幽门螺杆菌致T细胞凋亡：Fas/FasL介导的T细胞无反应性

目的 评价幽门杆菌（Hp）致T细胞死亡的方式和机制,探讨这种作用与Hp感染致宿主产生免疫耐受的关系。方法 应用AnnexinV染色流式细胞术检测Hp致T细胞死亡的方式;应用细胞毒实验（JAM技术）和FasIgG抗体、caspase8抑制剂组断实验评价T细胞凋亡与Fas/FasL作用的关系,并通过流式细胞术直接检测Hp对T细胞FasL表达的上调作用及其与T细胞产生凋亡的时效关系。结果 AnnexinV染色和JAM技术证实H致T慢以凋亡方式进行的。这种细胞凋亡能被抗Fas抗体和caspase8抑制剂阻断,因而是Fas依赖,TH2细胞较TH1样T细胞对这种作用更敏感。由于Hp能直接上调T细胞的FasL且其发生时间与凋亡出现时间吻合,证实Hp是通过凋节T细胞之间Fas/FasL相互作用而致其凋亡的。Hp能通过调节Fas/FasL作用而负调节T细胞的生长,这可能是Hp感染致宿主发生T细胞耐受的机制之一。     

HLA-G与T细胞

人类白细胞抗原G(human leukocyte antigen-G,HLA-G)属于非经典的HLAⅠ类分子,是机体内一种重要的免疫耐受分子。T细胞是细胞免疫的主要效应细胞,在机体维持免疫稳态中发挥重要作用。近来研究发现,HLA-G对T细胞的免疫调节功能一方面依赖于T细胞上抑制性受体直接发挥免疫抑制作用,另一方面通过诱导或胞啃机制产生调节性T细胞(Treg)、HLA-G+T细胞间接参与机体免疫耐受。本文就HLA-G对T细胞调节功能的研究进展作一综述。     

可溶性HLA-G1、-G2的原核表达及其蛋白质产物的功能检测

sHLA-G存在于整个妊娠期母胎接触面及母体血循环中,目前被认为是妊娠期一种特异性免疫抑制分子。实验将sHLA-G1、sHLA-G2基因克隆于原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导实现目标融合蛋白的高效表达,并通过Ni2+-NTA柱纯化、蛋白质透析梯度复性获得纯化的His-sHLA-G1、His-sHLA-G2融合蛋白。融合蛋白再经凝血酶酶切、苯甲脒琼脂糖凝胶吸附去除6-His标签后,用于体外功能鉴定。结果显示:sHLA-G2与sHLA-G1一样,同样具有抑制T细胞增殖、抑制NK细胞杀伤活性的功能,提示sHLA-G2为一种免疫致耐分子。     

可溶性HLA-G上调蜕膜免疫细胞NK细胞受体的表达

sHLA-G是妊娠期特异的免疫抑制分子,在受孕子宫及妊娠期女性外周血中含量丰富,提示其在维持母胎耐受中发挥重要作用。我们前期研究发现:早期难免流产病人组蜕膜组织KIR2DL4、ILT-2、ILT-4分子表达的水平明显低于正常妊娠对照组。为进一步分析这些抑制性受体表达下降与sHLA-G是否存在联系,我们对sHLA-G与蜕膜组织免疫细胞NKR表达的关系进行了研究。我们将不同量的sHLA-G1、sHLA-G2蛋白加至蜕膜单个核细胞悬液、外周血单个核细胞悬液及NK92细胞株中,分别孵育12h、24h、48h后,用Real-Time RT-PCR、FACS对NKR的表达进行检测。研究发现sHLA-G可以不同程度地上调蜕膜单个核细胞、外周血单个核细胞、NK92细胞表面ILT-2、ILT-4、KIR2DL4的表达。这个发现让我们对sHLA-G诱导免疫耐受的机制有了更深的认识。sHLA-G上调抑制性受体表达这一作用具有重要生理意义,它可以抑制效应细胞的杀伤功能,使母胎界面微环境适于胎儿存活,从而维持母胎免疫耐受。     

HLA-G诱导T细胞免疫耐受的实验研究

用W6/ 3 2单抗对JEG 3细胞进行免疫荧光染色 ,可见在JEG 3细胞膜表面有高强度的黄绿色荧光。HLA G+的JEG 3细胞作为刺激细胞 ,观察其对淋巴细胞增殖反应的影响 ,结果JEG 3细胞不能刺激淋巴细胞增殖。采用经典的单向混合淋巴细胞培养的方法 ,以转染及未转染HLA G分子的K5 62细胞作为抑制细胞 ,按一定的比例加入反应体系 ,结果表明 ,转染HLA G的K5 62细胞能抑制淋巴细胞的增殖反应 ,该抑制以刺激细胞∶反应细胞∶抑制细胞的比例为 1∶1∶2时效果最明显 ,抑制率为 5 4 1% (P <0 0 1) ,转染空质粒和未转染HLA G的K5 62细胞均无明显抑制作用。外周血淋巴细胞与JEG 3细胞共同孵育 ,碘化丙啶 (PI)染色 ,流式细胞仪观察 ,结果发现 ,HLA G分子能诱导淋巴细胞的凋亡。     

凋亡细胞体外抑制T细胞活化

目的：研究凋亡细胞对Ｔ细胞活化的影响。方法：以ＣｏｎＡ刺激小鼠脾细胞增殖体系为研究对象,观察凋亡细胞预处理后对ＣｏｎＡ刺激的脾细胞ＣＤ６９表达的影响。结果：凋亡细胞可以抑制Ｔ细胞活化,而活细胞或坏死细胞却不能。同时抑制效果与凋亡种类诱导方式无关,而与凋亡细胞数量密切相关。结论：研究证明了凋亡细胞可以主动抑制Ｔ细胞活化,这一发现拓宽了目前对凋亡的认识,表明凋亡细胞主动调节免疫反应在一些生命的基本现象     

再生障碍性贫血患者外周血T细胞FasL的表达分析

目的 比较分析再生障碍性贫血(AA)患者T细胞上Fas配体(FasL)的表达及其在胞内外的分布情况，观察AAT细胞胞浆FasL的释放特性及细胞毒作用。方法 以正常人“静息”T细胞和人为诱导活化的T淋巴母细胞为参照，采用免疫荧光标记和流式细胞技术，检测FasL在AAT细胞表面及胞浆中的分布；用体外大剂量PHA-过性刺激的方式诱导T细胞胞浆FasL的释放；以Jurkat细胞为靶向，同时辅以单抗阻断及超速离心的方法，观察AAT细胞FasL的释放特性和杀伤效应。结果 AA T细胞表面及胞浆中均有FasL的异常表达，其中胞浆FasL的异常表达尤为显著；高浓度胞浆FasL可在大剂量PHA-过性刺激时迅速向胞外释放；PHA刺激后的AAT细胞培养上清有明显的Jutkat细胞杀伤活性，该效应可被FasL McAb阻断，或经超速离心加以去除。结论 AAT细胞是一种处于预活化状态的细胞，具有与T淋巴母细胞相似的活化特征，含有高浓度、能以细胞外体形式诱导释放、具备完整活性的胞浆FasL是其异常活化的一大特点。     

滋养层细胞FasL的表达在胎盘免疫耐受中的作用

目的 研究显示胎盘组织中淋巴细胞凋亡明显增加，被认为与胎盘的免疫耐受机制有关。本文拟观察胎盘组织中ＦａｓＬ的表达是否与淋巴细胞的凋亡有关。方法 取４０例正常产妇的胎盘组织和４０例宫内膜组织石蜡标本，以免疫组化方法检测ＦａｓＬ的表达，采用ＴＵＮＥＬ方法测定淋巴细胞凋亡。结果 ４０例胎盘组织中滋养叶细胞均有不同程度的ＦａｓＬ表达，宫内膜组织的腺体及间质细胞等均未见明显ＦａｓＬ表达，胎盘组织中淋巴细胞的     

T0901317通过上调LXRα表达促进人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡

 目的:观察肝X受体(LXR)激动剂T0901317对人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的作用及其机制。方法:不同浓度(0、10、20、40 μmol/L)T0901317处理人乳腺癌MDA-MB-231细胞不同时间(0、12、24、48 h),用Hoechst 33342染色及流式Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;Western blot进一步检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、cleaved caspase-3和LXRα的表达,RT-qPCR检测Bcl-2和LXRα的mRNA表达。结果:随着T0901317处理浓度的增加和时间的延长,凋亡现象逐渐明显。进一步通过Western blot检测发现,T0901317可下调Bcl-2 蛋白表达,cleaved caspase-3表达增多,而LXRα的表达上调;RT-qPCR检测结果也显示,T0901317可下调Bcl-2 mRNA表达,而上调LXRα表达。结论:T0901317能上调LXRα表达,从而促进MDA-MB-231细胞凋亡。     

T细胞Trail受体表达及Trail诱导的T细胞凋亡

目的 :观察人T细胞Trail(TNF relatedapoptosis inducingligand)受体表达及Trail诱导T细胞凋亡的作用。方法 :通过荧光双标记 ,使用流式细胞仪检测Trail受体阳性细胞和凋亡细胞。结果 :静息Jurkat细胞表达高水平Trail受体〔(49 19±12 2 5 ) %〕 ,激活Jurkat细胞对Trail受体表达无影响。Trail诱导显著的Jurkat细胞凋亡〔(90 0 1± 2 6 71) %〕。正常人外周血淋巴细胞 (PBL)仅激活后表达Trail受体〔(2 5 2 7± 6 42 ) %〕 ,但无细胞凋亡发生。结论 :人T细胞表达Trail受体 ,Trail受体和Trail的相互作用对细胞凋亡有调控作用。     

血管内皮细胞(ECV304)表达的HLA-G1对NK细胞杀伤活性的抑制作用

目的:证实HLA-G1分子能够抑制NK细胞对同种血管内皮细胞系的杀伤作用。方法:采用脂质体介导的DNA转染技术,以构建的真核表达质粒pcDNA3-HLA-G1转染人脐静脉内皮细胞系ECV304,再用免疫荧光法检测表达的HLA-G1分子。并用MTT比色法检测HLA-G1对NK细胞杀伤活性的影响。结果:ECV304细胞上可稳定表达HLA-G1。NK细胞对空质粒pcDNA3转染的ECV304细胞的杀伤率为(50.6±18.1)%;而对pcDNA3-HLA-G1转染的ECV304细胞的杀伤率为(29.7±11.4)%,两者差异具有显著意义(P<0.01)。结论:HLA-G1分子可明显抑制NK细胞对同种血管内皮细胞的杀伤效应。     

转染FasL基因树突状细胞诱导异基因小鼠脾脏T细胞凋亡的研究

目的 制备稳定表达FasL蛋白的小鼠骨髓源树突状细胞(dendritic cell,DC)并探讨其诱导异基因小鼠脾脏T细胞凋亡的机理.方法 采用培养基选择法体外培养小鼠骨髓源DC,脂质体法转染FasL基因至小鼠成熟DC,实时定量PCR检测转染前后FasL mRNA的表达,流式细胞仪和免疫蛋白印迹检测转染前后FasL蛋白的表达.异系小鼠静脉分别输注未转染DC、转染空质粒DC和转染FasL的DC,7 d后TdT介导的原位末端标记法(TUNEL)和流式细胞仪检测脾脏中T淋巴细胞凋亡.结果 体外培养可获得成熟的小鼠骨髓源DC,转染FasL基因的DC较未转染DC FasL mRNA和FasL蛋白表达明显升高.对脾脏中T淋巴细胞凋亡的检测发现,转染FasL的DC组凋亡指数(11.67±1.53)明显高于未转染DC组(2.67±0.58)和转染空质粒组(3.33±0.58),P＜0.01.结论 培养基选择法可收获大量骨髓源DC,脂质体转染FasL基因至小鼠骨髓源DC,可以使DC高表达FasL蛋白.转染FasL的DC输注能明显诱导异系小鼠脾脏T淋巴细胞凋亡.     

Fas／FasL在超抗原SEA诱导T细胞凋亡中的作用

目的超抗原能诱导 T细胞凋亡 ,但其作用机制尚未阐明 ,Fas系统与 Ca2 在其中的作用尚待进一步研究。方法超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素 A(SEA)诱导人外周血建立的短期 SEA反应 T细胞系凋亡 ,1.8%琼脂糖凝胶 DNA电泳于不同时间观察凋亡的特征条带 ;FCM检测 Fas、Fas L 的表达量变化 ,Fura- 2 / AM荧光指示剂检测胞浆游离 [Ca2 ]i的变化。结果使用 FCM特异性检测凋亡亚 G0 / G1峰大小及 1.8%琼脂糖凝胶电泳检测凋亡 DNA梯状图谱证明 ,SEA能诱导短期 SEA反应 T细胞凋亡 ,其凋亡的时间与程度与 SEA的剂量有关。SEA1μg/ ml建立的短期 SEA反应 T细胞对 SEA1μg/ml的再次刺激 ,凋亡量随作用时间的延长而增多 ,在作用的第 16 h最高 ,达 5 8%。 FCM间接荧光染色法检测发现 ,Fas及Fas L 亦随 SEA作用时间的延长而表达增多 ,16 h时表达最多 ,分别为 92 %和 6 0 %。用 Fura- 2 / AM荧光指示剂检测 ,此时细胞胞浆 [Ca2 ]i已从刺激前的 (2 90± 33) nm ol/ L 上升到 (6 80± 16 ) nmol/ L。结论 Fas系统与 SEA诱导的 T细胞凋亡密切相关。换言之 ,Fas系统在超抗原诱导 T细胞凋亡中起作用 ,而胞浆 [Ca2 ]i升高与 SEA诱导的凋亡 T细胞 DNA断裂及其它凋亡形态变化有关。     

Soluble HLA-G molecules induce apoptosis in natural killer cells

Membrane-bound human leukocyte antigen-G (HLA-G) molecules are primarily expressed by cytotrophoblasts of the fetus. They are thought to protect the fetus from immunologic attack by the maternal immune system and have recently been associated with transplantation graft acceptance. In addition, soluble HLA-G molecules (sHLA-G) have been shown to play a role in the success of pregnancies, but are upregulated in certain cancers. However, the exact mechanism for this regulation has remained elusive. The aim of this study was to examine the mechanism by which sHLA-G interact with natural killer (NK) cells in vitro. sHLA-G effectively blocked NK lysis of target cells via fracticide killing of NK cells by apoptosis. These studies support the protective role of sHLA-G in immunologic reactions by interacting with NK cells, thus providing a regulatory function.     

Soluble PD-1 is Associated with Aberrant Regulation of T Cells Activation in Aplastic Anemia

Engagement of the membrane program death-1 (PD-1) receptor by its ligands suppresses T cell proliferation and cytokine production. Aberrant over-expression of costimulatory molecules, including PD-1, has been associated with persistent activation of self-reactive T cells in autoimmune diseases. However, the mechanism underlying the dysfunction of PD-1 in the regulation of T-cell activation in such diseases remains unclear. Here, we report the overexpression of CD4⁺ and CD8⁺ T cell PD-1 and elevated serum levels of soluble PD-1 in aplastic anemia (AA) patients. Detailed characterization of soluble PD-1 revealed that it corresponded to an alternative splice variant PD-1Δex3, which lacks the transmembrane domain but has a soluble extracellular domain of the PD-1 molecule. In a further study, PD-1 fusion protein displayed the ability of increasing the proliferation of T cells in vitro, which suggested that soluble PD-1 might serve as an autoimmune antibody to block the function of membrane-bound PD-1 on T cells and lead to aberrant T cell proliferation. Our study revealed a novel pathogenic pathway in which the function of overexpressed PD-1 to restrict over-self-reaction is counteracted by the excessive production of soluble PD-1.     

表达HLA—G1的K562细胞抵抗外周血NK细胞杀伤作用的研究

目的 研究HLA－G1分子对NK细胞杀伤活性的影响。方法 供助脂质体介导的DNA转染技术,将本室构建的真核南闰pcDNA3-HLA-G1转染人K562细胞;通过G418筛选,获得克隆化细胞株K562－G1;应用RT－PCR及流式细胞术分别在RNA水平和蛋白质水平检测HLA－G1的表达;最后,应用MTT比色法检测转染细胞对不同个体外周血NK细胞杀伤活性的抑制效应。结果 与转染了空质粒的对照组相比,外周血NK细胞对K562－G1的杀伤率降低32.43%（P＜0.01）。结论 靶细胞表达HLA－G2分子可明显抑制NK细胞的杀伤效应。     

Down-regulation of HLA-G1 cell surface expression in human cytomegalovirus infected cells

PROBLEM: Down-modulation of human leukocyte antigen (HLA)-G1 cell surface expression by human cytomegalovirus (HCMV) has only been studied in cellular models expressing independent unique short (US) recombinant proteins, but not in the context of viral infection. To explore the level of HLA-G1 cell surface expression after HCMV infection and to investigate the influence of US viral proteins, we infected HLA-G1 expressing cells by HCMV laboratory strains. METHOD OF STUDY: Human U373-MG astrocytoma cells were transfected with HLA-G1 cDNA. Following HCMV infection, HLA-G1 cell surface expression of these transfectants was evaluated by flow cytometry and confocal microscopy, using an HLA-G specific monoclonal antibody, and compared with that of uninfected cells. US-deleted viruses were then used to evaluate the implication of US proteins. RESULTS: Using flow cytometry, it was found that HCMV infection of U373-G1 cells decreased HLA-G1 cell surface expression. Similar results were obtained with two different HCMV strains, namely Towne and AD169. Two color confocal microscopy staining further confirmed such HLA-G down-modulation in HCMV-infected cells stained for immediate early (IE1/2) nuclear proteins expression. Infection of U373-G1 cells with US-deleted HCMV strain had no effect on the level of cell surface HLA-G1 expression, thus demonstrating the US dependency of the HCMV-mediated down-regulation of HLA-G1. CONCLUSION: HCMV infection down-modulates HLA-G1 expression at the cell surface. This is likely to have functional consequences in case of HCMV uterine infection during pregnancy.     

特异性ASODN抑制Fas表达降低FasL介导细胞凋亡的研究

为了研究特异性Fas反义寡核苷酸(ASODN)对T细胞Fas表达及肝癌细胞诱导其凋亡的抑制作用,用脂质体介导法将Fas ASODN导入Jurkat T细胞,并通过用流式细胞术、RT-PCR及与肝癌细胞共培养方法研究Fas ASODN对T细胞Fas表达、Fas mRNA水平及凋亡的影响。结果显示:①Hep G2.2.15细胞表达有功能的FasL,可诱导Jurkat细胞凋亡;②Jurkat细胞转染Fas ASODN后,Fas mRNA降低;细胞表面Fas表达下降;与Hep G2.2.15细胞共培养后的凋亡率下降。表明Fas ASODN转染可以部分逆转肝癌细胞对T细胞的凋亡诱导作用。     

Correlation between expression of DcR3 on tumor cells and sensitivity to FasL

To investigate the correlation between sensitivity to Fas ligand （FasL） and expression level of decoy receptor 3 （DcR3） on tumor cell surface, Fas/DcR3 mRNA expression was detected by RT-PCR. Anti-DcR3 mAb was used to detect expression level of DcR3 on surface of tumor cells by flow cytometry. Caspase-8, caspase-9, caspase-3, Bcl-2 expressions were analyzed by Western blot, respectively. Sensitivity to apoptosis induced by FasL was determined by Annexin V apoptosis kit. The expressions of DcR3 on the surface of tumor cells from high to low were approximately 35.3% in BGC823 cells, and 21.6% in MCF-7 cells, respectively. The apoptotic rates induced by FasL from low to high were 15.6% in BGC823 cells, and 58.2% in MCF-7 cells, respectively. There was a significant correlation between the expression levels of DcR3 with FasL-inducing apoptosis. Cellular ＆ Molecular Immunology.