应用噬菌体随机肽库筛选2型登革病毒E蛋白的抗原表位

【目的】通过型特异性单抗与噬菌体随机 12肽库的生物淘洗 ,确定 2型登革病毒E蛋白分子的抗原表位。【方法】以DEN2型特异的E单克隆抗体作为筛选分子 ,生物淘洗噬菌体随机 12肽库 ,将筛选的噬菌体阳性克隆进行ELISA检测、DNA序列测定及展示肽的氨基酸序列推导 ,通过展示肽序列与DEN2E蛋白的氨基酸一级结构的对比 ,确定E蛋白的抗原优势表位并用相应的合成肽验证。【结果】常规生物淘洗获得富含芳香族氨基酸并有aHWbW核心结构的克隆 ,确定为非特异的塑料结合噬菌体。改进淘洗方法后 ,肽库筛选的噬菌体阳性克隆有共同的结构模体WFKKGS ,与DEN2E蛋白分子的 390～ 397有 3～ 5个氨基酸相同。其对应的合成 10肽能与淘洗单抗特异反应 ,并可抑制噬菌体阳性克隆与该单抗结合。【结论】本实验通过噬菌体随机肽库的生物淘洗确定DEN2E蛋白 390～ 397氨基酸残基 (WFKKGSSI)存在一线性的B细胞抗原表位。     

O1群小川型霍乱弧菌单克隆抗体识别表位模拟肽的筛选鉴定

【摘　要】目的：以纯化的有高度特异性的IXiao3G6单抗为靶分子,对噬菌体随机7肽库进行淘筛,以期筛选到与O1群小川型霍乱弧菌单抗有高亲和力的模拟肽,为基于表位的霍乱弧菌模拟多肽疫苗的研制奠定基础。方法：运用噬菌体随机7肽库技术,以纯化的IXiao3G6单抗为靶蛋白,进行噬菌体随机肽库 3 轮筛选,以双抗夹心ELISA和竞争抑制实验分析获得的噬菌体短肽与筛选配基的结合能力及特异性,并进行阳性克隆序列测定和同源性分析。结果：3轮筛选后,阳性噬菌体得到有效富集,夹心ELISA检测随机挑取的25个噬菌体克隆,有22个噬菌体克隆为阳性,测序表明其中20个阳性克隆的氨基酸序列完全一致,均为APAIPAS。对该序列同源性分析,未发现有相同的已知序列。竞争抑制实验表明,O1群小川型霍乱弧菌脂多糖（lipopo-lysaccharide,LPS）能很好地抑制阳性克隆与IXiao3G6 McAb的结合,抑制程度随LPS浓度的升高而增加,而对照细菌的LPS则不具有相应的抑制作用,进一步提示噬菌体克隆展示肽模拟了O1群小川型霍乱弧菌LPS抗原表位。结论：筛选到模拟O1群小川型霍乱弧菌LPS的抗原表位的模拟肽,为基于表位的霍乱弧菌模拟多肽疫苗的开发与设计提供了实验依据。     

汉坦病毒核衣壳蛋白mAb B11模拟结合肽的筛选和鉴定

目的：应用噬菌体展示肽文库筛选可与肾综合征出血热病毒mAb B11特异性结合的短肽。方法：采用Protein-A亲和纯化的单抗为筛选配基，对噬菌体展示的随机12肽文库进行生物亲和淘选，夹心ELISA、竞争ELISA鉴定筛选克隆的结合特性，并进一步对阳性克隆进行序列测定和分析。结果：通过4轮淘选，ELISA测定显示筛选到的噬菌体短肽多数能与B11单抗特异性地结合（12／15），序列分析表明8个阳性克隆氨基酸序列分为4组，同源性分析显示核心序列可能为（M／F）HR（H／T）X（H／W）或（R／F）HX（H／T）P（W／M）（L／Y）。结论：基于表位水平的HFRSV特异性诊断试剂的研制和小分子多肽疫苗的设计提供了重要依据     

细胞间黏附因子1(Ⅰ区)模拟肽的筛选及初步鉴定

目的 筛选表达细胞间黏附因子1（ICAM－1）（Ⅰ区）模拟肽的特异噬菌体克隆,为研制抗脑型疟黏附肽类药物奠定基础。方法 以抗ICAM－1（Ⅰ区）的单抗15．2为靶,采用亲和筛选法对噬菌体随机十二肽库进行3轮筛选,通过ELISA及竞争抑制试验初步鉴定了获得的噬菌体短肽与单抗15．2之间的结合特性。结果 从第3轮洗脱液中挑选20个噬菌体克隆进行夹心法ELISA检测,其中18个克隆OD值超过阴性对照2．1倍以上,阳性率达90％。竞争性ELISA试验表明多数阳性噬菌体与ICAM－1能竞争性地与15．2单抗结合。结论 阳性噬菌体表达的短肽可能是15．2单抗所识别的模拟表位。Ⅰ     

应用噬菌体肽库筛选Endoglin的结合肽

目的 利用噬菌体12肽库筛选可与Endoglin结合的活性小分子肽.方法 以rhEndoglin为靶分子,对噬菌体12肽库进行亲和筛选.经过3轮筛选,随机挑取16个克隆,双夹心ELISA法鉴定其亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体克隆的DNA序列,推断出与噬菌体外壳蛋白融合的氨基酸序列,竞争抑制实验检测优势克隆的特异性.结果 竞争性ELISA显示6个噬菌体克隆与rhEndoglin有较强的结合活性,经测序获得5种不同的多肽序列,其中2个克隆的氨基酸序列为:AHKHVHHVPVRL.结论 噬菌体随机肽库技术可以获得Endoglin结合肽的蛋白质序列.     

脂多糖结合蛋白与CD14结合位点模拟肽的初步筛选

目的 应用噬菌体随机12肽库筛选脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)与CD14结合位点的多肽序列.方法 以CD14为固相筛选分子,对噬菌体12肽库进行4轮亲合筛选,采用酶联免疫吸附(ELISA)法鉴定筛选后的噬菌体克隆与CD14的结合活性,取结合活性较高的克隆进行DNA测序,推导其多肽序列并与LBP序列比对,再进行竞争抑制实验检测筛选噬菌体与LBP竞争结合CD14的效力.结果 挑取的20个噬菌体克隆中,16个结合实验鉴定阳性,取6个亲和力最高的克隆测序,得到3条不同编码的12肽序列(FHRWPTWPLPSP、MHRHPPPITLPL和AAFHRAHHLTSP),3条多肽与LBP一级结构同源性低,为模拟肽.6个噬菌体克隆有较高的竞争抑制率.结论 用噬菌体12肽库成功筛选出LBP与CD14结合位点的模拟肽.     

噬菌体随机肽库筛选MUC1抗原模拟表位

目的噬菌体随机多肽文库筛选及鉴定MUC1抗原的模拟表位。方法利用纯化获得的BC2抗体筛选噬菌体随机7肽库,通过夹心ELISA分析噬菌体克隆,测定阳性克隆DNA序列并进行同源性及氨基酸分析,竞争性抑制实验鉴定噬菌体克隆。结果经3轮筛选,获得了30个阳性克隆,DNA序列分析并推导出氨基酸序列:TAPDLRP、SAPDLRP、AAPDSRP及LAPDFRP。鉴定结果表明:4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上。结论所得序列TAPDLRP、SAPDLRPAAPDSRP及LAPDFRP模拟MUC1抗原表位。     

恶性疟原虫EBA-175与血型糖蛋白A结合位点的鉴定

目的 探索EBA-175与GPA之间的结合信息,为疟疾短肽疫苗及拮抗药物的研制奠定基础.方法 以EBA-175重组蛋白为靶,采用亲和筛选法对噬菌体随机十二肽库进行3轮筛选,通过ELISA、竞争抑制试验、Dot-ELISA及Western blotting等方法鉴定获得的噬菌体短肽与EBA-175之间的结合特性.对阳性克隆进行DNA序列测定,推导其十二肽的氨基酸序列并与GPA氨基酸全序列进行了同源性比较.结果 经3轮亲和筛选后,结合噬菌体得到良好富集.从第3轮洗脱液铺制的琼脂板中随机挑取30个噬菌体单克隆,ELISA检测有27个为阳性,阳性率达90%.竞争性ELISA显示多数阳性噬菌体能竞争抑制EBA-175与其单抗结合.DNA及氨基酸序列分析表明24个噬菌体展示十二肽中共有序列IRR与GPA的114-116位氨基酸同源.结论 阳性噬菌体表达的短肽是EBA-175所识别的模拟表位,IRR几位氨基酸可能对EBA-175与GPA的结合起重要作用.     

用噬菌体随机12肽库筛选单纯疱疹病毒2型gD基因模拟抗原表位的研究

目的用针对HSV-2gD的单克隆抗体（McAb）从噬菌体展示随机12肽库中筛选HSV-2gD基因的抗原模拟表位，寻找更有效的小片段短肽作为HSV新型基因工程疫苗的候选抗原。方法利用HSV gD McAb淘筛噬菌体随机12肽库，经“吸附-洗脱-扩增”的4轮筛选，随机挑取噬菌体克隆经酶联免疫吸附实验（ELISA）进行鉴定，并对阳性克隆所携带的外源DNA片段进行序列测定和计算机辅助分析。结果经4轮生物淘筛后特异性噬菌体克隆得到了富集，对阳性克隆的分析结果表明P-PLW和PYH--H氨基酸序列是模拟妒基因抗原表住的骨架结构，携有此短肽的噬菌体可以与McAb特异结合。结论从噬菌体随机12肽库中筛选到的外源序列可以模拟HSV-2 gD McAb针对的抗原表位，可能是HSV-2gD一个抗原表住的替代抗原，为进一步研究HSV-2基因疫苗奠定了基础。     

利用噬菌体肽库技术筛选SARS病毒N蛋白表位模拟肽

目的 获得具有生物学活性的SARS病毒N蛋白表位模拟肽。方法 以抗SARS病毒N蛋白的单克隆抗体作为固相筛选分子，免疫筛选噬菌体随机十二肽库，并采用夹心ELISA、竞争抑制试验鉴定阳性克隆，最后用合成肽技术进行表位鉴定。结果 经噬菌体富集后，从随机筛选的各46个克隆中得到N蛋白的2个不同表位， mAb C008 对应表位氨基酸序列为GXLXTPXXXXGT；mAb C039 对应表位氨基酸序列为TTLPXXXXAXXX。结论 用噬菌体随机12肽库成功筛选得到SARS N蛋白2个不同表位，为下一步开展用SARS表位研究病毒的制病机制、诊断、疫苗及治疗等奠定了基础。     

SELECTION OF NEW EPITOPES FROM MONOVALENT DISPLAYED PHAGE OCTAPEPTIDE LIBRARY

INTRODUCTIONOverthelastfewyears,enormousproteinsandpeptideshavebeenfusedtothecoatproteinsoffilamentousbacteriophage.Thesefusedproteinsandpeptidesweredisplayedontheviralsurfaceandretainedtheirbiologicalactivities.Suchasantibody(Ah)variabledabmains(l)fAhFabfragment(2),repeatsoftheCircumsporzoiteproteinofthehumanmalariaparasite(3)andfragmentOfHIV-1GagP24(4).MostoftheexperimentalreportsthusfarhavebeenbasedontheexpressionsystemoriginallydevisedbySmith(5),inwhichtheforeignproteinsandpeptide…     

从噬菌体随机肽库筛选庚型肝炎病毒E2抗原表位

目的：筛选能识别庚型肝炎病毒（ＨＧＶ） Ｅ２区的单克隆抗体和有竞争抑制活性的多肽。方法：利用抗ＨＧＶ Ｅ２区的３株单克隆抗体Ｍ６,Ｍ１３,Ｍ３０作为筛选配基,对构象限制性的随机环９肽库进行亲和筛选,并对阳性噬菌体克隆进行功能鉴定。结果：证实亲和筛选具有良好的富集效果后,随机挑出１６个噬菌体克隆进行交叉结合实验,有１４个克隆与Ｍ６抗体有较强的特异结合;其中１０个克隆在竞争抑制实验后中抑制率大于５０％     

噬菌体展示肽库筛选大肠癌细胞特异性结合肽的实验研究

目的 筛选人源大肠癌LoVo细胞株特异结合的短肽,作为大肠癌靶向治疗的载体.方法 以大肠癌LoVo细胞株作为靶细胞,人正常结肠黏膜上皮细胞为吸附细胞对噬菌体展示环七肽库进行差减筛选,采用细胞ELISA与免疫荧光检测鉴定噬菌体阳性克隆并测序.结果 对噬菌体展示环七肽库进行3轮筛选后,从随机挑取的20个噬菌体克隆中获得5个能与大肠癌LoVo细胞特异结合,而不与人正常结肠黏膜上皮细胞结合的阳性克隆,其氨基酸序列含有保守序列RPMP.结论 利用噬菌体展示肽库技术,可以成功筛选到大肠癌细胞的特异性结合肽,可能成为大肠癌靶向治疗的载体.     

可结合细胞表面IL-2Rα的短肽分子的筛选

目的利用噬菌体肽库技术筛选可特异性结合IL-2Rα的短肽序列，探索获得IL-2Rα小分子拮抗剂的可能性。方法以高表达IL-2Rα的MT-2细胞为钓饵。筛选噬菌体线性12肽库。用抗IL-2Rα单克隆抗体竞争洗脱结合的噬菌体，细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆，并测序。结果随机挑选的17个克隆中有7个可与MT-2细胞结合。免疫组化显示阳性噬菌体克隆M15可与MT-2细胞及PHA刺激的PBMC结合。根据阳性克隆DNA序列，推导出氨基酸序列，共有6种序列，富含亲水氨基酸并包含Tyr、Phe、Leu保守残基。结论得到含Tyr、Phe保守残基的序列，阳性序列可结合细胞表面的IL-2Rα。     

弓形虫有效抗原表位的筛选及其对小鼠免疫保护性的研究

目的:利用噬菌体随机肽库技术筛选弓形虫抗原的有效表位，并探讨其免疫保护效果。方法：用纯化的弓形虫免疫兔血清IgC对噬菌体12肽库进行三轮筛选，对获得的日的噬菌体用间接ELISA和Dot—ELISA检测其特异性，并对其中的某些克隆进行Western—blot分析和序列测定；用混和噬菌体克隆及强阳性表位克隆免疫BABL／c小鼠．间接ELISA法测定其特异性抗体滴度，攻击感染后观察小鼠存活情况。结果：经三轮筛选，特异性噬菌体得到富集，随机挑取18个克隆经间接ELISA和Dot—ELISA鉴定，有16个克隆能与弓形虫免疫兔血清IgG呈特异性反应。Western—blot分析显示P2克隆能被免抗弓形虫血清所识别，具有类似于弓形虫抗原的免疫原性，其序列为5’-CTTCAGTTGGATCGGGCTCGGTTTTGGAAT CAGGGT-3’，与GenBank的弓形虫已知序列无一级结构的同源性；与原肽库对照组相比，P2实验组和P总实验组免疫小鼠均能诱导出较高滴度的IgG抗体，抗攻击感染后小鼠的存活率及存活时间也均高于对照组。结论：利用噬菌体随机肽库技术获得了弓形虫抗原的有效模拟睥位，这些表位能诱导对弓形虫的部分保护作用。     

阿尔茨海默病Aβ人抗体可变区片段基因的克隆和表达

目的 筛选出β淀粉样蛋白40 (Aβ40)的人源抗体单链可变区片段,克隆单链抗体的基因并在原核生物大肠杆菌表达,为阿尔茨海默病的诊断和治疗开辟新的途径。方法 先将Aβ40包被在免疫反应板上,后用来自正常人外周血淋巴细胞的单链抗体文库结合。经过5轮的生物淘金法筛选,从最后一轮噬菌体感染的大肠杆菌TGl中随机挑选55个克隆进行ELISA测试,筛选出Aβ40特异的单链抗体并对其进行基因测序。将人源抗体单链可变区片段基因克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上,转化大肠杆菌BL21表达谷胱甘肽-s-转移酶(GST)融合的单链抗体。结果 ELISA测试表明,55个克隆中有33个克隆能结合Aβ40,Aβ40对10个克隆的竞争抑制率达到50％以上,而其中5个克隆的抗原结合表位在Aβ40的氨基端1-16个氨基酸之间。DNA测序结果发现,Aβ40单链抗体基因由768bp组成,推导得到的氨基酸序列具有典型的抗体可变区结构。将单链抗体基因克隆到原核表达系统中诱导表达,得到相对分子质量为55000的GST融合抗体表达产物。结论利用非免疫途径筛选出阿尔茨海默病发病中起关键神经元毒性作用的Aβ40的人源抗体单链可变区片段,为该抗体的表达和临床应用打下了基础。     

人巨细胞病毒PPUL44蛋白单克隆抗体CH13抗原决定簇位点的确定

目的 :确定人巨细胞病毒 PPU L44蛋白单克隆抗体 CH13在 PPU L44上的抗原决定簇位置 ,探讨随机多肽文库在研究相互作用蛋白质的氨基酸序列方面的应用。方法 :用 CH13在一个随机多肽文库中筛选出能与CH13结合的克隆 ,测定上述克隆随机多肽的 DNA序列 ,用随机多肽的氨基酸同源序列与 PPUL44蛋白质的氨基酸序列比较。结果 :能与 CH13结合的随机多肽的氨基酸序列显示出高度的一致性 ;随机多肽同源序列NEGEAFGPDVSG与 PPUL44蛋白位于第 32 1～ 332的氨基酸序列高度同源 ;而随机多肽序列 FQIL VCVESVL R与 PPU L44位于第 181～ 184的氨基酸序列有 4个相邻的氨基酸一致。结论 :CH13的抗原决定簇位于 PPU L44蛋白第 32 1～ 332氨基酸序列附近 ;CH13与 PPU L44位于第 181～ 184氨基酸序列可能有一定反应。随机多肽文库在研究相互作用蛋白质的氨基酸序列方面具有广泛的应用前景。     

Neuropilin-1高亲和肽的筛选及初步鉴定

目的:利用合成的重组Neuropilin-1的蛋白分子对噬菌体随机七肽库进行筛选,以期获得能与Neuropilin-1分子具高亲和活性的小肽分子,并对其功能进行初步鉴定。方法:对包被好的rhNeuropi-lin-1蛋白,经过三轮"吸附-洗脱-扩增"后,ELISA鉴定阳性克隆,DNA测序和分析,竞争抑制试验进一步分析其相关化学合成多肽的功能。结果:经3轮亲和筛选后,噬菌体克隆得到有效富集,ELISA鉴定结果显示2个阳性克隆具有较强结合活性。DNA测序显示其具有*FPS***的一致基序。阳性克隆与Neuropilin-1分子的结合能被其相关化学合成多肽FITC-DFPSPLW所抑制。结论:利用噬菌体随机展示肽库技术获得了与Neuropilin-1分子具特异性结合能力的小肽分子,为进一步基于Neuropilin-1的肿瘤血管生成抑制的研究奠定基础。     

Screening of mimotope of Salmonella typhimurium lipopolysaccharide from phage-displayed peptide]

OBJECTIVE: To identify and characterize the mimotope of lipopolysaccharide (LPS) from cyclic 7-mer phage peptide library. METHODS: Cyclic 7-mer phage-displayed peptide library was screened using monoclonal antibody 2F4 (mAb 2F4) against Salmonella typhimurium LPS as the target, and the selected clones were tested by sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and specific antigen inhibition ELISA. RESULTS: After 3 round of screening, 34 of the 38 selected clones were identified as positive for binding to mAb 2F4. Salmonella typhimurium LPS was capable of inhibiting the binding between the cones and mAb 2F4, with the 50% inhibitory concentration of all the positive clones within the range of 0.125-0.250 microg/ml. Sequence analysis was performed for 10 of the positive clones, whose amino acid sequences were subsequently deduced, and 7 of them had conservative amino acid of P-X-WAS-X-W with the mean hydrophobic amino acid content of 71.4% in all the sequences. CONCLUSION: The phage-displayed peptide is capable of simulating the epitope of Salmonella typhimurium LPS.