敲低EN2诱导肝癌细胞凋亡并提高PTEN蛋白的表达

 目的 探讨EN2对肝癌细胞凋亡及细胞中PTEN蛋白表达的影响。方法 用EN2 siRNA慢病毒感染肝癌细胞HuH-7，qRT-PCR和Western blot方法检测干扰效果。MTT方法测定细胞活力变化，PI单染法测定细胞周期分布，Annexin V-FITC/PI双染法测定细胞凋亡变化，Western blot测定细胞中激活型Caspase-3（Cleaved Caspase-3）、激活型Caspase-9（Cleaved Caspase-9）、第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）及细胞周期素B 1( Cyclin B l)蛋白水平，JC-1法测定线粒体膜电位变化，Western blot测定胞浆中细胞色素C（Cytochrome C）蛋白水平。结果 EN2 siRNA慢病毒感染可明显下调肝癌细胞中EN2的表达。沉默EN2表达后的肝癌细胞活力降低，细胞凋亡率升高，细胞G2/M期比例升高，细胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、PTEN蛋白水平明显升高，Cyclin B1蛋白水平明显降低，线粒体膜电位下降，胞质中Cytochrome C蛋白水平升高。结论 敲低EN2可以阻滞肝癌细胞周期，诱导肝癌细胞凋亡，其作用机制可能与PTEN、线粒体凋亡途径有关。     

沉默半乳糖凝集素-3体外诱导卵巢癌细胞凋亡和内质网应激的实验研究

目的:研究沉默半乳糖凝集素-3(Galectin-3)对卵巢癌细胞凋亡和内质网应激的影响。方法:卵巢癌SKOV3细胞感染Galectin-3 siRNA 重组慢病毒,Real time PCR和Western blot检测沉默效果。MTT方法测定细胞增殖变化,平板克隆实验检测细胞克隆形成能力变化,流式细胞术检测细胞凋亡变化,Western blot检测细胞中c-caspase-3、CHOP、ATF4蛋白水平变化。结果:与感染阴性对照慢病毒和未感染的细胞比较,Galectin-3 siRNA 重组慢病毒感染后的SKOV3细胞中Galectin-3 mRNA和蛋白表达水平均降低。与感染阴性对照慢病毒和未感染的细胞比较,Galectin-3 siRNA 重组慢病毒可以明显下调SKOV3细胞的增殖、克隆形成能力,提高细胞凋亡率,促进细胞中c-caspase-3、CHOP、ATF4蛋白水平。结论:沉默Galectin-3抑制卵巢癌细胞生长,诱导卵巢癌细胞凋亡,促进细胞内质网应激。     

下调fascin抑制卵巢癌细胞从G0/G1期向S期转变的实验研究

目的:研究下调聚束蛋白（fascin）对卵巢癌细胞周期、增殖和凋亡的影响。方法:卵巢癌细胞SKOV3感染阴性对照慢病毒载体、shRNA fascin 1慢病毒载体、shRNA fascin 2慢病毒载体,用Real-time PCR和Western blot检测干扰效果。MTT检测增殖活性,克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,Western blot检测细胞中活化型Caspase-3（Cleaved Caspase-3）、细胞周期依赖性蛋白激酶4(cyclin-dependent kinase 4,Cdk4)、活化型Caspase-9（Cleaved Caspase-9）和p21蛋白水平。结果:shRNA fascin 1慢病毒载体、shRNA fascin 2慢病毒载体感染后的SKOV3细胞中fascin mRNA和蛋白表达水平均降低,并且shRNA fascin 1慢病毒载体感染后细胞中fascin mRNA和蛋白表达水平下降更多。下调fascin后的卵巢癌细胞增殖能力降低,细胞克隆形成能力也降低,细胞G0/G1期比例升高,细胞凋亡率升高,细胞中活化型Caspase-3、活化型Caspase-9蛋白水平升高,p21蛋白水平也升高,Cdk4蛋白水平降低,与感染阴性对照慢病毒载体和未经感染的细胞比较,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:下调fascin可降低卵巢癌细胞增殖能力、抑制卵巢癌细胞从G0/G1期向S期转变并诱导卵巢癌细胞凋亡。     

常春藤皂苷元影响内质网相关途径阻滞骨肉瘤细胞周期的实验研究

目的:研究常春藤皂苷元对骨肉瘤细胞周期的影响及机制。方法:用0、5、10、20、40 μg/ml的常春藤皂苷元处理骨肉瘤细胞,CCK-8法检测细胞增殖情况,细胞克隆实验测定细胞克隆形成能力,计算其半数抑制浓度。用半数抑制浓度的常春藤皂苷元处理骨肉瘤细胞,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,荧光探针法测定细胞内Ca2+浓度。用Western blot法检测细胞中结合免疫球蛋白（BIP）、内质网氧化还原酶1-Lα（Erol-Lα）、蛋白质二硫键异构酶（PDI）、剪切型Caspase-12（Cleaved Caspase-12）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）蛋白水平。结果:5、10、20、40 μg/ml的常春藤皂苷元均可以抑制骨肉瘤细胞的增殖和克隆形成能力,与0 μg/ml常春藤皂苷元作用组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。半数抑制浓度的常春藤皂苷元处理后的骨肉瘤细胞G1期比例升高,细胞凋亡率也升高,细胞内Ca2+浓度升高,细胞中BIP、Erol-Lα、PDI、Cleaved Caspase-12蛋白水平升高,Cyclin D1蛋白水平降低,与0 μg/ml常春藤皂苷元作用组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:常春藤皂苷元通过影响内质网相关途径将骨肉瘤细胞周期阻滞在G1期,诱导细胞凋亡发生。     

shRNA靶向沉默ZEB2表达通过Wnt/β-catenin信号通路降低肺癌细胞增殖活性的实验研究

目的:研究shRNA靶向沉默E盒结合锌指蛋白2（zinc finger E-box binding homeobox,ZEB2）表达对肺癌细胞增殖活性的影响。方法:用shRNA-ZEB2慢病毒和shRNA阴性对照慢病毒感染肺癌细胞,Real time PCR和Western blot检测沉默效果。MTT检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot检测细胞中激活型Caspase-3（Cleaved Caspase-3）、β-连环蛋白（β-catenin）、C-myc蛋白水平。用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂处理沉默ZEB2的肺癌细胞,MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中激活型Caspase-3、β-catenin、C-myc蛋白水平。结果:shRNA-ZEB2慢病毒可以明显沉默肺癌细胞中ZEB2的表达和转录,shRNA阴性对照慢病毒对肺癌细胞中ZEB2的表达没有影响。沉默ZEB2后的肺癌细胞增殖活性降低,细胞凋亡率升高,细胞中激活型Caspase-3蛋白水平升高,β-catenin、C-myc蛋白水平降低。Wnt/β-catenin信号通路抑制剂下调沉默ZEB2的肺癌细胞株中Wnt/β-catenin信号通路的激活水平,同时可以降低细胞存活率,诱导细胞凋亡,促进细胞中激活型Caspase-3的表达。结论:shRNA靶向沉默ZEB2表达通过Wnt/β-catenin信号通路降低肺癌细胞增殖活性。     

沉默ACY-1基因表达对结直肠癌细胞增殖、凋亡及侵袭的影响

目的:初步探索氨基酰化酶1（ACY-1）与结直肠癌SW480细胞增殖、凋亡、侵袭的关系以及作用机制。方法:小干扰RNA（siRNA）技术沉默结直肠癌细胞中ACY-1基因的表达,转染至SW480细胞中,分为对照组、si-NC组、si-ACY-1组,荧光实时定量PCR（qRT-PCR）和免疫印迹试验（Western Blot）检测转染效果;用四甲基偶氮唑盐微量（MTT）实验检测干扰ACY-1基因表达对细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞的凋亡率,Transwell法检测细胞的侵袭,Western Blot检测Ki-67、Caspase-3、β-连环蛋白（β-catenin）、c-Myc、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的蛋白水平。结果:Western Blot检测结果显示si-ACY-1组细胞中ACY-1蛋白的表达量显著低于对照组（P<0.05）。干扰ACY-1表达显著抑制细胞的增殖（P<0.05）和Ki-67蛋白水平,促进其凋亡（P<0.05）,增加Caspase-3蛋白水平,降低细胞的侵袭能力（P<0.05）。si-ACY-1组细胞中β-catenin、c-Myc、Cyclin D1的蛋白水平显著降低（P<0.05）。结论:沉默ACY-1抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭,诱导其凋亡,其作用与Wnt/β-catenin信号通路及其下游靶基因的激活有关,为结直肠癌的治疗提供新的治疗靶点。     

PTTG1 siRNA增加塞来昔布对骨肉瘤细胞生长抑制作用的实验研究

目的:研究垂体肿瘤转化基因1(PTTG1)siRNA和塞来昔布对骨肉瘤细胞生长的影响。方法:以不同浓度的塞来昔布处理骨肉瘤MG-63细胞,MTT方法测定细胞增殖和塞来昔布半数抑制浓度。用PTTG1 siRNA慢病毒和阴性对照慢病毒感染MG-63细胞,用Realtime PCR和Western blot检测干扰效果。以半数抑制浓度的塞来昔布处理感染siRNA慢病毒和阴性对照慢病毒的MG-63细胞,MTT法检测增殖,平板克隆实验检测克隆形成,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中活化的caspase-3（c-caspase-3）、活化的caspase-12（c-caspase-12）和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)蛋白水平。结果:塞来昔布能够抑制MG-63细胞增殖,其半数抑制浓度约为85 μmol/L。siRNA慢病毒感染后细胞中PTTG1 mRNA和蛋白水平均低于对照慢病毒感染的MG-63细胞（P<0.05）。半数抑制浓度的塞来昔布或干扰PTTG1后的MG-63细胞增殖能力和克隆形成能力均降低,细胞凋亡增多,细胞中c-caspase-3、c-caspase-12和CHOP蛋白水平升高。干扰PTTG1的MG-63细胞经半数抑制浓度的塞来昔布处理以后,细胞的增殖和克隆形成能力均降低,细胞凋亡率及细胞中c-caspase-3、c-caspase-12、CHOP蛋白水平均升高,与单纯半数抑制浓度塞来昔布或干扰PTTG1的MG-63细胞比较,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:PTTG1 siRNA增加塞来昔布对骨肉瘤细胞生长的抑制作用,其作用机制可能与内质网应激诱导的细胞凋亡有关。     

PDCD4促进吉西他滨诱导胰腺癌细胞凋亡的实验研究

目的:研究程序性细胞死亡因子4（programmed cell death 4,PDCD4）在吉西他滨诱导胰腺癌细胞凋亡中的作用。方法:用吉西他滨处理胰腺癌细胞PANC-1,荧光定量PCR和Western blot分别检测胰腺癌细胞中PDCD4的表达变化。PANC-1细胞感染PDCD4-pGC-Fu-GFP重组慢病毒和对照pGC-Fu-GFP重组慢病毒,荧光定量PCR和Western blot检测过表达效果。用吉西他滨处理过表达PDCD4的PANC-1细胞,MTT测定细胞增殖,克隆形成实验测定细胞克隆能力,流式细胞术测定细胞凋亡,Western blot检测细胞中剪切的Caspase-3（Cleaved Caspase-3）、剪切的Caspase-9（Cleaved Caspase-9）蛋白水平和胞浆、线粒体中细胞色素C（Cytochrome C）蛋白水平。结果:吉西他滨处理后的PANC-1细胞中PDCD4 mRNA和蛋白水平均明显升高。吉西他滨处理和过表达PDCD4的PANC-1细胞增殖、克隆形成能力明显降低,细胞凋亡率明显升高,细胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平升高,胞浆中Cytochrome C蛋白水平也升高,线粒体中Cytochrome C蛋白水平降低。吉西他滨处理过表达PDCD4的PANC-1细胞增殖能力、克隆形成能力降低更多,细胞凋亡率更高,细胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平也更高,胞浆中Cytochrome C蛋白水平更高,线粒体中Cytochrome C蛋白水平更低。结论:吉西他滨通过上调PDCD4表达水平激活线粒体途径诱导胰腺癌细胞凋亡。     

沉默LncRNA HOXD-AS1调控miR-454-3p表达增加H460细胞放射敏感性

目的 探究LncRNA HOXD-AS1靶向调控miR-454-3p表达对肺癌H460细胞放射敏感性影响。方法 qRT-PCR检测HOXD-AS1、miR-454-3p表达量,流式细胞术检测细胞凋亡率,克隆实验检测细胞放射敏感性。蛋白印迹法检测细胞中Caspase-3、Cyclin D1、γ-H2AX的蛋白表达量。结果 照后细胞中HOXD-AS1表达升高(P<0.05),miR-454-3p表达降低(P<0.05)。沉默HOXD-AS1促进细胞凋亡、增加放射敏感性,促进Caspase-3、γ-H2AX蛋白表达,抑制Cyclin D1表达;HOXD-AS1可靶向结合miR-454-3p并可负向调控其表达。结论 沉默HOXD-AS1可靶向调控miR-454-3p促进肺癌细胞凋亡及抑制细胞存活进而提高放射敏感性。     

C/EBP同源蛋白在紫檀芪抗人肺鳞癌Calu-1细胞中作用机制的研究

目的:探讨紫檀芪（PT）抗人肺鳞癌Calu-1细胞作用机制及内质网应激（ERS）相关蛋白C/EBP同源蛋白（CHOP）在其中的作用。方法:实验分为对照组、PT组（15、30、45 μmol/L）,分别检测各组Calu-1细胞活力值、凋亡率、ROS含量及Caspase-3活性,以及CHOP蛋白和凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax）含量的变化。CHOP小干扰RNA（siRNA）特异性抑制CHOP蛋白表达后,PT（0、30 μmol/L）处理细胞24 h,重复上述检测。结果:PT有效抑制Calu-1细胞增殖,促进凋亡（P<0.05）,显著增加ROS含量及Caspase-3活性（P<0.05）,并呈浓度依赖效应;Western blot检测结果显示PT上调CHOP及Bax的表达（P<0.05）,抑制Bcl-2的表达（P<0.05）;CHOP siRNA转染显著抑制CHOP表达,同时抑制PT对Calu-1细胞的上调CHOP蛋白表达和促凋亡作用（P<0.05）。结论:紫檀芪可有效抑制肺鳞癌Calu-1细胞活力、促进细胞凋亡,此作用可能与激活内质网应激相关蛋白CHOP有关。     

WWOX基因对人急性淋巴细胞性白血病细胞CCRF-CEM细胞凋亡及细胞周期的影响

目的:研究WWOX基因对人急性淋巴细胞性白血病细胞CCRF-CEM细胞凋亡及细胞周期的影响及分子机制。方法:体外培养CCRF-CRM细胞系，将WWOX基因转染入CCRF-CEM细胞，建立高表达WWOX的CCRF-CEM细胞，流式细胞仪法测定CCRF-CEM细胞的细胞周期和凋亡，Western blot法测定WWOX基因、细胞周期和凋亡相关因子的蛋白表达，qRT-PCR法测定caspase-3的mRNA表达。结果:与对照组和空白质粒组相比，转染入WWOX的CCRF-CEM细胞的WWOX蛋白表达显著增加，G0/G1期的细胞比例显著增加，凋亡细胞比例显著增加；CCRF-CEM细胞中cyclin D1、cyclin E、CDK2的蛋白表达显著降低而Wnt-5α和JNK的蛋白表达显著增加，caspase-3的mRNA表达促进CCRF-CEM细胞的凋亡。结论:WWOX基因在急性淋巴细胞性白血病CCRF-CEM细胞中发挥抑癌基因作用，可以有效促进细胞凋亡并抑制细胞周期进程。     

TPX2 shRNA对乳腺癌细胞生长、凋亡、侵袭、迁移能力的影响

目的:研究Xklp2靶蛋白（TPX2）shRNA对乳腺癌细胞生长、凋亡、侵袭、迁移能力的影响。方法:乳腺癌细胞MCF-7感染靶向TPX2基因shRNA慢病毒和阴性对照慢病毒,设置为TPX2 shRNA组、shRNA-NC组,把不做慢病毒感染的细胞设为对照组（Control组）。Real time PCR和Western blot测定沉默效果,MTT测定细胞增殖活性,克隆形成实验测定细胞克隆形成能力,流式细胞术测定细胞凋亡,Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力,Western blot测定细胞中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、活化型Caspase-3（Cleaved Caspase-3）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、活化型Caspase-9（Cleaved Caspase-9）蛋白水平。结果:TPX2 shRNA组TPX2 mRNA和蛋白水平均低于shRNA-NC组和Control组（P<0.05）。TPX2 shRNA组细胞增殖活性和细胞克隆形成能力降低,细胞凋亡率升高,细胞侵袭和迁移能力降低,细胞中MMP-2、MMP-9蛋白水平降低,Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平升高,与shRNA-NC组和Control组比,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:下调TPX2明显抑制乳腺癌细胞生长、侵袭和迁移能力,并诱导乳腺癌细胞凋亡。