乳腺癌组织miR-20a的表达及其对乳腺癌细胞自噬的影响

目的 探究乳腺癌患者肿瘤组织中miR-20a的表达情况及其对乳腺癌细胞自噬功能的作用。 方法 收集芜湖市第一人民医院2016年1月至2017年12月间收治的接受手术治疗的乳腺癌患者56例,逆转录实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测肿瘤组织与癌旁组织miR-20a与自噬相关基因Beclin1、LC3、ATG5及ATG7 mRNA的表达水平。脂质体法转染pcDNA3/pri-miR-20a质粒至MCF7细胞,免疫蛋白印记实验检测Beclin 1与饥饿条件下LC3Ⅱ表达水平,免疫荧光实验检测自噬斑点。 结果 肿瘤组织miR-20a的平均表达水平为211.35±67.43,癌旁组织miR-20a的平均表达水平为126.72±24.37,差异有统计学意义(P<0.05)。此外,肿瘤组织较癌旁组织Beclin1 mRNA表达量降低(P<0.05),ATG5、ATG7与ATG12 mRNA的表达量差异无统计学意义 (P>0.05)。过表达miR-20a后MCF7细胞Beclin1蛋白表达量降低,饥饿刺激下LC3Ⅱ表达水平降低且自噬斑点减少。 结论 乳腺癌组织中miR-20a呈高表达,并且降低自噬调节蛋白Beclin1的表达以抑制自噬活化。     

大鼠Smad 7基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的：构建并鉴定大鼠Smad7/pcDNA3.1（＋）真核表达质粒,为进一步研究Smad7的抗肝纤维化作用提供实验基础。方法：TRIzol法抽提大鼠肝组织总RNA,琼脂糖凝胶电泳检测其完整性,紫外分光核酸蛋白分析仪测定其浓度与纯度,两步法获取大鼠Smad7cDNA片段,CaCl2法制备感受态细胞,应用EcoRI及XhoI在pcDNA3.1（＋）多克隆位点处进行双酶切,切胶回收载体及目的片段酶切产物,将回收的线性化pcDNA3.1（＋）与Smad7cDNA连接,构建Smad7/pcDNA3.1（＋）重组质粒,转化DH5α大肠杆菌,测序鉴定双酶切证实的阳性克隆。结果：电泳检测RNA的完整性良好,28S约为18S的2倍,A260/A280=1.986,纯度较好,阳性克隆酶切后电泳检测在DNAMarker1.3kb处见Smad7目的片段,5.4kb处见线性化pcDNA3.1（＋）,与预期结果相符,质粒重组成功,并测序证实。结论：大鼠Smad7真核表达质粒构建成功,为进一步单独或联合其他质粒从TGF-β/SMAD信号传导的不同环节干预肝纤维化提供了实验基础。     

基因1b型不同准种株HCV核心蛋白真核表达质粒的构建及表达

目的 构建基因1b型丙型肝炎病毒(HCV)不同准种株截短片段核心蛋白(CP)绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白表达质粒.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增获得等长度片段的CP基因:氨基酸(aa)长度为癌中心株(T)∶T∶1-172 aa、癌旁株(NT)∶1-172 aa及C191(HCV-J6)∶1-172 aa,扩增产物用Nhe I及EcoR I双酶切后将其插入到真核表达质粒pEGFP-N1中,转染不同细胞系,用荧光显微镜及流式细胞仪观察GFP的表达.结果 PCR扩增、序列分析验证,T、NT及C191截短片段CP基因均成功克隆到pEGFP-N1中,在转染HepG2、chang-liver 48h后,用荧光显微镜及流式细胞仪均观察到GFP的表达.结论 构建基因1b型HCV不同准种株截短片段CP的真核表达质粒获得成功,可用于不同准种株CP的功能研究.     

苦参碱对肝癌细胞增殖及其细胞自噬的影响

目的探索苦参碱对肝癌HepG2细胞增殖及其细胞自噬的影响,为临床探索有效的肝癌综合治疗方案提供实验依据。方法采用MTF法和流式细胞仪检测肝癌HepG2细胞增殖抑制率及其细胞周期的变化;荧光显微镜定性观察肝癌细胞自噬情况。结果苦参碱抑制肝癌HepG2细胞的增殖,且随苦参碱浓度的增加和时间的延长,肝癌HepG2细胞的抑制率增加（P〈0．05）。流式细胞仪检测示：苦参碱组细胞周期中G1期细胞增多,S期细胞减少（P〈0．05）。荧光显微镜检测：肝癌HepG2细胞质中有自噬体形成,且随苦参碱浓度的增加,自噬体越来越多。结论苦参碱对肝癌HepG2细胞增殖有一定的抑制作用,苦参碱抑制肝癌细胞的同时诱导了自噬的产生。苦参碱诱导肝癌HepG2细胞自噬多发生在细胞周期的G1期。     

绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体的构建

目的：构建绿色荧光蛋白（GFP）标记的人脂联素（Adiponectin）真核表达质粒。方法：用本实验室已构建好的人脂联素克隆载体pMD18—T／Adiponeetin为模板，结合已设计好的特异性引物。采用PCR方法克隆出Adiponectin目的片段，将该目的片段再连至真核表达载体pcDNA3．1／CT—GFP—TOPO上，转化入TOP10感受态细胞中，通过筛选得到融合有绿色荧光蛋白的重组质粒pcDNA3．1／CT—GFP—TOPO—Adiponectin。结果：PCR获得长度为736bp的目的片段，经pcDNA3．1／CT—GFP-TOPO真核表达载体连接、筛选及序列分析后，证实所插入的目的片段与genebank检索的人脂联素cDNA序列（Accession NM-004797）100％配。结论：绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体构建成功。     

SARS-3CL蛋白酶基因在杆状病毒载体中的构建及其转染

目的:构建SARS冠状病毒3CL蛋白酶基因的杆状病毒重组供体质粒,包装重组3CL蛋白酶的杆状病毒,感染昆虫细胞进行表达.方法:首先扩增含3cl-Teagy和pFagtBac HTh的转化菌,用酶切连接法构建重组转座质粒pFB HTb-3cl.将该质粒转化E.coli DH10Bac感受态菌,在菌体内进行重组,并经三重抗性和蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒Bacmid-HTb-3cl,对重组质粒Bacmid-HTB-3cl进行纯化并转染St9昆虫细胞包装杆状病毒,利用病毒感染St9昆虫细胞并进行蛋白表达.利用SDS-PAGE检测蛋白表达情况.结果:成功构建了重组表达载体并得到了重组杆状病毒,SDS-PAGE检测到有3CL蛋白酶表达.结论:3CL蛋白酶在昆虫细胞中的表达为蛋白活性的检测及抑制剂的筛选奠定了基础.     

双启动子shRNA真核表达载体的构建

目的:构建含有双启动子的shRNA真核表达载体.方法:通过PCR分别扩增带有BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ酶切位点的人U6启动子序列(U6-B/E)和带有Bgl Ⅱ、HindⅢ酶切位点的人U6启动子序列(U6-B/H),用BamH Ⅰ与EcoRⅠ双酶切pcDNA3.1(+)与PCR产物U6-B/E后进行连接,重组质粒命名为psPRO.再用BglⅡ与HindⅢ双酶切psPRO与PCR产物U6-B/H后进行连接,构建含有双启动子的shRNA真核表达载体.结果:酶切鉴定以及DNA测序结果显示载体构建成功.结论:构建双启动子的shRNA真核表达载体,使其在细胞中表达2个不同的siRNA,不仅筛选方便,而且可以通过建立这种模式化工具载体,为今后RNA干扰实验研究的开展和深入提供手段.     

Claudin-1荧光真核表达载体的构建及其在HepG2肝癌细胞中的表达

目的构建pDsRED1-Claudin-1重组质粒,并在HepG2肝癌细胞中进行表达。方法采用基因重组技术构建含Claudin-1开放读码框(ORF)基因的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRED1-Claudin-1。经PCR、酶切和DNA测序鉴定,通过脂质体法转染HepG2肝癌细胞后,进行荧光检测和Western blot分析。结果成功构建真核表达质粒pDsRED1-Claudin-1,转染HepG2细胞后,经荧光检测和Western blot分析可见Claudin-1红色荧光融合蛋白正确表达。结论成功构建含Claudin-1 ORF基因的红色荧光蛋白报告载体,并在HepG2肝癌细胞中正确表达。     

有氧运动对小鼠主动脉自噬相关因子表达的影响

目的 研究有氧运动对小鼠主动脉自噬相关因子表达及自噬活化的影响。方法 将8周龄C57BL/6雄性小鼠40只随机分为安静对照组（n=20）与有氧运动组（n=20）,其中10只用于Real-Time PCR实验,10只用于Western-blot实验,有氧运动组小鼠进行6周的游泳运动（60 min/d,5 d/周）,对照组小鼠自由活动。6周后取小鼠胸腹主动脉,采用Real-Time PCR方法检测自噬相关因子ULK1、Beclin1、LC3B mRNA水平;Western-blot方法检测主动脉LC3B蛋白中LC3B-II/LC3B-Ⅰ比值及p62蛋白水平。结果 与对照组相比,有氧运动组小鼠主动脉ULK1、Beclin1、LC3B mRNA水平明显升高（P<0.05）;有氧运动组小鼠主动脉LC3B-II/LC3B-Ⅰ比值增大（P<0.05）,p62蛋白降解增加（P<0.05）。结论 有氧运动能够使主动脉ULK1、Beclin1、LC3B自噬相关因子表达增强,进而增强主动脉自噬活性。     

弓形虫SAG1基因在HeLa细胞表达的研究

目的 :研究弓形虫 SAG1基因在 He L a细胞中的表达 ,为研制弓形虫疫苗奠定基础。方法 :采用磷酸钙 -DNA共沉淀转化法将重组质粒 pc DNA3- SAG1导入 He L a细胞 ,用 G418进行选择培养 ,筛选出表达阳性的细胞克隆 ,再通过培养和加压 ,建立稳定分泌 SAG1抗原的阳性 He L a细胞克隆株 ,分离表达产物 ,进行 SDS- PAGE、Western blot分析。结果 :采用钙沉淀法成功地将重组质粒 SAG1导入 He L a细胞 ,通过 G418选择和加压培养 ,获得稳定分泌 SAG1抗原的阳性 He L a细胞 ,表达的蛋白经 SDS- PAGE、Western blot分析 ,显示其分子量 30 k Da蛋白 ,与理论值相符。结论 :成功构建重组质粒 pc DNA3- SAG1,建立稳定分泌 SAG1抗原的阳性 He L a细胞克隆株     

丙型肝炎病毒基因免疫重组真核表达质粒构建的初步研究

目的:利用真核表达载体pCDNA3.1(+)与HCV核心区基因重组,为进一步表达蛋白打基础。方法:首先从1例HCV感染者血清中用反转录-PCR法获得全长的核心区基因并测序,继而将其克隆到原核表达载体pQE-30上并使之在大肠杆菌中得到表达,然后将核心区基因与真核表达载体pCDNA3.1(+)重组,构建重组体。结果:HCV核心区基因为HCV型,将其克隆到原核表达载体pQE-30上并使之在大肠杆菌中得到表达,分子量为22KD,表达量占菌体蛋白的8.7%。然后将核心区基因与真核表达载体pCDNA3.1(+)重组,构建了pCDNAHCVc191和pCD-NAHCVc-hIL2两种重组体。结论:pCDNAHCVc191和pCDNAHCVc-hIL2两种重组体,尤其后者是核心区基因与人白介素-2基因融合,可引发更好的基因免疫效果。上述工作奠定了整个HCV基因免疫研究的基础。     

含绿色荧光蛋白及人胰岛素基因的真核表达载体的构建

目的构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人胰岛素基因的重组真核表达载体。方法将人胰岛素基因插入到真核表达载体pIRES2-EGFP的EcoRⅠ和BamHⅠ位点中,构建重组质粒pIRES2-EGFP-INS。酶切鉴定,测序证实。结果重组真核表达载体pIRES2-EGFP-INS经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,电泳后显示360bp的INS的目的片段和5.3kb的pIRES2-EGFP载体片段,进一步测序并证明重组质粒连接正确。结论成功构建了pIRES2-EGFP-INS重组质粒,为简便快速了解胰岛素基因的转染效率奠定了基础。     

携带人生存素基因短发夹RNA表达载体重组腺病毒的构建及其生物学作用

目的构建携带人生存素(survivin)基因短发夹RNA(shRNA)表达载体的重组腺病毒。方法构建并筛选重组质粒pShuttles-urvivin,将其与腺病毒骨架质粒共转染HEK-293细胞,经同源重组产生腺病毒;PCR鉴定并测定病毒滴度;β-半乳糖染色检测病毒对人乳腺癌细胞MCF-7的感染效率;流式细胞术、RT-PCR和W estern免疫印迹法检测其生物学功能。结果经PCR鉴定重组腺病毒构建成功;48 h后感染率达75%以上;腺病毒感染MCF-7细胞后48 h,生存素mRNA和蛋白的表达均受到抑制;腺病毒感染MCF-7细胞后,细胞分裂受阻于G2/M期,在48和72 h有凋亡峰出现。结论成功构建人生存素基因shRNA表达载体的重组腺病毒。     

preS1-preS2-HBsAg真核表达载体的构建及在293细胞中的表达

目的研究含有前S1抗原、前S2抗原的乙肝病毒外膜蛋白(前S1蛋白+前S2蛋白+S蛋白)的跨膜特性。方法依据乙肝病毒大外膜蛋白的计算机模拟图将其分为分别命名为HBsAg1(1-174),HBsAg2(1-245),HBsAg3(1-294),HBsAg4(1-341),HBsAg5(1-373),HBsAg6(1-400),最终累加成一条连续的长链状态,贯穿在细胞内外形成四次跨膜区,并以此6个片段为模板设计6对引物。从含有乙肝病毒外膜蛋白基因的质粒pcDNA3.1-preS1-preS2-HBsAg中扩增出前S1,S2基因,采用重叠延伸PCR方法连接人尿激酶原信号肽+6×组氨酸(His)+前S1蛋白、前S2蛋白+HBsAg(1～6)+血细胞凝集素(HA);PCR产物经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后插入经同样处理的真核表达载体pIRES2-EGFP,构建含有Pro-UK,6×His,preS1,preS2,HBsAg跨膜序列及HA的表达载体pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA,该表达载体应能够共表达乙肝病毒外膜蛋白和绿色荧光蛋白。采用阳离子脂质体法将构建好的表达载体转染293细胞,经G418加压筛选阳性克隆,并进一步通过荧光观察、蛋白质免疫印迹、免疫双标等方法检测目的蛋白在293细胞的表达。结果 PCR结果显示,电泳片段大小符合HBsAg1～HBsAg6片段的600,810,957,1098,1194和1275 bp理论值。酶切鉴定正确的重组质粒测序结果与预期序列完全一致。转染和单克隆筛选后得到转染成功的HBsAg1～HBsAg6的293细胞,呈亮绿色,细胞形态良好,荧光表达强度高;Western印迹结果显示,在相对分子质量31 000,34 000,44 000,47000,54 000和60 000处有明显的阶梯状蛋白信号,条带清晰并与理论值相一致。结论成功构建了含有前S1、前S2蛋白的乙肝外膜蛋白基因的真核表达载体,并获得了能共表达乙肝外膜蛋白跨膜序列和绿色荧光蛋白的293细胞系。     

pCEP4/hIL-17真核表达载体的构建及表达

目的构建pCEP4/hIL-17载体及在真核细胞中表达hIL-17/mFc融合蛋白;初步研究IL-17生物学特性。方法采用RT-PCR的方法克隆hIL-17CDS段基因序列;将测序正确的hIL-17序列插入pCEP4质粒构建pCEP4/IL-17真核表达载体,转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞后,筛选阳性表达细胞株;并用RT-PCR、ELISA和Western blot等法鉴定IL-17基因的mRNA和蛋白表达;流式细胞术分析纯化的蛋白对Raji细胞表达的hIL-17受体的结合能力;以体外实验验证其促炎症作用。结果成功构建了pCEP4/hIL-17重组载体,并在CHO细胞中稳定表达;所获得hIL-17重组蛋白能稳定结合Raji细胞上的IL-17受体;体外刺激HeLa细胞,能明显促进IL-6等炎症因子的分泌。结论稳定表达hIL-17重组蛋白的CHO细胞系的建立,为进一步研究hIL-17的生物学功能奠定了良好的基础。     

VEGFA基因重组真核表达载体的构建与表达

目的 构建VEGFA基因重组真核表达载体pEGFP-VEGFA,并检测其在人胚胎肾细胞(HEK293T)中的表达.方法 以人脐血单核细胞的RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增VEGFA基因,并将其定向插入真核表达载体pEGFP-Nl中,构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA.经限制性核酸内切酶BglII和SalI酶切和DNA测序鉴定后,用脂质体法将pEGFP-VEGFA转染HEK293T细胞,转染后24 h和48 h采用荧光显微镜观察pEGFP-VEGFA的表达.结果 pEGFP-VEGFA被双酶切为4 697 bp和1 251 bp两条条带,测序结果证实VEGFA序列与GenBank公布的VEGFA mRNA序列完全一致.在经转染的HEK293T细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pEGFP-VEGFA成功转染HEK293T细胞,并在其中得到了表达.结论 成功构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA,为进一步研究VEGFA基因的生物学功能奠定了基础.     

sKDR真核克隆表达及其对血管内皮细胞增殖的影响

研究获取可溶性血管内皮生长因子受体2(sKDR)基因构建sKDR的真核表达载体,观察sKDR对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖的影响.方法提取HUVECs总RNA,利用RT - PCR方法扩增KDR胞外免疫球蛋白1-3区基因片段,将其插入真核表达质粒pcDNA3.1中,测序鉴定基因序列正确后,用脂质体法将重组质粒p...     

蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK~R的构建及其在山羊乳腺组织中的表达

目的在山羊奶中表达蚓激酶。方法将含有蚓激酶基因的表达盒插入到逆转录病毒载体pLNCL中获得了蚓激酶重组逆转录病毒载体,转染泌乳期奶山羊乳腺小叶并获得暂时表达。利用脂质体转染PA317包装细胞,G418进行筛选得到阳性细胞克隆,克隆扩大培养后病毒上清感染妊娠期奶山羊乳腺小叶组织,山羊产后采奶纤维蛋白平板溶圈法检测蚓激酶活性。结果产后奶样经纤维蛋白平板溶圈法检测羊奶具有明显纤溶活性。结论蚓激酶基因已经整合到奶山羊乳腺组织并能实现相对稳定的表达。