荧光定量PCR检测土拨鼠肝炎病毒核酸方法的建立

目的建立土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)核酸的荧光定量PCR(Real-time PCR)检测方法,应用于土拨鼠肝炎病毒模型的研究。方法分别根据土拨鼠肝炎病毒核心抗原(WHcAg)和表面抗原(WHsAg)的DNA序列设计13对扩增引物,从中筛选无非特异性扩增及引物二聚体且灵敏度高的引物,用于土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测。建立感染土拨鼠肝炎病毒的土拨鼠血清中WHV核酸的Real-timePCR检测方法。结果根据WHsAg基因的5’端设计的一对引物WHVSF1与WHVSR1,检测灵敏度可达1×101拷贝/μL,病毒拷贝数与Real-time PCR Ct值的标准曲线的R2值为0.997,且电泳未见明显非特异性条带及引物二聚体。结论建立了土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测方法,该方法为进一步研究土拨鼠肝炎病毒模型奠定了基础。     

荧光定量PCR检测B19病毒方法的建立

中图分类号R373摘要目的:建立采用荧光定量聚合酶链反应(FQPCR)检测人微小病毒B19的方法。方法:根据B19病毒VP2基因序列,设计并合成引物和荧光标记探针。将PCR扩增的B19病毒VP2区基因片段克隆入pGEMT载体,重组质粒pGEM-T-VP2经筛选、鉴定后,作为阳性模板,用于标准曲线的制定和样品检测;对15例B19病毒感染血标本和几种其他病毒进行PCR测定。结果:应用重组质粒制作的定量曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系;与定量对照曲线比较计算,15例B19病毒感染标本中B19拷贝数为4.8×105μl-1～8.7×108μl-1;对其他几种病毒的扩增均无信号出现。结论:成功建立了检测B19的荧光定量PCR方法,较常规PCR技术更为简便、快速、准确,有很好的应用前景和研究价值。     

乙肝病毒DNA荧光定量PCR检测及其意义

目的 探讨荧光定量PCR法检测的乙型病毒DNA与乙肝病毒标志物之间的关系。方法 362例血清标本同时进行乙肝病毒标志物和HBV DNA的检测,按照不同的乙肝病毒标志阳性情况分级后,进行乙肝病毒DNA与乙肝病毒标志物的分析研究。结果 乙肝病毒标志物HBsAg HBeAg HBcAb阳性组HBV DNA阳性率97.7%,拷贝数在10^4-10^8之间;HBsAg HBeAb HBcAb阳性组阳性率56％,拷贝数在10^2－10^7之间;HBsAg HBcAb阳性组阳性率54％,拷贝数在10^2－10^7之间;HBsAg HBeAg组阳性率100％,拷贝数在10^7之间;HBeAb HBcAb组3例,有1例阳性,拷贝数10^2;HBsAb组阳性率14.3%,拷贝数在10^3－10^7之间;189例全阴性有2例阳性（1.06%）,拷贝数在10^4－10^5之间。结论 HBV DNA在各种模式的HBV标志阳性血清甚至全阴性的血清中均可检出,但检出率相差甚大,从1.06%－100％;HBV DNA乙肝病毒标志中HBeAg阳性者其HBV DNA阳性率及拷贝数较高;HBsAg及其抗体阳性者仍可检出HBV DNA,说明仅仅依靠乙肝病毒标志进行早期诊断以及判断病人是否具有传染性是不够的。     

鸭乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR方法的建立及应用

目的：建立鸭乙型肝炎病毒核酸(DHBV DNA)荧光定量的方法。方法：根据DHBV DNAS基因区的序列设计扩增所需3条引物，通过偶联反应用AmpliSensor荧光信号标记半巢式引物，经过前期不对称扩增、半巢式扩增及在线检测建立DHBV DNA阳性标准品QPCR的标准曲线，并将70份鸭血清分别用荧光定量PCR方法和地高辛标记的DHBV DNA探针斑点杂交的方法检测，比较结果的相关性。结果：DHBV DNA阳性标准品经过30次循环后，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，可以看出有180bp、70bp两个片段，与设计的片段大小相符，扩增产物的浓度与标准品的起始浓度成正比，扩增指数的数值大小与该循环时己合成的扩增产物的量成正比，起始浓度的大小与要合成的一定扩增产物的量所需的循环次数成反比。用荧定量PCR方法和斑点杂交的方法检测血清中DHBV DNA的结果有良好的相关性(r＝0．97，P＜0.01，ν＝58)。结论：荧光定量PCR方法可作为检测DHBV DNA含量的一个重要手段。     

应用于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法

目的建立特异灵敏的适应于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法.方法于细菌样本离心所得沉淀中加入提取液(25% Chelex-100,0.5%NP40,TE配制,pH=9.0);56℃孵育30 min;100℃水浴10 min;离心后所得上清即为DNA.电泳、PCR及Real-time PCR扩增评价该方法的特异性及灵敏度.结果本方法所提细菌DNA电泳条带清晰,未见假阳性,D(260)/D(280)=(1.79±0.03);PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,灵敏度达101/ml细菌浓度.结论本研究细菌DNA提取方法特异灵敏,适应于PCR及Real-time PCR.     

鼠痘病毒荧光定量PCR检测方法的建立与应用

目的 建立鼠痘病毒的荧光定量PCR检测方法,以期能快速、准确、灵敏、特异的检出鼠痘病毒。方法 经过比对和筛选,本研究选取鼠痘病毒的ERPV_027基因480-800位序列段,作为引物设计位点设计引物和探针,并对该引物对和探针的特异性、灵敏性、稳定性和重复性进行检测。结果 本研究建立的方法,对鼠痘病毒的检测极限是68.8copies/μl;该方法特异性强,只对鼠痘病毒特定片段进行特异性扩增,而对小鼠肝炎病毒、仙台病毒、沙门氏菌等其它病毒、细菌无扩增;该方法稳定性和重复性均较好。结论 本研究成功建立了检测鼠痘病毒的荧光定量PCR方法,该方法特异性强、灵敏度高,且具有较好的稳定性和重复性,具有广阔的应用价值。     

荧光定量PCR检测HBV-DNA

目的 探讨血清HBV-DNA水平与HBV标志物(HBVM)表现模式的关系。方法对1223例慢性乙型肝炎患者进行血HBV-DNA荧光定量PCR分析,HBVM检测采用ELISA法。结果血清HBV-DNA水平与HBV M表现模式有关,HbsAg与HbeAg的存在影响HBV-DNA水平变化。结论HbeAg水平与HBV-DNA有明显的相关,抗-Hbc、抗HBc阳性者病毒未完全停止复制,只是复制水平降低。     

荧光实时定量PCR检测前列腺癌抗原3评分方法的建立

目的 前列腺癌抗原3(prostate cancer antigen 3,PCA3)基因表达具有前列腺癌特异性,文中建立荧光实时定量PCR(FQ-RT-PCR)检测PCA3评分的方法.方法 分别以LNCap和PC-3细胞株为阳性和阴性对照,用TaqMan探针建立检测PCA3和前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA) mRNA的荧光实时定量PCR方法,评价特异性、重复性和计算扩增效率,建立PCA3评分计算公式.结果 检测PCA3和PSA mRNA的批内变异系数分别为1.19%、1.09%、0.84%和0.06%、0.71%、0.79%,批间变异系数分别为1.03%和0.56%;扩增效率分别为0.98和1.00;以2-ΔCt表示PCA3评分.结论 荧光实时定量PCR检测PCA3评分方法的特异性好,重复性高.     

两种HBV-DNA荧光定量PCR检测比较

目的优化HBV—DNA特异性定量检测方法。方法采用荧光定量PCR检测法，用10份正常血清、10份HBV高滴度（10^6 IU／mL）血清和梯度稀释的HBV克隆质粒标准品，验证两种检测方法的重复性、特异性和灵敏度；并将结果进行配对检验。结果10份正常血清标本均无假阳性HBV—DNA检测结果，特异性极好；10份HBV高滴度血清中检出1份YMDD变异，灵敏度均可达到10^3 IU／mL，重复性和灵敏度两者之间无显著性差异（t=0．702，P〉0．05）。结论该方法特异性和灵敏度高，可用于HBV的临床检测和科学研究。     

荧光定量PCR检测生殖道内沙眼衣原体感染的应用

目的 评价DNA定量测定技术在生殖道衣原体感染诊断中的应用价值.方法 比较荧光定量DNA测定与传统检测手段对衣原体感染的检测结果.结果 用荧光定量PCR法测定DNA来检测沙眼衣原体(CT)感染,其敏感性和特异性均比传统的方法高.结论 CT-DNA定量测定不宜用作短期判愈,在沙眼衣原体诊断中具有巨大的潜力.     

巴尔通体实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立灵敏、特异的SYBR—Green荧光定量PCR检测巴尔通体的方法,以用于巴尔通体的实验室快速诊断和自然疫源地的流行病学研究。方法利用离心柱法抽提鼠血中巴尔通体细菌基因组DNA,在荧光定量PCR检测仪上检测基因组中枸橼酸合酶gltA的Ct含量,结合熔解曲线的Tm值进行分析,建立实时荧光定量检测法。结果检测62份阳性菌株。Ct值小于30,Tm值在81—83℃范围内;检测309份鼠血抽提的基因组DNA样品,阳性128份,阳性率为38．19％。结论建立了检测巴尔通体枸橼酸合酶gltA的SYBR—Green荧光定量PCR方法,较常规培养法更快捷、简便、敏感,适合大面积调查巴尔通体在鼠群中的分布情况,为流行病学的深入研究提供科学依据,并可作为检测巴尔通体的技术储备。     

荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒

聚合酶链反应 (PCR)是目前检测血清中 HBV- DNA的最敏感方法 ,但 PCR只能定性分析 ,无法给出临床需要的定量结果 ,其最终产物需用电泳法检测 ,易引起 PCR产物的交叉污染 ,且操作繁琐 ,不利于进行大规模样品分析。本文采用实时荧光定量 PCR方法 (PCR,FQ- PCR) [1 ] 测试了 2 0 1份血清标本 ,并同时采用酶联免疫吸附试验 (EL ISA)进行对照 ,现报告如下。1　材料和方法1.1　标本来源 :收集本院病房及门诊确诊或怀疑乙肝患者血清 171份 ,健康献血员血清 30份。1.2　仪器 :PE770 0自动荧光 PCR仪 (美国 Perkin Elmer公司 )和日立…     

荧光定量PCR检测食品中副溶血性弧菌方法的建立

目的：建立一种荧光定量PCR方法检测副溶血性弧菌,为食品安全监测、临床诊断提供快速、准确的检测方法。方法：选取副溶血性弧菌不耐热溶血毒素基因作为检测的靶片段设计引物及探针,通过体系优化建立检测副溶血性弧菌的荧光定量PCR检测方法。同时评价其特异性、灵敏度、重复性。并对临床收集的样本进行检测。结果：所建立的荧光定量PCR方法特异性高,可准确、特异的检测副溶血性弧菌,灵敏度为10cfu/mL;20份市售食品样本检测结果显示12例副溶血性弧菌阳性,结果符合常规培养检测结果。结论：所建立的荧光定量PCR方法具有快速、结果可靠、灵敏度高等特点,可用于食物污染物调查、临床检验等多个方面中副溶血性弧菌的检测。     

HBVDNA荧光定量PCR检测及临床意义

血清HBV-DNA浓度与乙型肝炎病毒感染的严重程度和传染性有关,可用于判断病情和预后,以及观察抗病毒药物的治疗效果.通常血清 HBV-DNA持续阳性超过6个月会转为慢性肝 炎.抗-HBc阳性患者血清HBV-DNA持续阳性常提示肝受损严重,50%以上抗-HBc阳性慢性活动性肝炎患者,经平均4.5年发展为肝硬化,常与HBV-DNA持续阳性有关.     

荧光定量PCR在乙肝检测中的应用

目的 :探讨 5‘ -核酸酶法荧光定量技术在乙肝检测中应用状况。方法 :采用荧光定量PCR方法 ,检测2 0份阳性对照考核批内及批间变异 ;采用 5 0份HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAg(+)的血清 ,结合肝功能及HBeAg滴度考核阳性率、病毒含量范围以反映病毒复制状况 ;对 5份本法检测阳性的标本 ,4℃保存 ,并隔日检测 ,确定最佳检测时间。结果 :批内CV为 4 1 % ,批间CV为 4 0 %。阳性标本为 4 6份 (92 % ) ,其中 4份肝功能正常 ;阴性标本为 4份 (8% ) ,其中 1份肝功能异常。病毒量有较大的变化范围 ,从 0 .1 1× 1 0 4～ 5 .1× 1 0 4CID/ml。阳性标本所测病毒量与HBeAg滴度相关系数为 0 .77。在 1 5d内隔日所测病毒量相近。结论 :本法应用于乙肝检测 ,有较好的特异性 ;定量结果能够反映病毒在体内的复制状况 ;病毒含量因患者而异 ;在严格操作条件下 ,本法有一定的重复性 ;正确保存标本时 ,在半月内均可以检测病毒     

结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法的建立与应用

目的建立结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测方法，探讨荧光PCR检测痰标本中结核分枝杆菌的应用价值。方法根据结核分枝杆菌基因保守序列设计引物和探针，并构建标准品。对102例培养涂阳的结核痰液标本和45例非结核感染者的痰标本，应用荧光定量PCR法、痰涂片抗酸染色法检测结核分枝杆菌。结果荧光定量PCR、抗酸染色法检测结核分枝杆菌的特异性分别为100％、30％。结论荧光定量PCR是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法，具有重要的应用价值。     

荧光定量PCR检测 HBV-DNA的临床意义

目的了解荧光定量PCR法检测的HBV-DNA与乙型肝炎,标志物的关系,探讨荧光定量PCR在HBV-DNA检测方面的临床价值。方法采用荧光定量PCR技术对乙肝标志物阳性血清进行HBV-DNA定量测定,对26例HBV-DNA( )(拷贝数105～109/ml)、HBeAg( )(≥10.86NCU/ml)患者贺普丁治疗前后血清HBV-DNA、HBeAg进行定量监测。结果①108例HBsAg( )/HBeAg( )/HBcAb( )者有106例HBV-DNA阳性,阳性率98%,含量为(7.65±1.06)拷贝/ml;112例HBsAg( )/HBeAb( )/HBcAb( )者有58例阳性,阳性率为51%,含量为(5.38±1.55)拷贝/ml;46例HBsAg( )/HBcAb( )者有17例阳性,阳性率36%,含量为(4.09±1.79)拷贝/ml。②HBV-DNA基因拷贝数与HBeAg水平呈正相关。③26例HBeAg( )、HBV-DNA( )患者经12个月治疗,HBeAg阴转率为42%,HBV-DNA( )阴转率为80%,明显高于HBeAg阴转率(P<0.01)。结论荧光定量PCR检测HBV-DNA,能直接反映HBV-DNA含量,在判断体内HBV是否复制,复制程度,是否被清除等方面明显优于HBV血清标志物检测,对抗病毒治疗过程监测、愈否监控以及疗效评价具有一定的实用价值。     

荧光定量PCR检测乙肝DNA分析前质量控制

目的研究讨论荧光定量PCR对乙肝DNA检测分析前的质量控制,总结分析其质量控制方式。方法对乙肝DNA试剂进行荧光定量PCR检测,通过标本溶血、抗凝剂种类、实验污染、实验设施和机器设施的应用等方面,研究讨论在分析前实施质量控制会不会对荧光定量PCR检测乙肝DNA带来影响。结果溶血40例乙肝DNA阳性标本之后,溶血之前和溶血之后乙肝DNA结果的对数在进行配对技术资料Kappa的检测,Kappa的数值为1.958,P<0.05;对22例乙肝DNA阳性患者实施血清组分别与肝素抗凝血浆组以及EDTA-K,对抗凝血浆组做出对比与分析,分别得出Kappa的数值为4.679(P<0.01)和0.719(P>0.05)。结论要使荧光定量PCR对乙肝DNA的检测得到良好的结果,必须预防互相污染与环境污染,对校准所使用的仪器加强管理。