骨髓间质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的：探讨分离骨髓间充质干细胞（MSCs）并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据。方法：抽取兔髂骨骨髓液,经梯度离心法和贴壁法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂[含转化生长因子（TGF-β2）10ng／ml、地塞米松10^7mol／L、维生素C50μmol／L,经7、14、21d诱导培养后,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。将诱导细胞与软骨支架材料-聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸（CPP／PLLA）复合,1周后终止培养,扫描电镜观察细胞黏附情况。结果：诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀。诱导后的MSCs可在支架材料内良好黏附生长。结论：体外培养的MSCs可定向诱导分化为软骨细胞,分泌软骨细胞特异性基质,可用作软骨组织工程的种子细胞。     

Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Form Ectopic Woven Bone In Vivo Through Endochondral Bone Formation

Abstract:  Autologous vascularized bone grafts, allografts, and biocompatible artificial bone substitutes each have their shortcomings. Bones regenerated using recombinant human bone morphogenetic proteins, demineralized bone powder, or combinations of these are generally small and do not meet the need. The current trend is to use tissue engineering approaches with bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) to generate bones of a desired size and shape. A suspension of osteogenically induced MSCs (CD11a−, CD29+, CD44+) was added to 2% alginate, gelled by mixing this combination with calcium sulfate (CaSO₄ 0.2 g/mL), and injected into the subcutaneous pocket in the dorsal aspect of nude mice. Cells of various concentrations (0, 10, 50, and 70 million/mL) were used. These implanted constructs were harvested at predetermined times up to 30 weeks for histology. The doubling time of bovine MSCs is 3.75 ± 1.96 days and the proliferation is rapid. Histological evaluation revealed signs of endochondrosis with woven bone deposition. The equilibrium modulus increased with time in vivo, though less than that of normal tissue. Implants seeded with 70 million cells/mL for 6 months resulted in the best formation of equilibrium modulus. This approach has several advantages: (i) obtaining MSCs is associated with low donor morbidity; (ii) MSCs proliferate rapidly in vitro, and a large number of viable cells can be obtained; and (iii) the MSC/alginate constructs can develop into bone-like nodules with high cell viability. Such a system may be useful in large-scale production of bony implants or in the repair of bony defects. The fact that endochondral bone formation led to woven bone suggests its potential feasibility in regional cell therapy.     

聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸软骨支架复合自体骨髓间充质干细胞构建组织工程化人工关节软骨

目的：应用组织工程学技术,体外初步构建组织工程化人工关节软骨。方法：制备三维多孔软骨支架材料CPP／PLLA,体外诱导兔MSCs向软骨细胞表型分化,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达,将诱导细胞与软骨支架材料CPP／PLLA复合,体外培养构建人工关节软骨,1周后终止培养,扫描电镜观察组织工程化人工软骨的微观结构;同时将构建人工软骨移植于兔大腿皮下,3周后处死动物,甲苯胺蓝染色观察。结果：扫描电镜观察可见该复合材料CPP／PLLA为高孔隙率的网状、连通、微孔结构,微孔分布均匀,孔径大小为300～400μm之间;兔MSCs经体外软骨表型定向诱导后,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。诱导后的MSCs可在支架材料内良好贴附生长,细胞被分泌的胶原基质包裹;从体内获取的培养物组织切片观察可见大量的软骨细胞生成,甲苯胺蓝染色阳性。结论：经软骨起源诱导后的MSCs与CPP／PLLA复合培养可以构建自体软骨移植的替代物,为应用软骨组织工程方法修复关节软骨缺损和功能重建提供一种新材料,具有较大的潜在应用价值。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为血管平滑肌样细胞的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）作为构建小口径血管种子细胞的可行性及其诱导机制。方法取体重100 g左右雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠后肢股骨和胫骨骨髓,采用原代全骨髓培养法,多次传代纯化,体外扩增后,观察细胞形态,并用免疫荧光及流式细胞仪检测CD34、CD90、CD105细胞因子,鉴定是否为BMSCs。将BMSCs分为实验组和对照组：实验组使用含全反式维甲酸及二丁酰环磷酸腺苷（db-cAMP）的低糖基本培养基（DMEM-LG）培养;对照组采用普通的DMEM-LG培养。观察诱导后细胞形态,检测诱导后第5代细胞平滑肌α-肌动蛋白（SM--αactin）、钙结合蛋白（calponin）、平滑肌肌球蛋白重链（SMMHC）的表达情况。结果原代培养所获取的细胞经过多次传代培养后呈长梭形,呈现特征性的漩涡状生长,检测CD34阴性,CD90、CD105阳性。实验组经诱导后的BMSCs生长较缓慢,略呈椭圆形,检测SM--αactin、calponin、SMMHC显著表达;对照组的细胞形态及生长速度和实验组BMSCs相似,但不表达SM--αactin、calponin和SMMHC。结论 BMSCs在全反式维甲酸的诱导下可向血管平滑肌样细胞表型分化,可为组织工程构建小口径血管提供平滑肌种子细胞。     

骨髓间充质干细胞干预对缺血再灌注诱导肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的：观察骨髓间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）对缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）诱导的急性肾损伤模型小鼠肾小管上皮细胞（renal tubular epithelial cells,RTECs）凋亡的保护作用及机制。方法：Percoll密度梯度离心结合贴壁培养法有效分离出C57BL/6小鼠的骨髓间充质干细胞（mMSCs）。雄性C57BL/6小鼠45只,分为正常对照组（15只）、I/R组（15只、夹闭双侧肾蒂30min开放）、I/R＋mMSCs组（15只、夹闭双侧肾蒂30min开放的同时尾静脉注射mMSCs）。造模并干预后,于1d、2d、3d、7d、14d分别处死部分小鼠,留取动脉血及肾组织,检测血尿素氮（BUN）及肌酐（Scr）,制作肾组织切片行HE染色进行肾小管损伤程度评分,TUNEL法检测RTECs的凋亡,Western Blot法检测建模后第2天肾小管组织中Caspase-3、Bcl-2蛋白水平的表达。结果：I/R后小鼠的BUN及Scr均显著高于正常对照组,但同一时间点I/R＋mMSCs组小鼠的BUN及Scr水平较I/R组为低,以术后第7天差异最为显著（P〈0.01）,肾小管损伤程度评分也有着显著降低。TUNEL检测表明I/R可诱导RTECs发生明显的凋亡,以术后第2天凋亡指数（apoptosis index,AI）最高（46.71±11.20）（P〈0.01）,而mMSCs干预可显著降低各时间点RTECs的凋亡水平（P〈0.05或P〈0.01）,至14d时AI基本恢复至对照组水平。Western blot进一步显示：I/R＋mMSCs组小鼠的肾组织中Caspase-3蛋白水平明显下降（1.16±0.33,P〈0.01）,而Bcl-2水平却有明显增高（0.94±0.27,P〈0.01）。结论：移植的MSCs对I/R诱导的肾损害小鼠RTECs凋亡具有抑制作用,从而有利于肾小管损伤的早期恢复,其保护机制可能与抑制Caspase-3表达,上调Bcl-2表达有关,但其细胞学和分子机制还有待进一步研究。     

真皮间充质干细胞成骨分化的研究进展

骨组织工程技术修复骨组织的缺损显示了广阔的应用前景.真皮间充质干细胞(Dermal mesenchymal stem cells,DMSCs)来源于皮肤组织,易大量获取,对供区损伤极小,具有包括成骨分化在内的多向分化潜能,有望成为骨组织工程研究合适的种子细胞.我们就真皮间充质干细胞成骨分化的研究进展进行综述.     

三维及二维培养大鼠胰腺导管来源干细胞的体外对比实验研究

目的观察在不同培养模式下大鼠胰腺导管来源干细胞(PDSC)的生物学特性。方法以大鼠胰腺组织为材料,采用动力性三维培养及传统二维培养方法进行细胞培养,获得原代PDSC,并连续传代,纯化PDSC,比较动力性三维培养及传统二维培养细胞间连接及细胞凋亡周期的差异。结果动力性三维培养的大鼠PDSC在培养第2天即可沿三维支架贴壁生长,在第7天即可形成细胞团,并沿三维支架多向贴壁生长;二维培养的PDSC在培养第5天贴壁生长。三维培养与二维培养相比,二维培养的细胞间连接少见,三维培养的细胞连接结构丰富。三维培养与二维培养相比,三维培养的G1期细胞增多,G2期细胞相对减少(P<0.01),三维培养早期自发凋亡细胞比例相对减少(P<0.05),晚期自发凋亡与坏死细胞比例两种培养方式间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论动力性三维细胞培养较传统二维细胞培养,在细胞贴壁时间、细胞连接以及细胞凋亡方面具有明显的优势。     

人骨髓基质细胞表面标志的研究

目的 研究人骨髓基质干细胞经体外培养后细胞的表型.方法 8例成年志愿者(无系统性疾病,20-40岁)髂前上嵴骨穿法得人骨髓,密度梯度法分离骨髓基质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cell,hMSC),单纯DMEM培养液,分别培养至第2代细胞,免疫荧光和流式细胞仪鉴定hMSCs细胞表型,CD105,CD166,CD29的表达.结果 第二代细胞可见明显CD105,CD166,CD29表达,第二代细胞CD105阳性率78±6%,CD166阳性率43±7%,CD29阳性率69±12%.结论 人MSC体外经传代培养后可表达干细胞特征表型.     

人脐带间充质干细胞向血管内皮祖细胞诱导分化的实验研究

目的探讨人脐带间充质干细胞定向诱导分化为血管内皮祖细胞的可行性,为构建组织工程血管瓣膜内皮化提供新的细胞来源。方法无菌条件下取剖宫产新生儿脐带,复合胶原酶消化法获取脐带间充质干细胞进行培养,以流式细胞仪检测脐带间充质细胞的表面标志。取扩增3～6代的脐带间充质干细胞用VEGF和b-FGF诱导分化。用免疫荧光法鉴定内皮祖细胞的标志。结果脐带间充质干细胞可以诱导分化为血管内皮样细胞,表达CD34、CD133和vWF,且Dil-acLDL实验阳性。结论脐带间充质干细胞可以诱导分化为血管内皮祖细胞,可为构建组织工程血管瓣膜提供新的种子细胞来源。     

骨髓间充质干细胞体外构建组织工程化半月板

目的探索以骨髓间充质干细胞（BMSCs）为种子细胞,在体外构建具有完整内侧半月板形态的软骨样组织的方法。方法运用模具制备内侧半月板形的PGA/PLA支架。抽取犬骨髓,分离培养BMSCs,将其接种于支架材料上,5 d后使用软骨诱导液培养。体外培养6周后,行大体观察、组织学检测及生物力学检测。结果细胞材料复合物能够较好地维持半月板三维立体结构,形成了表面光滑、触之有弹性的瓷白色软骨样组织。 HE染色可见典型的软骨陷窝出现,说明成熟软骨组织的形成。Safranine O染色证实有蛋白聚糖基质产生。生物力学检测显示,新生组织弹性模量达正常半月板组织的12.7%。结论 BMSCs通过体外诱导,可在体外分化为较成熟的软骨组织,并构建出组织工程化半月板。     

Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells Promote Liver Regeneration

Background and Aims: Liver regeneration (LR) is of crucial importance to patients with acute liver failure, those undergoing live donor liver transplantations or extended liver resections. Effective treatment strategies aimed at accelerating liver regeneration could offer major benefits in these patients. Due to easy accessibility, human adipose-derived mesenchymal stem cells (HADMSC) are an attractive source for regenerative medicine. Herein, we investigated the effect of HADMSC on LR in a murine model. We hypothesized that HADMSC will promote LR. Methods: Mice were subjected to CCl₄-induced acute liver failure (ALF). Animals in the experimental arm were treated with HADMSC prior to CCl₄-induced ALF. Liver injury was evaluated using serum levels of alanine aminotransferase (ALT), serum interleukin-6 (IL-6), and histopathology. Liver samples were stained for a specific marker of regeneration, proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Results: Histology, serum IL-6, and ALT release revealed that HADMSC treatment attenuated liver injury compared with control animals. In addition, animals treated with HADMSC were observed to have improved survival and increased number of PCNA positive cells on histology when compared with controls. Conclusion: HADMSCs represent a potential therapeutic strategy to promote liver regeneration.     

单倍体造血干细胞联合脐带间充质干细胞移植对再生障碍性贫血的临床观察及其促进造血机制的初步疗效研究

目的 探讨单倍体造血干细胞联合脐带间充质干细胞移植治疗再生障碍性贫血的初步疗效。方法 选取2012年12月至2014年12月间我院收治的5例再生障碍性贫血患者为研究对象,给予患者单倍体造血干细胞联合脐带间充质干细胞移植治疗。术后观察患者回输的MNC、CD34+细胞数,GVHD发生率,血象恢复时间,SDF-1α、G-CSF、IL-6、GM-CSF、TPO、IL-11、SCF等细胞因子变化情况,以及骨髓有核细胞磷酸化ERK1/2蛋白改善情况,并统计并发症发生情况。结果 5例患者均获得造血重建,移植后血小板恢复时间平均为15 d,血细胞恢复时间平均为10.4 d。3例患者发生Ⅲ度a GVHD,3例患者发生局限性c GVHD,经治疗后均好转,4例患者恢复良好,1例患者术后73 d死于真菌性肺炎。移植后患者血清SDF-1α、G-CSF、IL-6、GM-CSF、TPO以及SCF水平明显改善(P<0.05);治疗后骨髓有核细胞磷酸化ERK1/2蛋白明显高于治疗前(P<0.05);1例患者EB病毒血症,2例出血性膀胱炎,2例真菌性肺炎。结论 单倍体造血干细胞联合脐带间充质干细胞移植治疗再生障碍性贫血疗效显著,能够明显改善患者骨髓造血微环境,安全且并发症低,值得进一步开展临床应用研究。     

骨髓间充质干细胞向“类精子”分化的动物实验鉴定

目的:鉴定骨髓间充质干细胞(MSCs)异体移植后是否分化为“类精子”。方法:①制作睾丸去势的动物模型:取4周龄雄性白色BALB/c小鼠40只,用环磷酰胺腹腔注射法制作睾丸绝育的动物模型,随机分成实验组和对照组各20只;②制备种子细胞(MSCs):取5~6周龄雄性灰色129小鼠10只,以Percoll密度梯度离心法和贴壁法相结合的方法分离、培养、纯化MSCs。待细胞生长至数量足够多时,用生理盐水制备成浓度为1×106/ml的细胞悬液;③异种系小鼠MSCs睾丸异体移植:实验组用盲打法给每只小鼠睾丸注射上述制备的129小鼠的MSCs悬液。对照组睾丸注射生理盐水;④移植后的观察:另取8~10周龄雌性白色BALB/c小鼠40只,分别与实验组和对照组的40只雄性小鼠按雌雄1∶1合笼,观察雌鼠受孕情况。结果:实验组:有8只雌鼠分别于合笼后31~46(平均38.5)d怀孕,受孕率为40%,产下的小鼠皆为白色。对照组:1只雌鼠怀孕,受孕率为5%,产下的小鼠为白色。子代鼠皆为白色,提示129小鼠的MSCs未能分化为有功能的“类精子”,使BALB/c小鼠的子代携带129小鼠的基因而呈现预想中的黑白相间的“花色”。两组受孕率差异有显著性(P<0.05),提示MSCs对睾丸损伤有促进愈合作用。结论:异品系的MSCs睾丸移植后未能分化为有功能的“类精子”,但对睾丸损伤有促进愈合作用。     

大鼠SERTOLI细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化的影响

目的探索Sertoli细胞(SCs)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂、成骨和成神经诱导分化的影响。方法密度梯度离心法分离BMSCs,二步酶消化法分离SCs;对第3、4代BMSCs进行成脂、成骨及成神经诱导,并与SCs共培养,观察其形态学变化。结果油红O染色显示BMSCs成脂诱导后,胞浆出现折光性强的脂滴,加入SCs后,脂滴明显减少,染色不明显;茜素红S染色显示BMSCs成骨诱导后可显示钙结节,加入SCs后,钙结节更多,结节内红染更明显;成神经诱导在加入SCs前后没有明显差异。结论 SCs可促进BMSCs成骨分化,而抑制其成脂分化,对成神经分化则没有明显影响。     

长期体外培养对人脐血间充质干细胞成骨分化潜能的影响

目的观察体外长期培养对人脐血间充质干细胞（Human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells,UCB-MSCs）成骨分化潜能的影响,探讨其作为组织工程骨种子细胞的可行性。方法流式细胞技术观察长期体外培养的UCB-MSCs细胞表面抗原表达的变化规律,并通过Alizarin Red染色及碱性磷酸酶活性、骨钙蛋白含量和钙离子含量的检测观察长期体外培养对UCB-MSCs成骨特性的影响。结果第10代之前的UCB-MSCs能够高表达间充质干细胞表面标志物,7代之前的细胞体外增殖能力不随传代次数而发生明显变化。Alizarin Red染色及碱性磷酸酶活性、骨钙蛋白含量和钙离子含量的检测显示8代之前的UCB-MSCs仍能保持较强的成骨分化能力。结论7代之前的UCB-MSCs能保持稳定的体外成骨分化特性,有望成为较理想的组织工程骨种子细胞。     

家兔作为胎龄期骨髓间充质干细胞动物模型的实验研究

目的建立以家兔为对象的胎龄期BMSC研究动物模型。方法通过人工授精方法,获得孕期3周的孕兔4只,行剖腹产术取出胎兔20只,冲取胎兔骨髓,以贴壁培养法进行体外扩增培养。测量第3代胎兔BMSC的生长曲线,克隆形成率,并进行成骨、成脂及成软骨诱导分化。另外,将原代细胞冻存30 d后复苏,测量其第3代生长曲线,对冻存前后增殖能力的变化进行观察。扫描电镜观察胎兔BMSC与β-TCP形成细胞材料复合物的体外形态。将BMSCs-β-TCP复合物植入裸鼠皮下,于术后1、3、6个月分别取材,行HE、VG、Masson染色观察。结果胎兔来源的BMSC于倒置相差显微镜下观察,细胞饱满均匀,呈梭形或倒三角形状;传代后各代细胞形态未发生明显变化,生长曲线相差不大;成骨、成脂以及成软骨诱导观察到钙结节、脂肪空泡、黏多糖。冻存30 d后复苏,其第3代生长曲线与冻存前相比未见明显变化。电镜下观察,与β-TCP复合7 d后,细胞能均匀紧密贴合于材料上,伸展良好分布均匀。植入裸鼠皮不同时间点取材行HE、VG、Masson染色,均显示有新生骨组织生成。结论以家兔为研究动物模型,可以在胎龄期获取并分离得到BMSC,并可在异位构建组织工程骨,是间充质干细胞动物研究的新选择。     

A Technique for Systemic Mesenchymal Stem Cell Transplantation in Newborn Rat Pups

ABSTRACT

Mesenchymal stem cells (MSC) have the potential to aid tissue regeneration. Intravenous (IV) MSC administration is currently being assessed following tissue injury. However, few studies have been performed to establish a safe and effective method of IV MSC infusion for newborns. We have established a safe, nontraumatic and effective technique for systemic MSC transplantation in newborn rats. Yellow-fluorescent-protein (YFP)-labeled MSC were characterized using MSC markers and their differentiation potential was confirmed. Rat pups were delivered by C-section on gestational day 21. The umbilical vein (UV) was cannulated and used for IV injection of MSC or saline control, which was performed under ultrasonographic imaging. An additional control group consisted of UV MSC injection in adult mice. Mean operating time, success rate of cannulation and death rate were recorded. YFP-MSC quantification in multiple organs was performed. Mean operating time was 3.9 ± 1.1 min. The success of UV MSC injection was 92.8%. The immediate and 24 hr delayed death rate for rat pups was significantly lower than that of adult mice (p < .05). No pups receiving saline injection died. After locating the patent foramen ovale (PFO) of newborn pups by ultrasonographic imaging, extra pulse-waves and wave-shape changes were detected when MSC were injected. The number of YFP-MSC was 15.8 ± 4.1 cells per visual field (CPVF) in the lungs, 2.9 ± 1.2 CPVF in the heart, and 19.8 ± 5.0 CPVF in the intestines. We conclude that IV MSC infusion through the UV is a convenient, safe, and effective method for systemic MSC transplantation in prematurely delivered newborn rats.