siRNA沉默Annexin Ⅱ基因对人乳腺癌细胞MDA-MB-435S的影响

目的 探讨RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默AnnexinⅡ基因表达对人乳腺癌细胞MDA-MB-435S生物学特性的影响. 方法 体外化学合成Annexin Ⅱ序列特异性双链小干扰RNA(siRNA),脂质体介导转染人乳腺痛细胞株MDA-MB-435S,采用荧光显微镜观察转染效率.收集siRNA下扰的细胞,RT-PCR、蛋白印迹和免疫细胞化学法分别检测Annexin Ⅱ mRNA和蛋白的抑制水平,并采用MTT法、流式细胞术测定细胞增殖能力和细胞周期的变化,Millicell小室测定细胞侵袭、迁移能力的变化.结果 Annexin Ⅱ-siRNA能有效抑制Annexin Ⅱ mRNA和蛋白的表达(P<0.05);经siRNA干扰后的细胞,细胞增殖能力显著减低(P<0.05);G0/G1期细胞明显增加,S期细胞明显减少(P<0.05);细胞侵袭、迁移能力明显降低(P<0.05). 结论 采用siRNA干扰Annexin Ⅱ mRNA和蛋白表达后,能有效逆转乳腺癌细胞的某些恶性生物学特点,表明AnnexinⅡ与乳腺癌的发生、发展及转移有一定的关系.     

小干扰RNA抑制c-Myc表达对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响

目的应用小干扰RNA（siRNA）干扰乳腺癌MCF-7细胞的c-Myc表达，了解c-Myc对肿瘤细胞增殖和凋亡的作用。方法将c-Mye siRNA，经IApofectamineTM2000脂质体转染MCF-7细胞后，实时定量RT-PCR和Western Blotting法检测细胞cMyc mRNA和蛋白的表达，MTT法和流式细胞仪检测干扰后细胞的增殖和凋亡水平。结果转染后MCF-7细胞的c-Myc的mRNA与蛋白表达明显减弱，增殖能力显著降低。洲亡率明显提高。结论运用RNAi技术，可以有效地干扰MCF-7细胞c—Myc的表达，抑制细胞增殖，并诱导细胞渊亡。     

siRNA干扰对乳腺癌（MCF-7）ATX表达和侵袭力的影响

目的:研究针对自分泌运动因子(Autotaxin,ATX)的小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)对人乳腺癌细胞ATX基因表达的影响,探讨RNA干扰技术治疗乳腺癌的前景.方法:参考人黑色素瘤ENPP2基因序列,设计合成ATX-siRNA及随机阴性对照.在阳离子脂质体的介导下转染人乳腺癌细胞MCF-7,转染后48 h收集细胞,用半定量RT-PCR和western blot检测转染后ATX mRNA和ATX蛋白的表达,体外实验测定肿瘤细胞穿透matrigel的能力.结果:体外合成的siRNA在转染乳腺癌细胞48 h后ATX mRNA和蛋白表达降低,转染48 h后测定乳腺癌MCF-7细胞的侵袭力明显降低(P＜0.01).结论:ATX-siRNA能有效抑制人乳腺癌细胞株ATX基因和蛋白的表达,降低人乳腺癌细胞的侵袭力.     

S 腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因沉默抑制乳腺癌MCF7细胞生长的研究

目的探讨S 腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）基因沉默对乳腺癌MCF 7细胞增殖及侵袭能力的抑制作用。方法用特异性沉默SAMDC基因表达的RNA干扰真核表达载体SAMDC shRNA表达载体(pGPU6 SAMDC)转染乳腺癌MCF 7细胞,采用RT PCR和Western blot技术分别检测SAMDC mRNA和蛋白质表达水平;细胞增殖实验（CCK 8法）和细胞周期分析评价SAMDC基因沉默对乳腺癌MCF 7细胞增殖的影响,肿瘤侵袭实验观察SAMDC基因沉默对乳腺癌细胞MCF 7侵袭活性的影响。结果SAMDC shRNA表达载体转染后,MCF 7细胞SAMDC mRNA水平下调43.8％,蛋白表达水平下降66.5％;MCF 7细胞的增殖活性和侵袭能力均受到明显抑制,细胞增殖活性下降37%,细胞周期分析G1期细胞增加。结论SAMDC基因沉默可通过延长细胞周期的G1期而抑制乳腺癌MCF7细胞的增殖,并能降低癌细胞侵袭活性,提示SAMDC可作为乳腺癌基因治疗的靶分子。     

siRNA抑制Ki-67表达对乳腺癌MCF-7／ADR细胞阿霉素耐药性的研究

目的采用Ki-67RNA表达载体干扰沉默Ki-67基因,检测其对乳腺癌MCF-7／ADR细胞株耐-67mRNA及蛋白表达的影响,观察沉默艇-67基因前后乳腺癌细胞株对阿霉素敏感性改变。方法体外合成靶向艇-67siRNA表达载体,应用脂质体法瞬时转染尉-67高表达的乳腺癌细胞株MCF-7／ADR,应用RT-PCR和Western印迹法检测转染后Ki-67mRNA及蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖活性及转染前后细胞对阿霉素敏感性的变化。结果Ki-67siRNA载体转染后24h可显著抑制乳腺癌MCF-7／ADR细胞株的Ki-67mRNA和蛋白表达及细胞的增殖活性。Ki-67siRNA组阿霉素IC50值为（6．3±0．9）μg/ml。结论si—Ki-67能够有效抑制Ki-67基因的表达,降低乳腺癌细胞的增殖能力,沉默Ki-67表达能部分逆转阿霉素耐药现象。     

siRNA抑制Ki-67表达对乳腺癌MCF-7/ADR细胞阿霉素耐药性的研究

目的采用Ki-67 RNA表达载体干扰沉默Ki-67基因,检测其对乳腺癌MCF-7/ADR细胞株Ki-67 mRNA及蛋白表达的影响,观察沉默Ki-67基因前后乳腺癌细胞株对阿霉素敏感性改变。方法体外合成靶向Ki-67siRNA表达载体,应用脂质体法瞬时转染Ki-67高表达的乳腺癌细胞株MCF-7/ADR,应用RT-PCR和Western印迹法检测转染后Ki-67mRNA及蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖活性及转染前后细胞对阿霉素敏感性的变化。结果 Ki-67siRNA载体转染24h后可显著抑制乳腺癌MCF-7/ADR细胞株的Ki-67 mRNA、蛋白表达及增殖活性。Ki-67 siRNA组阿霉素IC₅₀值为（6.3±0.9）μg/ml。结论 Si-Ki-67能够有效抑制Ki-67基因的表达,降低乳腺癌细胞的增殖能力。沉默Ki-67表达能部分逆转阿霉素耐药现象。     

利用RNA干扰技术下调Lon基因表达的生物学效应研究

目的:通过构建Lon基因下调的哺乳动物细胞模型表达,观察Lon基因对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响,以探讨Lon蛋白的功能.方法:设计针对Lon蛋白酶的小干扰RNA(siRNA),构建pSilencer U6 2.1-Lon真核表达载体,用脂质体法转染人乳腺癌细胞MCF7,RT-PCR检测Lon基因下调的水平,通过采用高温、紫外线照射、顺铂处理,观察Lon基因下调后细胞敏感性的变化(MTT法).结果:RT-PCR显示重组质粒pSilencer U6 2.1-Lon转染MCF7细胞,Lon基因明显下调,RT-PCR未见扩增目的带,细胞培养结果显示,细胞增殖能力明显减弱.紫外线照射和顺铂处理后的MTT结果显示,pSilencer U6 2.1-Lon转染的MCF7细胞,增殖能力明显下降,与空载体转染组(pSilencer U6 2.1)和未转染组相比有显著性差异(P＜0.05).加热应激试验显示,37,41,43℃处理后,RNA干扰转染组(pSilencer U6 2.1-Lon)与空载体转染组、未转染组相比有显著性差异(P＜0.05).而在45℃时,RNA干扰转染组、空载体转染组与未转染组之间均无显著性差异(P＞0.05).结论:RNAi能有效下调Lon蛋白的表达.Lon基因的下调可抑制乳腺癌细胞MCF7的增殖能力,诱导细胞凋亡,以及可增加MCF7对紫外线和顺铂处理的敏感性.     

RNA干扰Aurora-A基因对前列腺癌细胞株PC-3影响的研究

目的采用RNA干扰技术特异性阻断前列腺癌细胞PC-3中Aurora-A的表达,观察其对肿瘤细胞生长的抑制作用。方法采用免疫组化方法检测Aurora-A在前列腺癌细胞中的表达。体外化学合成特异针对Aurora-A基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),以脂质体转染前列腺癌细胞系PC-3,荧光显微镜及流式细胞仪确定最佳转染效率。MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率。RT-PCR和Western-blot检测Aurora-A mRNA和蛋白的表达。结果 Aurora-A蛋白主要表达于PC-3细胞胞浆中;脂质体的最佳转染效率高于90%;siR-NA1组24h、48h、72h细胞增殖抑制率分别为(0.377±0.035)%、(0.597±0.065)%、(0.749±0.061)%,与各组比较均有显著性差异;siRNA1组细胞凋亡率为(50.593±1.208)%,与各组比较均有显著性差异;RT-PCR检测siRNA1组Aurora-A mRNA相对值为(1.354±0.087),与各组比较均有显著性差异;Western-blot检测显示siRNA 1组蛋白表达量明显低于对照组。结论应用RNAi技术靶向沉默Aurora-A基因可以下调Aurora-A mRNA及蛋白的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

特异性siRNA沉默TDGF-1基因表达对乳腺癌细胞迁移侵袭的影响

目的 探讨RNA干扰（RNA interference,RNAi）沉默TDGF-1基因表达对乳腺癌细胞侵袭的影响.方法 根据TDGF-1基因序列特点设计3个小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）后,转染人乳腺癌MDA-MB-468细胞,用荧光实时定量RT-PCR筛选出效果最好的siRNA.以该siRNA转染处理乳腺癌MDA-MB-468细胞后,分别采用实时定量RT-PCR和western blot检测TDGF-1基因mRNA和蛋白水平,以划痕试验方法评测癌细胞迁移能力;用Boyden模型观察癌细胞侵袭能力.结果 根据TDGF-1基因序列特点设计的3个siRNA均能抑制TDGF-1基因mRNA水平,以S1效果最好.S1 siRNA转染组TDGF-1 mRNA和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性（P＜0.001,P＜0.001）.体外试验发现,TDGF-1 siRNA转染可有效抑制乳腺癌细胞集落生长、侵袭和迁移能力,且与浓度相关（P＜0.005,P＜0.005,P＜0.005）.结论 TDGF-1在乳腺癌细胞迁移、侵袭中起着重要的作用;采用TDGF-1 siRNA转染可抑制乳腺癌细胞侵袭.     

△Np73小干扰 RNA 表达质粒抑制人乳腺癌细胞株 MCF-7增殖

目的：应用小干扰 RNA 技术抑制△Np73表达,探讨其对人乳腺癌细胞株 MCF-7增殖的影响。方法制备△Np73小干扰表达质粒,脂质体法转染人乳腺癌细胞株 MCF-7;荧光显微镜下观察转染细胞绿色荧光蛋白表达,计算转染效率; MTT 法检测转染质粒后细胞增殖抑制率;实时荧光定量 PCR 检测细胞转染质粒后△Np73和 TAp73 mRNA 的表达;共转染 pcDNA3-HA/ DNp73α表达质粒与△Np73小干扰质粒, Western Blot 检测细胞转染后△Np73和 TAp73表达。结果成功构建并转染△Np73小干扰表达质粒,转染效率达62%。经△Np73质粒干扰的细胞增殖活性显著下降,与阴性对照组相比差异显著。△Np73小干扰质粒转染细胞能有效抑制内源性△Np73 mRNA 和外源性△Np73蛋白表达,对 TAp73无显著抑制作用。结论针对△Np73基因设计的小干扰 RNA 表达质粒能显著降低 MCF-7细胞中△Np73 mRNA 及蛋白的表达,抑制细胞生长增殖,表明靶向沉默△Np73可能为未来人乳腺癌的治疗提供了一个有效途径。     

靶向P75的siRNA对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 构建P75特异小干扰RNA(siRNA)表达载体,并观察其对神经生长因子(NGF)促乳腺癌细胞生长及凋亡的影响.方法 通过GenBank提供的P75 mRNA序列,设计3对能转录短发夹状RNA的DNA序列,构建pSilencerTM4.1-CMV neo质粒重组载体,转染乳腺癌SKBR3细胞;通过实时荧光定量PCR和Western blot筛选RNA干扰效果最强的干扰片段;以此干扰片段转染至乳腺癌SKBR3细胞,利用G418筛选稳定表达P75-siRNA的SKBR3细胞株,命名为P75-siRNA;MTT检测P75干扰后NGF对细胞增殖作用的影响;流式细胞术检测细胞凋亡;建立荷乳腺癌小鼠模型,观察P75干扰后对小鼠肿瘤生长和凋亡相关蛋白表达的影响.结果 序列测定表明成功构建P75-siRNA表达载体,实时荧光定量PCR和Western blot检测结果显示P75 mRNA和蛋白表达下调,尤以P75 2-siRNA干扰片段效果显著;MTT检测显示,NGF能刺激细胞增殖,与NGF组相比,P75-siRNA干扰后细胞增殖率均明显增高(P＜0.05);与空白对照组相比,NGF+ P75-siRNA组和NGF组的细胞凋亡率明显降低(P＜0.05),NGF+ P75-siRNA组更为明显;荷乳腺瘤小鼠中,P75-siRNA组小鼠的肿瘤生长明显超过未转染组和空载体转染组(P＜0.05),且P75-siRNA组Caspase-3表达下降,Bcl-2表达增加,Bax表达下降(P＜0.05).结论 P75特异干扰表达载体能有效降低P75的表达,增强NGF促乳腺癌SKBR3细胞的增殖作用和抗凋亡作用,从而使肿瘤生长更为明显.     

特异性小干扰RNA沉默Annexin Ⅱ基因表达对人乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭迁移力的影响

目的:探讨RNA干扰技术沉默Annexin Ⅱ基因表达对人乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭迁移力的影响.方法:体外化学合成AnnexinⅡ基因序列特异性双链小干扰RNA(Annexin Ⅱ-siRNA),转染高转移人乳腺癌细胞株MDA-MB-231,用荧光显微镜观察转染效率,逆转录-聚合酶链反应和蛋白印迹检测Armexin Ⅱ mRNA和蛋白表达水平;通过生长曲线和体外侵袭迁移实验,观察乳腺癌细胞恶性生物学行为的改变.结果:Annexin Ⅱ-siRNA能有效抑制Annexin Ⅱ mRNA和蛋白表达(P<0.05);经siRNA处理的细胞,细胞生长速度明显降低(P<0.05),侵袭迁移力显著下降(P相似文献   

RNAi沉默MACC1基因表达抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移

目的探讨RNAi沉默MACC1基因表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖及迁移的影响及相关的分子机制。方法化学合成针对MACC1基因的荧光标记的siRNA-FAM,利用siRNA转染试剂将MACC1特异性siRNA-FAM转染至乳腺癌MCF-7细胞;采用RT-PCR检测siRNA对MACC1 mRNA表达的影响,Western blot检测siRNA对MACC1蛋白合成的影响;MTT实验检测沉默MACC1基因后对MCF-7细胞增殖活性的影响;Transwell迁移实验检测沉默MACC1基因后对MCF-7细胞迁移能力的影响;Western blot检测干扰MACC1对S100A4及vimentin蛋白合成的影响。结果 MACC1基因在乳腺癌MCF-7细胞高表达;针对MACC1基因的siRNA转染MCF-7细胞48 h后,siRNA组与空白对照组比较,能够显著抑制MACC1基因表达和蛋白合成,抑制效率分别为81%和75%;MACC1特异性siRNA转染MCF-7细胞24、48、72 h后,MMT结果显示与空白对照组比较,siRNA组能够抑制细胞生长,并随着时间延长抑制明显(P<0.05);转染MCF-7细胞48 h后,Transwell迁移实验结果显示siRNA组与空白对照组比较,穿过小室细胞数明显降低,其能有效抑制MCF-7细胞迁移(P<0.05);siRNA组与空白对照组相比,S100A4和vimentin表达降低(P<0.05)。以上实验阴性对照组和空白对照组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论利用特异性siRNA干扰MACC1基因表达,可显著抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移能力,且这一过程可能与S100A4和Vimentin的表达下调有关。     

siRNA沉默FAK基因表达对乳腺癌MCF-7细胞生物学特性的影响

目的:研究RNAi干扰粘着斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)的表达及对人类乳腺癌细胞生物学特性的影响.方法:构建表达FAK基因siRNA的重组质粒FAK-siRNA,在脂质体的介导下转染入人乳腺癌MCF-7细胞,荧光倒置显微镜下观察转染效率,应用RT-PCR和Western blot检测FAK mRNA和蛋白表达,流式细胞术分析细胞周期分布,体外实验测定肿瘤细胞穿透matrigel的能力.结果:成功转染FAK-siRNA后乳腺癌MCF-7细胞FAK基因的表达与阴性对照组、空白质粒转染组相比FAK mRNA和蛋白表达水平明显降低(P＜0.05),细胞增殖指数及侵袭力明显降低(P＜0.01).结论:FAK-siRNA能有效抑制人乳腺癌细胞FAK基因mRNA和蛋白的表达,降低细胞增殖能力及侵袭力.     

质粒介导靶向c-myc的siRNA对MCF-7乳腺癌细胞增殖的影响

目的观察靶向原癌基因c-myc的siRNA对MCF-7人乳腺癌细胞c-myc/c-Myc表达及细胞增殖的影响。方法以原癌基因c-myc mRNA 589-609位碱基为靶序列构建靶向c-myc的siRNA真核表达质粒p-Mat01-1及其错配质粒p-Mis09-1,空质粒pEGFP-C1为对照,用脂质体Lipo2000包裹转染MCF-7细胞。采用RT-PCR、Western blot检测c-myc mRNA及蛋白表达,MTT法检测MCF-7细胞增殖。结果与pEGFP-C1及p-Mis09-1比较,转染p-Mat01-1能够特异性抑制MCF-7细胞c-myc mRNA(24h:P<0.01)及蛋白(5d:P<0.01)表达,显著降低MCF-7细胞增殖能力(3d:P<0.05,5、7d:P<0.01)。结论采用siRNA表达质粒技术能够有效抑制MCF-7乳腺癌细胞c-myc/c-Myc表达,初步证实下调c-myc/c-Myc表达能够抑制MCF-7细胞增殖,为RNA干扰技术在乳腺癌生物治疗中的应用打下一定实验基础。     

体外RNA干扰抑制REG4基因表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨体外RNA干扰抑制REG4基因表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响。方法应用实时定量PCR方法检测七株胃癌细胞株中REG4基因的mRNA表达。针对REG4基因设计三条小干扰RNA片段(siRNA1、siRNA2、siRNA3),瞬时转染高表达胃癌细胞株。用RT-PCR方法检测转染后REG4基因的mRNA表达水平、MTT法检测细胞增殖能力、AnnexinV-PI法检测细胞凋亡水平。结果以永生化正常胃粘膜细胞株GES-1作为参照。MKN-45和AGS胃癌细胞株中REG4表达水平升高200倍以上,遂选用AGS细胞进行RNA干扰。RT-PCR结果证实siRNA2、siRNA3均有干扰效果,尤以siRNA3效果明显。选用siRNA3干扰AGS细胞株,MTT实验结果证实干扰AGS后,细胞增殖受到明显抑制(P<0.05)。AnnexinV-PI实验结果显示细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。结论干扰REG4基因具有抑制胃癌细胞增殖、促进凋亡的作用,REG4基因可能成为胃癌基因靶向治疗的新靶点。     

核基质结合区结合蛋白SATB1上调乳腺癌干细胞表型CD44+/CD24-的表达

 目的  探讨核基质结合区结合蛋白,富含A-T序列特异性结合蛋白1(special A-T rich sequence binding protein 1,SATB1)对乳腺癌干细胞表型CD44+/CD24-的影响及机制。 方法  用SATB1相关小干扰RNA(SATB1 related small interfering RNA,SATB1-siRNA)双链寡核糖核酸干扰MDA-MB-231细胞;pEGFP-N1 -SATB1-GFP真核表达质粒瞬时转染MCF7细胞后,流式细胞术检测SATB1对乳腺癌干细胞表型CD44+/CD24-表达的影响。结果  MCF7细胞转染SATB1后,表达CD44+/CD24-的细胞比例明显升高;MDA-MB-231细胞在SATB1-siRNA干扰后,表达CD44+/CD24-的细胞比例明显降低(P<0.05)。结论  SATB1可能在形成并维持乳腺癌肿瘤干细胞特性中起重要作用。     

siRNA沉默CEACAM1基因对人胶质瘤SHG44细胞生物学行为的作用

目的 探讨CEACAM1基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对胶质瘤SHG44细胞增殖、体外迁移和侵袭能力的影响. 方法 设计并化学合成针对CEACAM1的3对siRNA,脂质体法瞬时转染SHG44细胞.Western blot检测转染后细胞中CEACAM1、β-catenin和Cyclin D1蛋白表达水平变化.CCK-8法检测转染后的细胞增殖情况,流式细胞仪检测转染后细胞周期的变化.通过Transwell小室迁移和侵袭实验,观察下调CEACAM1对SHG44细胞体外迁移和侵袭能力的影响.结果 三组特异性siRNA转染48 h后,Western blot的结果显示,3个siRNA转染组CEACAM1蛋白水平均低于正常对照组和阴性对照组(P＜0.01),以CEACAM1-siRNA3干扰效果最为明显.后续实验表明,与两个对照组相比较,CEACAM1-siRNA组的细胞增殖减慢,β-catenin和Cyclin D1表达水平明显减少(P＜0.05).Transwell小室迁移和侵袭实验表明CEACAM1下调后的SHG44细胞迁移和侵袭能力较正常对照组及阴性对照组明显降低(P＜0.05). 结论 CEACAM 1-siRNA能有效抑制人胶质瘤SHG44细胞CEACAM1蛋白的表达,并抑制细胞增殖,降低细胞的体外迁移及侵袭能力.     

载体介导HER-2 RNA干扰治疗乳腺癌研究

目的 探讨载体介导HER-2RNA干扰治疗HER-2阳性乳腺癌的可行性。方法 构建能够产生HER-2 siRNA的质粒载体,利用载体转染HER-2阳性乳腺癌细胞SKBR-3,利用RT-PCR与Western blot检测HER-2 mRNA与蛋白表达情况,同时观察转染后SKBR-3细胞凋亡及生长情况。结果 SKBR-3细胞HER-2受到载体介导的RNA干扰后．HER-2 mRNA及蛋白表达出现明显下调,细胞凋亡增加,肿瘤细胞生长受到抑制。结论 乳腺癌HER-2是理想的RNA干扰治疗靶点,靶向HER-2的RNA干扰可以诱导肿瘤凋亡,抑制肿瘤生长。