PTEN在人脑胶质瘤细胞中的表达及其对细胞增殖的影响

背景与目的:PTEN基因的缺失及突变与多种肿瘤有关,而脑胶质瘤是与PTEN基因变异关系最为密切的恶性肿瘤之一.本研究旨在观察PTEN基因对人脑胶质瘤细胞生物学特性的影响,为PTEN用于胶质瘤基因治疗提供科学的实验依据.方法:(1)应用RT-PCR方法扩增人脑胶质瘤细胞U251、SHG-44中PTEN基因,序列测定分析.(2)采用阳离子聚合物转染试剂,将携带野生型PTEN基因的重组真核表达载体质粒转染至胶质瘤细胞,G418筛选出稳定转染的细胞并扩增培养.通过细胞形态学、细胞生长曲线观察PTEN基因表达对细胞形态和增殖的影响,应用Western blot、免疫细胞化学法检测相关蛋白的表达.结果:(1)胶质瘤细胞U251和SHG-44的PTEN mRNA分别存在着突变型、缺失型两种表达方式.(2)稳定转染的U251和SHG-44细胞株的生长曲线显示细胞增殖明显受抑制,第7天细胞计数分别为未转染对照组细胞数的39.1%、27.8%;Westem blot显示稳定转染细胞株有外源性PTEN蛋白的表达;细胞免疫化学法显示胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达量增加,从而表现出对细胞形态影响的差异,稳定转染的U251细胞出现向星形细胞分化的特征,SHG-44细胞形态转染前后无明显改变.结论:恢复野生型PTEN基因表达对胶质瘤细胞存在差异性的诱导分化作用.     

Gab2基因在肺癌细胞表达及对癌细胞凋亡及Wnt/β-catenin信号通路的影响

摘 要：［目的］ 探讨Gab2结合蛋白2（Gab2）基因在肺癌细胞表达及对癌细胞凋亡及Wnt信号/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路的影响。［方法］ 以人胚肺成纤维细胞MRC5作为对照细胞,通过Western bloting检测肺癌H322、A549、PC9、H1299、SPC-A-1细胞中Gab2的蛋白表达;转染48h后Western bloting检测Gab2、Cleaved Caspase-3、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期素D1（cyclin D1）、c-myc蛋白表达;流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。［结果］ 与MRC5细胞比较,Gab2在肺癌细胞中的表达显著性升高（P<0.05）。与对照组比较,Gab2-siRNA组Gab2 的蛋白表达降低,细胞凋亡率升高,Cleaved caspase3和Bax蛋白上调表达,Bcl-2、β-catenin、cyclin D1、c-myc蛋白表下调表达,差异均具有统计学意义（P<0.05）。［结论］ 抑制肺癌细胞Gab2表达能诱导细胞凋亡,机制是下调Wnt/β-catenin信号通路。     

Homer1基因在人脑胶质瘤中的表达及意义

背景与目的：Homer1是一种与凋亡有关系的信号分子,其在人脑胶质瘤组织中的表达及作用尚未见报道。本研究旨在探讨Homer1在人脑胶质瘤中的表达及意义。方法：采用免疫组织化学化方法、Westernblot和实时荧光定量RT-PCR检测Homer1蛋白在3株人脑胶质瘤细胞系（U251、U87和SHG-44）、60例人脑胶质瘤组织和5例正常人脑组织中的表达水平。结果：（1）免疫组化结果显示：SHG-44和U87细胞中Homer1a染色呈强阳性,在U251细胞中弱阳性染色,肿瘤细胞的阳性染色都呈颗粒状分布于胞核、胞浆、胞膜及突起结构。3株细胞系中Homer1b/c染色呈阴性;Homer1a蛋白在人脑胶质瘤及正常人脑组织中的阳性率及免疫反应评分（IRS）分别为61.8%、4.35±3.99和1.2%、0.09±0.35（P均〈0.01）;Homer1a蛋白阳性率和IRS与脑胶质瘤Ⅰ～Ⅳ级病理级别间呈＂U＂型关系,其中Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ级间差异非常显著（P〈0.01）,Ⅳ和Ⅱ、Ⅲ级间差异非常显著（P〈0.01）,Ⅰ和Ⅳ级、Ⅱ和Ⅲ级间差异显著（P〈0.05）,良、恶性脑胶质瘤之间Homer1a蛋白阳性率差异显著（P〈0.05）;Homer1b/c在人脑胶质瘤标本中不表达。（2）Homer1a蛋白及其mRNA在SHG-44和U87细胞中高表达,在U251细胞中低表达。Homer1b/c蛋白及其mRNA在3株细胞系中均无表达;Homer1a蛋白表达水平与Homer1 mRNA表达水平无明显差异（P〉0.05）;其他结果,mRNA表达情况和蛋白表达情况一致。结论：Homer1a蛋白和mRNA在人脑胶质瘤中有表达,并与脑胶质瘤的发生和发展密切相关;Homer1b/c不参与人脑胶质瘤的发生和发展。     

白藜芦醇抑制人脑胶质瘤细胞生长及诱导凋亡比较

 目的 探讨白藜芦醇（Resveratrol，Res）体外抑制U251、U87和SHG-44脑胶质瘤细胞生长及诱导凋亡的不同作用比较，验证Re8确可导致U251细胞凋亡。方法 MTT比色法测量不同剂量的Res作用U251、U87和SHG-44胶质瘤细胞24h后对增殖的影响及不同剂量的Res作用U251、U87和SHG-44细胞6h、24h、48h后的影响。流式细胞仪用Annexin V-FITC和PI双染检测U251、U87和SHG-44细胞凋亡率。HE染色、Hoechst 33342荧光染色、透射电镜（TEM）观察U251细胞形态改变，流式细胞仪测定U251细胞的细胞周期改变。结果 Res明显抑制U251、U87和SHG-44细胞的生长和增殖（P〈0．01）且对U87细胞的抑制作用最强，U251和SHG-44细胞次之；对U251细胞的抑制作用呈浓度及时间依赖性反应；Re8所致的U251、U87和SHG-44胶质瘤细胞凋亡为浓度依赖关系，且对U87细胞的凋亡作用强于U251和SHG-44细胞。U251凋亡细胞的细胞周期主要发生G，期阻滞。结论 Res对U251、U87和SHG-44细胞生长抑制及凋亡作用以U87细胞更明显，对U251细胞的抑制作用呈浓度及时间依赖性反应并引起了其细胞周期改变。     

桑根皮素调控Wnt/β-catenin信号通路影响胶质瘤U251细胞增殖的实验研究

目的 探讨桑根皮素调控Wnt/β-catenin信号通路对脑胶质瘤U251细胞增殖的影响.方法 体外培养人脑胶质瘤细胞U87,采用不同浓度桑根皮素(1、5、25、50、100μmol/L)作用于U87细胞,分别采用MTT法、细胞集落形成法、流式细胞术检测细胞增殖和凋亡活性.采用Western blotting法和细胞免...     

STIP1在脑胶质瘤组织中的表达及对胶质瘤细胞株增殖、凋亡、侵袭的影响

目的:检测磷酸化应激诱导蛋白1（stress-induced phosphoprotein 1,STIP1）在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达差异,探讨STIP1对胶质瘤细胞株U87、U251细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法:运用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)、免疫组化及蛋白印迹检测胶质瘤组织和正常脑组织中STIP1的表达;小干扰RNA（STIP1-siRNA）转染U87、U251细胞株后,使用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞仪和Transwell小室观察细胞的增殖、凋亡和侵袭能力。结果:STIP1在胶质瘤Ⅳ级组织中的表达明显高于正常脑组织,但在胶质瘤Ⅱ、Ⅲ级中的表达与正常脑组织无明显差异。U87、U251细胞株转染STIP1-siRNA后,细胞增殖和侵袭能力明显受到抑制,而细胞凋亡率明显上升。结论:STIP1在胶质母细胞瘤组织中高表达,下调STIP1可以抑制胶质瘤细胞株U87和U251的增殖,阻滞细胞周期,促进其细胞凋亡,并可抑制其侵袭力。     

干扰β-catenin表达对淋巴瘤细胞增殖、凋亡及cleaved caspase 3蛋白表达水平的影响

目的探讨干扰β-连环蛋白(β-catenin)表达对淋巴瘤细胞增殖、凋亡及活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase 3)表达水平的影响。方法以淋巴瘤细胞Raji为研究对象,采用β-catenin小干扰RNA(siRNA)转染细胞作为β-catenin siRNA组,以阴性对照control siRNA转染细胞作为siRNA control组,以不转染的细胞作为对照组。分别采用实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测β-catenin mRNA和β-catenin蛋白表达水平,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测cleaved caspase 3、c-myc、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表达水平。结果 siRNA control组和对照组的β-catenin mRNA和β-catenin蛋白表达水平、细胞存活率、细胞凋亡率及cleaved caspase 3、c-myc、cyclin D1蛋白表达水平比较,差异均无统计学意义(P﹥0.05)。β-catenin siRNA组的β-catenin mRNA和β-catenin蛋白表达水平、细胞存活率及c-myc、cyclin D1蛋白表达水平均低于对照组,细胞凋亡率和cleaved caspase 3蛋白表达水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。结论干扰β-catenin的表达可能通过影响cyclin D1、c-myc、cleaved caspase 3蛋白的表达,抑制淋巴瘤细胞增殖,促进淋巴瘤细胞凋亡。     

过表达Axin对胶质瘤细胞U87的生物学行为的影响及其作用机制

目的：观察Axin对胶质瘤U87细胞生物学行为的影响,并探讨其机制。方法：pCMV5-HA—Axin瞬时转染胶质瘤U87细胞,TUNEL法检测细胞的凋亡,流式细胞仪检测瘤细胞周期变化,Westernblot检测Axin及β—catenin蛋白质的表达。结果：Axin显著促进胶质瘤U87细胞的凋亡、抑制细胞的增殖;促进β-catenin蛋白在胞浆内的蓄积。结论：过表达Axin的胶质瘤U87细胞可能通过降低细胞核内β—catenin的蛋白表达量抑制Wnt信号通路,从而抑制细胞增殖并促使细胞凋亡。     

miR-1471对胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响及其机制探讨

目的:探讨miR-1471对胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响及其机制。方法:体外培养人胶质瘤细胞U251,将miR-1471模拟物或阴性对照分别转染至细胞中,记为miR-1471组和阴性对照（NC组）,同时设置对照组。qRT-PCR检测转染效果。CCK8检测各组细胞增殖能力。Transwell实验检测各组细胞侵袭能力。划痕实验检测各组细胞迁移能力。qRT-PCR和Western blot检测转移黏附基因（metadherin, MTDH）及Wnt/β-catenin信号通路相关基因和蛋白的表达。结果:与对照组和NC组比较,miR-1471组细胞增殖活性均显著降低（P＜0.05）,侵袭细胞数均显著减少（P＜0.05）,划痕间距明显较大,细胞中MTDH、Wnt1和β-catenin mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）。结论:miR-1471能抑制人胶质瘤细胞U251的增殖、侵袭和迁移能力,其作用机制可能与下调MTDH表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。     

shRNA靶向沉默ZEB2表达通过Wnt/β-catenin信号通路降低肺癌细胞增殖活性的实验研究

目的:研究shRNA靶向沉默E盒结合锌指蛋白2（zinc finger E-box binding homeobox,ZEB2）表达对肺癌细胞增殖活性的影响。方法:用shRNA-ZEB2慢病毒和shRNA阴性对照慢病毒感染肺癌细胞,Real time PCR和Western blot检测沉默效果。MTT检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot检测细胞中激活型Caspase-3（Cleaved Caspase-3）、β-连环蛋白（β-catenin）、C-myc蛋白水平。用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂处理沉默ZEB2的肺癌细胞,MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中激活型Caspase-3、β-catenin、C-myc蛋白水平。结果:shRNA-ZEB2慢病毒可以明显沉默肺癌细胞中ZEB2的表达和转录,shRNA阴性对照慢病毒对肺癌细胞中ZEB2的表达没有影响。沉默ZEB2后的肺癌细胞增殖活性降低,细胞凋亡率升高,细胞中激活型Caspase-3蛋白水平升高,β-catenin、C-myc蛋白水平降低。Wnt/β-catenin信号通路抑制剂下调沉默ZEB2的肺癌细胞株中Wnt/β-catenin信号通路的激活水平,同时可以降低细胞存活率,诱导细胞凋亡,促进细胞中激活型Caspase-3的表达。结论:shRNA靶向沉默ZEB2表达通过Wnt/β-catenin信号通路降低肺癌细胞增殖活性。     

冬凌草甲素上调p53转录活性促进胶质瘤细胞凋亡的作用与分子机制探讨

目的:探讨冬凌草甲素抑制胶质瘤细胞U-87 MG、A-172活性的分子机制。方法:CCK8法检测不同浓度的冬凌草甲素对胶质瘤细胞U-87 MG、A-172活力的影响。选择20 μmol/L的冬凌草甲素分别处理胶质瘤细胞U-87 MG、A-172 0、6、12 h后,Western blotting法检测p53及其下游p21、Bax蛋白的表达情况,同时检测Cleaved PARP、Cleaved Caspase3的表达情况,实时荧光定量PCR法检测p53 mRNA水平的改变。应用p53转录活性抑制剂Pifithrin-α（PFT-α)预处理胶质瘤细胞U-87 MG 24 h后,Western blotting法检测冬凌草甲素对p53及其下游蛋白、Cleaved PARP、Cleaved Caspase3表达情况的影响。结果:冬凌草甲素对U-87 MG、A-172细胞的活性具有明显的抑制作用,冬凌草甲素作用24 h对胶质瘤细胞U-87 MG、A-172的IC50均介于20~30 μmol/L。冬凌草甲素可以上调p53及其下游p21、Bax蛋白并具有时间依赖性,而不改变p53的mRNA水平。此外,冬凌草甲素可以诱导胶质瘤细胞U-87 MG、A-172凋亡。p53转录活性抑制剂可以废除冬凌草甲素对p53及其下游p21、Bax蛋白的上调作用,同时也减弱了冬凌草甲素对胶质瘤细胞U-87 MG的促凋亡作用。结论:冬凌草甲素可能通过上调p53蛋白表达、增强其转录活性,促进胶质瘤细胞凋亡,而对胶质瘤细胞活性产生抑制效应。     

MSP58基因表达水平与人脑胶质瘤恶性度的关系

目的:观察MSP58基因表达水平与人脑胶质瘤恶性度的关系.方法:在41例按WHO分类和分级标准为Ⅰ-Ⅳ级的人脑胶质瘤标本、4株人脑胶质瘤细胞系(U251,U87,BT325和SHG44)以及6例正常脑组织标本中,运用半定量RT - PCR及蛋白质印迹法检测MSP58 mRNA和蛋白的表达水平.结果:MSP58 mR-NA和蛋白在人脑胶质瘤组织中存在表达,其表达水平随人脑胶质瘤恶性度的增加而升高.在正常脑组织和恶性脑胶质瘤之间,以及脑胶质瘤Ⅰ-Ⅳ级病理级别间比较均有显著差异.MSP58 mRNA和蛋白在U251、U87、BT325和SHG44细胞中均有高表达.结论:MSP58 mRNA和蛋白在人脑胶质瘤中高表达,其表达水平与脑胶质瘤的恶性度有关,提示MSP58在脑胶质瘤的形成和恶性演进中具有重要作用.     

沉默lncRNA UCA1通过上调miR-873-5p表达对胶质瘤细胞放射敏感性影响

目的 探讨lncRNA UCA1通过调控miR-873-5p表达对体外培养的胶质瘤SHG-44、U87、U251细胞放射敏感性的影响。方法 采用克隆形成实验检测X线照射0、2、4、6、8Gy SHG-44、U87、U251细胞存活情况,qRT-PCR检测SHG-44、U87、U251细胞中UCA1基因表达。以放射抵抗的U87、U251细胞为研究对象,沉默UCA1表达、过表达miR-873-5p后用克隆形成实验及流式细胞术检测细胞存活分数和细胞凋亡率。双荧光素酶报告基因实验和qRT-PCR检测验证UCA1和miR-873-5p的靶向关系。结果 UCA1在U87、U251细胞中表达上调。沉默UCA1或过表达miR-873-5p可抑制U87、U251细胞存活,并促进细胞凋亡。miR-873-5p是UCA1靶基因,UCA1可负性调控miR-873-5p1的表达。抑制miR-873-5p表达可逆转沉默UCA1对胶质瘤细胞放射敏感性的影响。沉默UCA1增加射线对胶质瘤细胞U251移植瘤的抑制作用。结论 沉默UCA1通过上调miR-873-5p表达,抑制胶质瘤细胞存活并促进其凋亡,从而提高胶质瘤细胞放射敏感性。     

WNT4在脑胶质瘤中甲基化下调及抑制恶性胶质瘤细胞增殖的研究

目的 探讨WNT4在脑胶质瘤细胞系和组织中细胞系的表达与甲基化对脑胶质瘤细胞系U87增殖的作用和机制。方法 qRT-PCR和免疫蛋白印迹实验分析WNT4在脑胶质瘤组织中的表达和甲基化及WNT4在脑胶质瘤细胞系中的表达;以胶质瘤U87细胞为本实验研究对象,分别转染慢病毒载体pLVX-Gfp-WNT4(实验组)和pLVX-Gfp-NC(对照组);细胞增殖和克隆形成实验分析WNT4基因对细胞增殖的影响;免疫蛋白印迹法验证WNT4对Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果 与正常人星形胶质细胞相比,WNT4 mRNA在脑胶质瘤细胞系中的表达下调(P＜0.001),与正常脑组织相比,WNT4 mRNA和蛋白在脑胶质瘤组织中表达下调(P＜0.001);脑胶质瘤分级越高WNT4 mRNA表达越低(P＜0.001),高表达WNT4 mRNA患者的预后好(P＜0.001);WNT4在脑胶质瘤中甲基化程度明显高于正常脑组织。过表达WNT4后细胞活性和增殖能力受到抑制(P＜0.001);恢复WNT4表达后Wnt/β-catenin信号通路及其下游细胞因子明显受到抑制。结论 WNT4在人脑胶质瘤组织中表达甲基化下调,通过抑制Wnt/β-catenin信号通路参与脑胶质瘤的进展。