促红细胞生成素对人视网膜色素上皮细胞光化学损伤的保护作用

目的 观察重组人促红细胞生成素（EPO）在人视网膜色素上皮(RPE)细胞光化学损伤中的保护作用并探讨其作用机制。 方法 取成人RPE（ARPE）19细胞株传代培养的2～5代细胞建立光损伤模型，光照12 h后再培养24 h终止培养，采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）法和流式细胞双染色法检测不同浓度的EPO干预治疗前后RPE细胞活性的变化及细胞凋亡的变化，并添加酪氨酸激酶/信号转导和转录活化因子Jak/STAT的阻断剂（AG490）探讨人重组EPO对人RPE细胞光化学损伤的保护性作用及其保护性机制。 结果 EPO可明显增强 RPE细胞的细胞活性，各组中以40 IU/ml EPO组细胞活性的增强结果最明显；明显减少光化学损伤诱导的人RPE细胞的凋亡，以40 IU/ml EPO组结果最明显。在加入AG490（Jak2激酶抑制剂）组，EPO对细胞活性的增强作用和抑制凋亡作用均被阻止。 结论 EPO对人RPE细胞的光化学损伤有保护治疗作用，其保护作用机制主要通过EPO与其受体结合后保护作用机制起作用。     

细胞因子对培养的人视网膜色素上皮细胞早期生长反应基因-1的影响

目的 检测细胞因子对人视网膜色素上皮（RPE）细胞早期生长反应基因-1（Egr-1）的影响。 方法 体外培养人RPE细胞，采用免疫荧光染色、Western blotting和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）定性定量观察不同刺激因素作用下Egr-1蛋白和mRNA的表达变化。刺激因素包括：20 μg/ml脂多糖（LPS）、40 ng/ml肿瘤坏死因子（TNF） α、10 U/ml 干扰素（IFN） γ、30%单核/巨噬细胞株（THP-1细胞）上清液和正常人玻璃体液分别刺激0(未受刺激)、10、20、30、40、60 min。结果 在未受刺激的RPE细胞中Egr-1呈弱阳性表达，细胞浆为浅黄绿色荧光，随着刺激因素的作用，Egr-1的表达明显增强，细胞浆和部分细胞核呈强绿色荧光。20 μg/ml LPS、40 ng/ml TNF α、10 U/ml IFN γ、30％THP-1细胞上清液和玻璃体液刺激RPE细胞后，与未受刺激的RPE细胞相比，Egr-1 mRNA的最大增强幅度分别为19、13、14、12、14倍，Egr-1蛋白的最大升高幅度分别为34、12、17、32、13倍。 结论 LPS、TNF α、IFN γ、THP 1细胞上清液和玻璃体液可上调体外培养的人RPE细胞Egr-1 mRNA和蛋白的表达，且出现核转位现象，说明这些刺激因素可引起Egr-1的活化。     

银杏叶提取物对光损伤后视网膜色素上皮细胞蛋白质表达的影响

目的 观察中药银杏叶提取物对光损伤后视网膜色素上皮(RPE)细胞蛋白质表达的影响,探讨银杏叶提取物保护RPE光损伤的分子机制.方法 生长良好的人RPE细胞(ARPE-19)融合生长到80%时,随机分为正常对照组、光损伤组和银杏叶提取物处理组.运用冷白光以(2200±300)1x光照ARPE-19,建立光损伤模型;以100 μg/ml的银杏叶提取物(EGb761)处理光损伤的RPE细胞.提取细胞可溶性蛋白,进行蛋白质双向电泳,ImageMaster凝胶软件分析差异蛋白质点,并选取表达差异蛋白进行质谱鉴定和生物信息学分析.结果 蛋白图谱差异分析显示,光损伤组与正常对照组比较,差异蛋白质有33个,其中蛋白质表达下调10个,蛋白质表达上调23个;银杏叶提取物处理组与光损伤组差异蛋白质有25个,其中,蛋白质表达上调3个,蛋白质表达下调22个.银杏叶提取物处理组与正常对照组比较,差异蛋白质有11个,其中,蛋白质表达上调4个,蛋白质表达下调7个.差异蛋白质的质谱鉴定和生物信息分析,成功鉴定出16个蛋白,包括组织蛋白酶B、热休克蛋白、细胞色素C还原酶等.结论 光损伤RPE细胞与银杏叶提取物处理后的光损伤RPE细胞及正常RPE细胞间的蛋白质表达有差异;银杏叶提取物光损伤保护作用涉及组织蛋白酶B、热休克蛋白、细胞色素C还原酶等多种蛋白.     

缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子干扰性RNA对人血管内皮细胞血管内皮生长因子表达的抑制

目的 探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）小片段干扰性RNA（siRNA）对人血管内皮细胞VEGF表达的影响。 方法 构建HIF-1α siRNA重组质粒。将体外培养的人血管内皮细胞（HUVEC-12）分成常氧（20%）组和低氧（1%）组。低氧组中，采用脂质体Lipofectamine ^TM 2000（LF2000）分别转染空载体质粒（空载体组）、HIF-1α siRNA（HIF-1α组）、VEGF-₁₆₅ siRNA（VEGF组）和HIF-1α siRNA+VEGF₁₆₅ siRNA（共转染组）。低氧组中未转染的细胞为对照组。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）鉴定基因转染效率；RT-PCR和免疫细胞化学法检测各组细胞中VEGF基因和蛋白表达的变化。 结果 成功构建HIF-1α siRNA重组质粒。人血管内皮细胞转染24 h后，HIF-1α siRNA和VEGF-₁₆₅ siRNA重组质粒有表达。常氧组细胞中仅见微弱的VEGF mRNA和蛋白表达，而低氧组表达明显上调；HIF-1α组、VEGF组和共转染组表达较对照组减弱，其中共转染组抑制效果最明显。 结论 HIF-1α和VEGF₁₆₅ siRNA能有效抑制人血管内皮细胞VEGF的表达。     

米诺环素对压力作用下体外培养视网膜神经细胞凋亡的抑制

目的 观察米诺环素对压力系统作用下大鼠视网膜神经细胞(RNs)的活性及凋亡的影响，探讨其对受损RNs保护的可能机制。 方法 制备大鼠RNs体外加压培养模型，通过细胞形态学观察、四唑盐（MTT）比色法测定细胞活力、吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）染色法检测细胞凋亡率等方法观察不同浓度的米诺环素对上述损伤细胞的保护作用，并用免疫细胞化学法观察iNOS和caspase 3表达的改变。 结果 加压培养后RNs与对照组相比形态改变较明显，细胞活力降低，5393%的细胞发生凋亡。20000 μmol/L的米诺环素治疗组则细胞形态改善，活力显著增高，1729%的细胞发生凋亡；免疫细胞化学法显示细胞内iNOS和caspase-3表达较加压损伤组减少。 结论 一定剂量的米诺环素在体外可有效抑制压力引起的大鼠RNs损伤及凋亡；抑制iNOS和caspase-3的表达可能是其潜在作用机制。     

白内障晶状体核蛋白质组学的初步研究

目的研究年龄相关性白内障晶状体核不同组分晶状体蛋白的组成。方法取12例年龄相关性白内障晶状体软核,提取晶状体核中的水溶性蛋白及尿溶性蛋白进行二维电泳及UPD-蛋白质染料染色试剂盒对凝胶染色后,用Image Master2D Platinum6.0软件对获得的蛋白图谱进行分析,再利用MALDI-TOF MS分析及数据库搜索对差异表达的蛋白质点进行鉴定。结果二维电泳结果显示,年龄相关性白内障晶状体核中水溶性蛋白和尿溶性蛋白大部分为相对分子质量14400~97400,pI5~9。高丰度蛋白质斑点相对分子质量分布在20000~31000,pI6~8区域内。年龄相关性白内障晶状体核水溶性蛋白二维电泳图识别出31个蛋白质斑点,尿溶性蛋白二维电泳图识别出26个蛋白质斑点,相差2倍以上表达的差异点有14个。对选取的蛋白质斑点进行MALDI-TOF MS分析,经数据库检索后鉴定出6种蛋白质,其中3种蛋白质表达下调（γS-晶状体蛋白、βA3-晶状体蛋白、βA4-晶状体蛋白）,1种蛋白质表达上调（βB1-晶状体蛋白）,2种蛋白质表达缺失（截取的人βB1-晶状体蛋白A链、截取的人γD-晶状体蛋白X链）。结论年龄相关性白内障晶状体核不同组分晶状体蛋白中主要由β-晶状体蛋白组成,与尿溶性晶状体蛋白相比,水溶性蛋白鉴定出γD-晶状体蛋白,而βA4-晶状体蛋白阙如。     

大鼠出生后发育过程中视网膜Nogo受体蛋白表达的研究

目的 观察Nogo受体（NgR）蛋白在大鼠出生后发育过程中视网膜上的表达及其意义。 方法 使用免疫荧光组织化学技术及激光共聚焦显微镜观察48只大鼠出生后0、3、7、14、21、35、49、63 d视网膜NgR蛋白的表达情况。每组6只大鼠。 结果 NgR蛋白在出生后整个发育过程中的大鼠视网膜上表达均为阳性，荧光染色位于细胞膜及突起。 结论 NgR蛋白的阳性表达提示髓磷脂蛋白抑制因子和NgR之间的相互作用对神经元塑形的过程可能不仅是抑制作用，而是促进和抑制双向作用，从而达到对神经元塑形过程的调控。     

正常成年人中心固视点的微视野检测

目的 观察正常成年人中心固视点相对于眼底视盘的位置关系，以及固视稳定性的特点。方法 应用MP-1微视野计对60位正常成年人的120只眼作固视检查，测量中心固视点相对于视盘的坐标位置，并对中心固视点与年龄和屈光度作相关分析，对双眼的差距作t检验。 结果 正常成年人中心固视点距离视盘颞侧边中点的水平距离为14.48°±1.85°，垂直距离为－2.14°±1.26°，90%分布在一个二维正态椭圆内；固视目标时，眼位处于一种不断的微动状态，水平和垂直方向活动度的中位数分别是0.4°和0.3°。 结论 正常成年人中心固视点的分布特征为一个二维正态椭圆，固视目标时眼位在水平方向的移动大于垂直方向的移动幅度。     

地塞米松及Lat—A对人眼小梁细胞蛋白质表达的影响

目的探讨地塞米松（Dex）及latrunculin—A（Lat-A）处理后人眼小梁细胞蛋白质表达的变化。方法正常供体人眼小梁细胞培养后用Dex及Lat—A处理,经二维凝胶电泳分离小梁细胞蛋白质,分析凝胶电泳图谱,选取部分差异凝胶斑点并采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI—TOFMS）鉴定蛋白质。结果采用24cm IPG胶条获得正常人眼小梁细胞对照组、Dex组、Dex＋Lat—A组以及Lat—A组的二维电泳凝胶图谱,得出不同培养条件下人眼小梁细胞蛋白质表达的差异。应用GDPi MALDI—TOFMS得出不同培养条件下差异表达的蛋白质斑点并成功鉴定出其中的24种蛋白质,主要包括细胞骨架相关的蛋白、热休克蛋白、氧化还原相关的蛋白和糖代谢相关的蛋白4类蛋白质。ADLH和Rab蛋白在Lat—A组的人小梁细胞中表达增加,但在Dex组表达减少,而热休克蛋白27（HSP27）和人CRMP2呈现相反的结果。结论成功建立Dex及Lat—A诱导人眼小梁细胞蛋白质表达图谱。Dex及Lat—A能诱导人眼小梁细胞的蛋白质表达变化,可能与青光眼致病的分子机制相关。     

整合素连接激酶对人视网膜色素上皮细胞增殖和迁移的影响

目的:探讨RNA干扰抑制整合素连接激酶（integrin-linked kinase, ILK）对人视网膜色素上皮（human retinal pigment epithelium,hRPE）细胞增殖和迁移的影响。方法:体外培养hRPE细胞,设计并合成特异性人ILK的RNA干扰片段,阳离子脂质体转染入人视网膜色素上皮细胞,利用RT-PCR及Western blot半定量检测siRNA对ILK基因及蛋白表达的抑制作用,MTT方法检测转染前后siRNA对细胞增殖的抑制作用。损伤愈合实验和Transwell实验观察人视网膜色素上皮细胞迁移能力的改变。结果:培养的hRPE细胞存在ILK的基因转录表达,siRNA显著抑制hRPE细胞ILK的mRNA和蛋白表达（P<0.01）。MTT、损伤愈合实验和Transwell实验提示转染ILK-siRNA后人视网膜色素上皮细胞的增殖、迁移能力有明显下降,与正常对照组相比有统计学差异（P<0.05）。结论:特异性ILK-siRNA能有效抑制ILK在hRPE的mRNA和蛋白的表达并显著降低hRPE的增殖和迁移能力。     

猪视网膜色素上皮细胞间连接与通讯功能的关系

目的：探讨体外培养的猪视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞间连接与通讯功能的关系。 方法：用5，6-碳氧荧光素醋酸盐进行细胞染色，光淬灭某些细胞中的荧光分子，激光扫描共聚焦显微镜观察不同连接状态的RPE细胞内的荧光恢复速率，评价缝隙连接的通讯功能。 结果：光漂白后的ＲＰＥ细胞中的荧光强度得以恢复，与之紧密相连的细胞则有荧光下降，分别与1, 2, 3个细胞相连的每分钟荧光恢复速率依次是1.997±0.665，4.378±0.811，8.736±2.084。 结论：体外培养的猪RPE细胞缝隙连接通讯功能的强弱与细胞的连接状况有关。 (中华眼底病杂志,1998,14:41-42)     

缺氧对人视网膜色素上皮细胞蛋白质表达的影响

目的 为揭示缺氧对视网膜色素上皮(RPE)细胞的影响及与脉络膜新生血管(CNV)生成的关系提供实验依据.方法 实验研究.分别从对数生长期的正常及缺氧状态人RPE细胞中提取蛋白样本后行等电聚焦电泳(IEF),随后采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行第二次分离.采用考马斯亮蓝染色法对凝胶进行显色固定,Image Master 2D Elite软件行分析配比,筛选出正常和缺氧RPE细胞表达明显差异的蛋白质斑点,随机选取差异斑点进行质谱分析,数据经蛋白质组数据库检索得出蒡异表达蛋白.结果 正常组分离蛋白斑点578个,组内匹配率92.90%;缺氧组559个,匹配率91.41%;两组间蛋白斑点匹配率为85.47%.发现volume值改变超过2倍的点共92个,其中32个点表达卜调,60个点表达下调.选择7个蛋白斑点行质谱分析,成功鉴定5种差异表达蛋白质(3个斑点为相同的蛋白):表达上调为热休克蛋白70、热休克蛋白60;表达下调的为β肌动蛋白、β微管蛋白以及过氧化还原蛋白3.结论 缺氧状态下RPE细胞表达差异蛋白可引起细胞应激能力明显增强,而主要细胞骨架蛋白下调,细胞维持形态、保持内部结构有序性的能力下降;本研究首次发现人RPE细胞在缺氧状态下热休克蛋白60表达上调,此蛋白的进一步研究可能能够发现新的CNV致病途径;蛋白质组学方法为CNV相关疾病的研究提供了-个很好的参考平台.     

Effect of EGb761 on light-damaged retinal pigment epithelial cells

AIM:To investigate the protective mechanism of Gingko Biloba extract (EGb761) on the ability of retinal pigment epithelial (RPE) cells to resist light-induced damage in a comparative proteomics study.METHODS:Human RPE cells (ARPE-19) were randomly distributed to one of three groups:normal control (NC group) and light-damaged model without or with EGb761 group (M and ME groups, respectively). The light-damaged model was formed by exposing to white light (2 200±300)lx for 6h. The RPE cells in ME group were conducted with EGb 761 (100μg/mL) before light exposure. The soluble cellular proteins extracting from each groups were separated by two-dimensional electrophoresis and stained by silver staining. Different proteins in the profiles of the gels were analyzed by Image Master Software. Two-fold expressing protein spots were identified by Matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) mass spectrometry.RESULTS: NC, M and ME groups displayed 1 892±71, 2 145±23 and 2 216±85 protein spots, respectively. We identified 33 proteins with different expression levels between the NC and M groups, 25 proteins between the M and ME groups, and 11 proteins between the NC and ME groups. MALDI-TOF/TOF mass spectrometry successfully identified 16 proteins, including metabolic enzymes, cytoskeletal proteins, anti-oxidation proteins, and others.CONCLUSION:Differences in some important proteins, such as cathepsin B, heat shock protein, and cytochrome creductase, indicated that multiple pathways may be induced in light-damaged RPE cells and the protective effect of EGb761.     

体外光动力疗法致血管内皮细胞和视网膜色素上皮细胞凋亡的研究

目的 研究体外光动力疗法（PDT）诱导的血管内皮细胞和视网膜色素上皮（RPE）细胞凋亡情况。 方法 将体外培养的血管内皮细胞和人RPE细胞与血药浓度（1.0 μg/ml）相当的光敏剂verteporfin共同孵育，根据孵育时间的不同，每种细胞分成6组：0、5、15、30、60、120 min组。孵育至上述时间后，分别用光敏剂最大吸收波长光照（689 nm、功率密度为600 mW/cm2的二极管激光），能量密度为2.4 J/cm2，光照时间为83 s。用流式细胞仪检测3 h后各组细胞凋亡比例，实验重复进行3次。 结果 PDT后3 h，血管内皮细胞在6组的凋亡比例分别为：0.01±0.01、0.25±0.02、0.32±0.02、0.41±0.04、0.49±0.03和0.61±0.02；RPE细胞各组的凋亡比例分别为：0.02±0.01、0.22±0.01、0.31±0.02、0.38±0.03、0.47±0.05和0.58±0.03；两种细胞的凋亡比例均随细胞与光敏剂孵育时间的延长而增加；两种细胞在相同时间组的凋亡比例经t检验差异均无统计学意义(P>0.05)。 结论 PDT可致RPE细胞和血管内皮细胞快速凋亡，在相同的体外环境下，PDT对两种细胞所诱导的凋亡反应无明显选择性。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 253-255)     

Comparative proteome analysis of native differentiated and cultured dedifferentiated human RPE cells

PURPOSE: Dedifferentiation of retinal pigment epithelial (RPE) cells is a crucial event in the pathogenesis of proliferative vitreoretinopathy (PVR). This study was designed to improve the understanding of RPE cell dedifferentiation in vitro. The protein expression pattern of native differentiated RPE cells was compared with that of cultured, thereby dedifferentiated, RPE cells. METHODS: Differentiated native human RPE cells and monolayers of dedifferentiated cultured primary human RPE cells were processed for two-dimensional (2-D) electrophoresis. Total cellular proteins were separated by isoelectric focusing using immobilized pH gradients (IPG 3-10) and electrophoresis on 9% to 15% gradient polyacrylamide gels. Proteins were visualized by silver staining. Silver-stained gel spots were excised, digested in situ, and analyzed by matrix-assisted laser desorption ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectroscopy (MS). The resultant peptide mass fingerprints were searched against the public domain NCBInr, MSDB, and EnsemblC databases to identify the respective proteins. RESULTS: One hundred seventy nine protein spots were analyzed and classified into functional categories. Proteins associated with highly specialized functions of the RPE, which are required for interaction with photoreceptor cells, including RPE65, cellular retinaldehyde-binding protein (CRALBP), and cellular retinol-binding protein (CRBP), were absent in dedifferentiated cultured RPE cells, whereas proteins involved in phagocytosis and exocytosis, including cathepsin D and clathrin were still present. Dedifferentiated RPE cells displayed a strong shift toward increased expression of proteins associated with cell shape, cell adhesion, and stress fiber formation, including cytokeratin 19, gelsolin, and tropomyosins, and also acquired increased expression of factors involved in translation and tumorigenic signal transduction such as annexin I and translation initiation factor (eIF)-5A. CONCLUSIONS: Dedifferentiation of human RPE cells in vitro results in downregulation of proteins associated with highly specialized functions of the RPE and induces the differential expression of proteins related to cytoskeleton organization, cell shape, cell migration, and mediation of proliferative signal transduction. These in vitro data suggest that the dedifferentiated status of RPE cells per se may initiate PVR. Further investigation of candidate proteins may identify additional targets for treatment or prevention of diseases associated with RPE dedifferentiation.     

低氧/高糖环境下间充质干细胞对RPE生物学特性的影响

目的：建立人骨髓间充质干细胞( hMSCs)与视网膜色素上皮细胞( RPE)低氧高糖培养的细胞共培养模型,研究在与hMSCs共培养条件下低氧及高糖时RPE细胞增殖、凋亡和移行等生物学特征的影响,对糖尿病刺激脉络膜新生血管( CNV)的机制进行初步探讨。
　　方法：使用Transwell间接共培养模型。将共培养模型按照培养氧浓度及糖浓度培养基类型分为4组：常氧常糖组(21% O2加5.56mmol/L葡萄糖培养液,A组)、常氧高糖组(21% O2加30mmol/L葡萄糖培养液,B组)、低氧常糖组(5% O2加5.56mmol/L葡萄糖培养液,C组)和低氧高糖组(5% O2加30mmol/L 葡萄糖培养液,D 组)。通过CCK-8检测间接共培养模型在12,24,48 h时RPE细胞的增殖能力、Transwell 检测间接共培养模型在24 h 时 RPE细胞的移行情况、流式细胞仪检测间接共培养模型中24 h时RPE细胞的凋亡情况。
　　结果：与对照组相比,12,24和48 h时, B组(1.61±0.41,1.80±0.34,1.91±0.35)、C 组(1.34±0.46,1.94±0.40,2.14±0.41)及D组(1.98±0.47,2.26±0.42,2.55±0.40)中的细胞增殖能力均较对照组(0.92±0.45,1.27±0.32,1.59±0.41)增强(P<0.05),并且低氧高糖联合作用组增殖能力最强。在24h时,B 组(149.5±9.19)、C 组(140±9.90)、D组(170.5±7.78)较对照组(114.5±7.78)的RPE
　　细胞移行能力增强(P<0.05)。而在24h时各组间的凋亡情况无明显差异(P>0.05)。
　　结论：与hMSCs共培养条件下,低氧及高糖环境促进RPE细胞的增殖和移行,而对其凋亡并无影响。