达变化,流式细胞术检测细胞的凋亡率。结果 HUVEC细胞转染荧光标记的FAM-siRNA后,细胞内有绿色荧光表达。分别以10,30,50nmol/L Survivin siRNA转染细胞后,细胞生长抑制率、Survivin mRNA表达、Survivin蛋白表达与对空白照组、阴性对照组、脂质体对照组比较差异有统计学意义(P<0.001)。细胞凋亡率与对照组比较明显下降(P<0.01)。随着Survivin siRNA浓度的增加,细胞抑制率与细胞凋亡率呈上升趋势,Survivin mRNA及Survivin 蛋白的表达呈逐渐降低趋势。结论 Survivin siRNA能抑制HUVEC的Survivin基因表达与并促进其凋亡。     

RNA干扰survivin基因表达对肝癌细胞放射敏感性影响

目的探讨RNA干扰survivin基因表达对肝癌细胞放射敏感性的影响。方法构建针对人肝癌HepG2细胞survivin基因靶序列的shRNA真核表达载体pshRNA-survivin-387。设置空白对照组(不加载体)、阴性对照组(加入pshRNA-survivin-NC)及siRNA转染组(加入pshRNA-survivin-387),用脂质体2000转染HepG2细胞,采用逆转录聚合酶链反应技术检测各组survivin基因mRNA表达水平。分别设置空白对照组、阴性对照组、siRNA转染组、X线照射组、siRNA转染+X线照射组,收集各组细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率,MTT法测定细胞存活分数。结果 siRNA转染组survivin基因mRNA表达水平明显低于空白对照组及阴性对照组,差异有显著性(F=218.93,q=17.73、18.66,P<0.05)。siRNA转染+X线照射组细胞凋亡率明显高于其他各组,差异有显著性(F=1 421.83,q=13.81～57.48,P<0.05);siRNA转染组及X线照射组与空白组、阴性组比较,细胞凋亡率也明显提高(q=17.55～39.10,P<0.05)。siRNA转染+X线照射组细胞存活分数显著低于其他各组(F=2870.58,q=15.32～72.51,P<0.05);siRNA转染组及单纯X线照射组细胞存活分数与空白对照组、阴性对照组比较也明显降低(q=11.14～73.90,P<0.05)。结论 pshRNA-survivin-387转染能抑制survivin基因表达,诱导肝癌细胞凋亡,增强肝癌细胞的放射敏感性。     

RNA干扰突变型p53基因对胃癌SGC7901细胞生物学行为的影响

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术稳定沉默人胃癌SGC7901细胞中的突变型p53基因,观察其对细胞生物学行为的影响。方法:p53小干扰RNA(siRNA)重组质粒用脂质体介导法转染SGC7901细胞,另设未转染组和对照组。RT-PCR和Western blot分别检测p53基因mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖情况及其对奥沙利铂药物敏感性的变化,流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡,平板克隆形成试验、裸鼠移植瘤成瘤实验分析细胞成瘤性变化。结果:p53 siRNA可显著下调SGC7901细胞中突变型p53基因mRNA和蛋白的表达,实验组较未转染组和对照组细胞生长曲线左移。实验组的G0/G1期细胞数较对照组和未转染组分别减少7.4%和6.7%,进入S期的细胞数增加17.2%,奥沙利铂诱导的细胞凋亡率明显降低,未转染组、对照组和实验组细胞的IC50分别为15.88μmol/L、14.32μmol/L和20.34μmol/L。与未转染组和对照组相比,实验组细胞平板克隆形成数量显著增多,裸鼠体内细胞成瘤性增加。结论:p53 siRNA可有效抑制突变型p53基因在胃癌SGC7901细胞中的表达,但利用RNA干扰技术靶向突变型p53基因在胃癌的治疗上尚存在不确定性。     

靶向Survivin基因microRNA诱导肝癌细胞凋亡的实验

目的:探讨靶向Survivin的microRNA转染肝癌细胞阻抑Survivin表达,及其对肝癌细胞凋亡、增殖的影响。方法:设计合成特异性靶向Survivin的microRNA的序列。肝癌细胞株HepG2接种于细胞培养板内,分为5组,空白对照组、脂质体组和低、中、高浓度转染组(分别给予50、100和200 nmol/L microRNA转染);作用后收集各组细胞。四氮唑盐(MTT)法检测不同浓度的microRNA对细胞的生长抑制率。流式细胞术检测各组细胞增殖率和凋亡指数。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测靶向Survivin的mRNA表达水平。结果:通过MTT检测,不同浓度microRNA转染组细胞的抑制率明显高于对照组(P<0.05)。各浓度mi-croRNA转染组细胞凋亡指数明显高于对照组(P<0.05),高浓度转染率最明显(P<0.05)。各浓度microRNA转染组细胞增殖指数明显低于对照组(P<0.05),高浓度转染组最明显(P<0.05)。各浓度microRNA转染组细胞Sur-vivin的mRNA转录水平有不同程度减弱。结论:不同浓度Survivin的microRNA转录能下调Survivin的mRNA表达,诱导肝癌细胞凋亡,抑制细胞增殖。